Uvod u gasnu

hromatografija
Gasna hromatografija je fizičko-
hemijska metoda za
razdvajanje komponenata
smeše na povišenoj
temperaturi.
• Pokretna faza je inertni
gas,najčešće azot ili helijum
• Nepokretna faza je tečnost
ili čvrsto telo.
Prema tome razlikujemo dve vrste
gasne hromatografije:
a) gasna – adsorpciona
hromatografija
(GSC - Gas-Solid
Chromatography)
b) gasna podeona ili gasno-
tečna hromatografija (GLC- Gas-
Liquid Chromatography)
 GSC-nepokretnu fazu čini aktivni
čvrsti adsorbens

GLC- nepokretnu fazu teško

isparljivu tečnost koja je
raspoređena preko površine čvrstog
nosača.
 Gasna hromatografija je
tehnika izbora za komponente
koje lako isparavaju i koje se
ne razgrađuju na visokoj
temperaturi.
Mehanizam razdvajanja jedinjenja
iz smeše zasniva se na podeonom
mehanizmu između stacionarne
faze, koja je tečnost sa visokom
tačkom ključanja naneta u tankom
sloju na čvrst inertni nosač (celit,
dijatomejska zemlja, silika gel) i
inertnog nosećeg gasa.
Mehanizam razdvajanja u gasnoj
hromatografiji
Shema razdvajanja u gasnoj
hromatografiji
Gasni hromatograf
Shema gasnog hromatografa
Aparatura
Aparatura za izvođenje gasne
hromatografije se sastoji iz više delova:.
1. Boca sa nosećim gasom
2. Uređaj za podešavanje pritiska
3. Uređaj za merenje pritiska
4. Injektor
5. Kolona
6. Detektor sa pojačivačem
7. Uređaj za merenje brzine protoka
kroz kolonu
8. Pisač ili neki drugi sistem za
registrovanje električnog signala
Uređaj za podešavanje pritiska
gasova
 Injektor
Mesto gde se ubacuje izorak.
Uzorak mora biti u tečnoj ili gasnoj fazi.
 Injektor je metalni blok, posebno
konstruisan, postavljen je na ulazu u
kolonu i uvek je na povišenoj
temperaturi koja se kreće oko 270°C.
Uneta zapremina uzorka, zbog visoke
temperature u injekcionom bloku,
trenutno isparava i prelazi u gasovito
stanje i ulazi u kolonu.
 Injektovanje se izvodi posebnim
špricevima sa zapreminom do 10 μL.
Tečni uzorci se unose pomoću
injekcione igle kroz gumenu
membranu.
Gasni uzorci se mogu unositi pomoću
injekcione igle ili automatski preko
autosemplera.
Unošenje uzorka
 Kolone
Kolona predstavlja najvažniji deo
hromatografskog sistema, jer se u njoj
vrši razdvajanje analizirane smeše.
Kolone se prave od metalnih, staklenih
ili plastičnih cevi odgovarajuće dužine i
prečnika u kojima se nalazi
odgovarajući adsorbens.
Kolone mogu biti prave, savijene ili
spiralne.
 Postoje dve vrste kolona:

Punjene ili analitičke, dužine 2 m,

prečnika 3-8 mm, napunjene
inertnim nosačem koji je prevučen
tečnom fazom.
Kao nosač se koristi inertan materijal
sa velikom površinom. Tečna faza je
odgovorna za razdvajanje
komponenata, pa su njene fizičke i
hemijske osobine od velikog značaja.
Kapilarne kolone su cevi dužine
od 25 m do nekoliko stotina
metara, prečnika 0.1- 0.5 mm u
kojima se tečna faza nalazi u
obliku tankog filma nanesenog
sa unutrašnje strane dok je
sredina kapilare slobodna za
prolaz gasa nosača.
Shema kolona u gasnoj hromatogtafiji
Mesto kolone u hromatogrfu (peć)
Povezivanje kolone sa injektorom i
detektorom
 Kod lekova, gde postoje funkcionalne
grupe kao što su H, OH, O, COH i koje
imaju slabu isparljivost, ona se
poboljšava stvaranjem derivata koji
će omogućiti bolju isparljivost, a time
i omogućiti bolju analizu na GC.
Sredstvo koje se najčešće koristi za
derivatizaciju je BSTFA-
Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamid
 Faktori koji utiču na dobro
razdvajanje supstanci vezani za kolonu
su:

• izbor nosača
• vrsta tečnosti naneta kao tanak
film
• način punjenja kolone
• dimenzije kolone
Čvrst nosač ne sme reagovati
sa tečnim slojem kao ni sa
supstancom koja se razdvaja
pri visokim temperaturama.
Debljina filma nanetog tečnog
sloja je značajan faktor za
razdvajanje supstanci.
 Prema funkcionalnim grupama
organskih jedinjenja formirane su i
različite stacionarne faze.
Tako postoje stacionarne faze na
kojima se dobro razdvajaju alkoholi,
masne kiseline, fenoli, nitro
jedinjenja, primarni i sekundarni
amini, dok se na drugima razdvajaju
lekovi, droge, pesticidi itd.
Postoje dva načina rada gasnog
hromatografa.

