ELEKTROFOREZ

• DNA, RNA, protein moleküllerinin birbirinden

ayrılması

• Nükleik asit ve proteinler gibi makro

moleküllerin elektriksel bir alanda sahip oldukları
elektrik yüküne göre hareket

• DNA negatif elektrik yükü

• Negatif yüklü moleküllerpozitif elektroda

pozitif yüklü moleküller negatif elektroda
• Elektriksel alanda göç hızları
– Elektriksel alanın şiddetine
– Moleküllerin net yüküne
– Moleküllerin şekline
– Hareket ettikleri ortamın iyonik şiddetine
– Ortamın viskozitesine
– Sıcaklığa bağlıdır

• Elektroforezde hareketli & hareketsiz faz

– Sabit faz kağıt, asetat, selüloz, poliakrilamid,
agaroz gibi dolgu maddeleri
– Hareketli faz  elektrik akımı
Sabit faz(jel)DNA’nın
pozitif elektroda
ulaşmak için
geçtiği porlar ağı
• Proteinler farklı yüke sahiptir
– Boyut, yük, hidrofobiklik
– Aynı kütle:yük oranına sahip, ancak farklı boyutlarda
ki molekül karışımlarının ayrıştırılması

• Moleküler biyolojide kullanılan 2 tip jel

– Agaroz jelleri DNA & RNA
– Poliakrilamid jelleri  Protein
1. SDS PAGE ( denatüre edici page)
2. ND-PAGE( non denatüre edici page )
 AGAROZ JELLERİ
• Agarozpolisakkarit
• Sıcak suda çözünür & soğutulduğu zaman polimerde
karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur
• Agaroz konsantrasyonu por çapı
– küçük DNA fragmentleriyüksek
– büyük DNA fragmentleri düşük agaroz knst.
Jel %     Uzunluk Nükleotid (bp)
0.6      1.000-20.000
0.7      800-10.000
0.9      500-7.000
1.2      400-6.000
1.5      200-3.000
2.0      100-2.000
 Agaroz Jel Elektroforezi
• Güç Kaynağıelektrotlar arası her cm < 5Volt
• DNA’nın jelde görünmesietidyum bromür (0.1
ug / mL) & UV
•
 Poliakrilamid Jel Elektroforezi
• Jel akrilamid & akrilamid türevi olan N-N'-
metilen bisakrilamid

• Jel yüzdesiakrilamidin total yüzdesipor çapı

– Düşük yüzdeli jeller büyük gözenek çapına
– Büyük yüzdeli jeller küçük gözenek çapına sahiptir

• Polimerleşme derecesi;
– Sıcaklık, pH, amonyum per sulfat (APS) ve
N,N,N',N'- tetrametil-etilendiamin ( TEMED)
• Akrilamid Bisakrilamid

• APS TEMED

• Polimerleşme için serbest radikal oluşumuna sebep

olan APS reaksiyon başlatıcı
• TEMEDkatalizör
(Sodium Dodecyl Sulphate)SDS PAGE
• Proteinlerin saflığının kontrolü, molekül
ağırlıklarının saptanması, fraksiyonlama, saf
protein alt yapısının incelenmesi

– SDSAnyonik deterjandır, peptit zincirine bağlanarak

alt birimleri biribirinden ayırır ve (-) yük taşıdığından
peptitlere (-) yük kazandırır (1.4 g SDS / g polipeptid)

– MerkaptoetanolProteinin disülfit bağlarını indirger

– Brom fenol Blueİyonize olan boyadır, izleme

– Sükroz veya GliserolYoğunluk kazandırır

 Protein separating gel
Loading slot

Low % Acrylamide Stacking Gel

High % Acrylamide Separating Gel

SDS PAGE Saflaştırma
1. Complete mix of proteins
2. High Salt
3. Ion exchange
4. Gel-filtration
5. Affinity
her örnekten 10ug yüklenmiştir

Boyama
•Coomasi Brilliant Blue
 ND PAGE ( non denature edici/native page)
• Proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu
ajanlar kullanmaz
• Direk olarak saflaştırma işlemi
• Kütleye bağlı ayırım
• Hareket proteinin yüküne hidrodinamik size
bağlıdır
– Karmaşık konformasyonyüksek hareket
– Oligomer gibi büyük yapılaryavaş hareket
• İnsan eritropoietin
proteini
Native jel
• Kimyasal
degredasyondan dolayı
yük dağılımının
değişimini
• Katlanmamış veya diğer
modifiye
konformasyonları
• Oligomer ve
agregasyonları
• Bağlanma olayları
 İZOELEKTRİK FOKUSLAMA
• Proteinlerin bir pH gradientinde izoelektrik
noktaları izoelektrik
fokusing jel
• Sentetik poliamino-polikarboksilik asitlerin
karışımları olan amfoterik bileşikleri içeren 10
jel polimerleştirilir
• AkımpH gradient
pH
• Asidikanoda; Bazikkatoda
Katot (-) Anot(+)
- + 4
pH 10 pH 4
• Örnek proteinler jele uygulanır, yüklerine göre
anoda ve katoda doğru hareket
• Net yüklerinin sıfır olduğu pH değerine ( pI ) kadar göç ederler
 Pulse-Field Jel Elektroforezi
• Agaroz
• Aşırı büyük DNA ayrımı
• Elektrik alanın yönü periyodik olarak değişir
• > 50-100 kb DNA & elektrik alanın yönü aynı 
hareket hızı aynı
• Küçük DNA molekülleriçabuk adapte & hızlı
hareket ederken ; Büyük DNA yavaş
• Bakteri veya maya kromozomunun tamamı farklı
bantlara ayrılabilir
 Restriktion enzimi ile
kesilen E. coli DNA’sı
yürütülmüş ve bilinen
türlerle karşılaştırılmıştır
• DNA "Fingerprint"
 İKİ YÖNLÜ (2D) JEL ELEKTROFOREZİ
1)Yüke bağımlı bir
ayırma yöntemi olan
IEF
+
2)Boyuta bağlı SDS-
poliakrilamid jel
elektroforezi

• En gelişmiş analitik
metottur
Çeşitli genlerden ekspres olan 1000 kadar protein
aynı anda çalışılabilmekte ve hücresel ayırım
yapılabilmektedir

Kontrol Örnek

mouse cardiac; 250 g loading; pH 3-10 IEF strips; 12.5% SDS-PAGE;

 ELEKTROFOREZİ ETKİLEYEN ŞARTLAR

• DNA’nın Moleküler Ağırlığı

• DNA’nın Konformasyonu
• Agaroz Konsantrasyonu
• Voltaj
• Elektrik Alanın Yönü
• BoyalarınVarlığı
• Elektroforez Yürütme Tamponunun Yapısı