• Izotermski rad i

• Temperaturni program
 Izotermski proces se zove onda kada
se temperatura kolone ne menja tokom
razdvajanja supstance.

Temperaturni program podrazumeva

menjanje temperature u
odgovarajućem opsegu tokom
razdvajanja supstanci.
Ovakav način se koristi kod složenih
više komponentnih smeša gde se
isparljivost jedinjenja znatno razlikuje.
 Detektori
Uređaji za registrovanje eluiranih
komponenti iz kolone.

Postoje detektori sa različitim principima

rada. Najčešće korišćeni su:

• Plameno jonizujući -FID

• Azot-fosfor - NPD
• Hvatač elektrona - ECD
 Oni rade na principu električne
provodljivosti koja je direktno
proporcionalna koncentraciji
naelektrisanih čestica u nosećem
gasu.
Gas nosilač prolazi kroz izvor
jonizacije koji jonizuje prisutne
molekule. Tako nastali joni (pozitivni
ili negativni) izazivaju stvaranje
struje.
Kada između elektroda prolazi čist gas
nosač, koncentracija naelektrisanih
čestica je konstantna, što stvara
konstantnu struju
Shema jonizujućih detektora
Flame ionisation detector
FID
Shema NP i EC detektora
 Kada gas koji izlazi iz kolone nosi neko
razdvojeno hemijsko jedinjenje ono će
se jonizovati u detektoru usled čega se
povećava broj naelektrisnih čestica,
pojačava se struja, a smanjuje vrednost
otpora.
Ovakvo smanjenje otpora u otporniku
dozvoljava protok struje koja posle
pojačanja daje signal koji se registruje
kao pik na pisaču.
Hromatogram
Hromatogram
1. Bazna linija
2. Hromatogram sa tri razdvojena jedinjenja

1 2
 Dobijeni zapis se zove
hromatogram.
Oštri pikovi na hromatogramu
predstavljaju neko jedinjenje koje
je razdvojeno na koloni i
detektovano u detekltoru.
Identifikacija jedinjenja se vrši
prema odgovarajućoj
propuštenoj standardnoj
supstanci pod istim uslovima i na
osnovu izračunatih retencionih
vremena (Rt).
 Retenciono vreme jednog
jedinjenja se meri od trenutka
injiciranja u aparat, odnosno
početka zapisa na hromatogramu ,
pa do vrha pika.
Retenciono vreme je vreme
koje je potrebno da se
jedno jedinjenje izdvoji iz
ispitivane smeše i stigne do
detektora, posle čega se
beleži pisačem u obliku pika.
Hromatogrami
 Uzorci biološkog materijala se
pripremaju postupkom ekstrakcije,
bazne ili kisele, što zavisi od jedinjenja
koje se ispituje.
Pored pripreme uzorka, potrebno je
pripremati odgovarajuće standardne
rastvore u koncentracijama bliskim
onim koje se očekuju u ispitivanom
materijalu.
 Standardni uzorci

Standardni uzorci se mogu

koristiti kao:
1. Eksterni i
2. Interni standard
 Eksterni standard
Koristi se za:
• Potvrdu retencionog vremena i
•Kvantifikaciju ispitivane sustance
Pripremaju se u odgovarajućim
koncentracijama bliskim
koncentracijama ispitivane supstance
Serijom razblaženja osnovnog rastvora
pravi se kalibraciona kriva.
 Interni standard
To je supstanca koja se dodaje u svaki
ispitivani uzorak, pa i u seriju standardnih
rastvora pri izradi kalibracione krive.
Za interni standard se bira jedinjenje koje
ima vrlo slično hromatogrfasko ponašanje
kao i ispitivana supstanca.
Koristi se za:
• Poboljšanje preciznosti i
• Kvantifikaciju
Istovremeno sa analiziranim uzorkom radi
se opterećeni serum, plazma ili urin.
Opterećeni serum, plazma ili urin se
dobijaju kada se u pool serum, plazmu ili
urin doda tačna koncentracija traženog
jedinjenja i zatim se sa takvim uzorkom
prođe celokupni proces ekstrakcije koji
se primenjuje za rad analize.
 Na taj način se kontroliše
uspešnost, sigurnost i
preciznost ekstrakcije,
pravilan rad i hromatografski
uslovi.
Injektovanje “headspace”
tehnikom
Šema gasnog hromatograma sa
spektrometrijskim detektorom