PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG

THUỐC KHÁNG SINH

SULFONAMIDE VÀ
QUINOLONE TRONG
SỮA BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Giảng viên hướng dẫn:
TS. Nguyễn Kim Diễm Mai
Nhóm: Nevertheless
1
 TÓM TẮT
Quy trình, Hoá
01 Tổng quan 04 chất và dụng cụ

02 Mục tiêu 05 Nội dung nghiên cứu

03 Phương pháp
nghiên cứu
06 Phạm vi, kế hoạch
nghiên cứu

2
1.1. TỔNG QUAN VỀ
SULFONAMIDE

KHÁI NIỆM

CƠ CHẾ VÀ CÔNG
DỤNG CỦA HỢP
CHẤT

MỘT SỐ THÔNG
TIN THÊM

3
 KHÁI NIỆM SULFONAMIDE

Sulfonamide, còn được gọi là

thuốc sulfa, là các dẫn xuất của
sulfanilamide (p-
aminobenzenesulfonamide), .
Sulfonamide được sử dụng phổ
biến trong việc sản xuất dược
liệu cho cả con người và thú y.
Khung sulfonamide và một số hợp chất phổ biến

4
 CƠ CHẾ

Cơ chế hoạt động: dựa trên sự ức chế chuyển

đổi p-aminobenzoic acid, làm gián đoạn quá
trình vi khuẩn sử dụng hợp chất này để tổng
hợp folic acid, purine, và DNA.

5
CÔNG DỤNG CỦA CÁC HỢP CHẤT
Những hợp chất của chúng dùng để điều trị
nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng tai,
viêm phế quản, viêm màng não do vi khuẩn,
nhiễm trùng mắt, viêm phổi carinii, và một số
loại nhiễm trùng khác

6
 MỘT SỐ THÔNG TIN THÊM

FDA đã khảo sát toàn quốc

45% mẫu sữa thu thập
được xác định có chứa dư
lượng sulfamethazine.
Tiến
  hành khảo sát 30 mẫu
sữa ở Canada dư lượng
sulfamethazine trong hai
mẫu ở mức 11.40 và 5.24
ppb.
Báo cáo từ NCTR cho thấy Ảnh hưởng:
+ Dẫn đến dị ứng hoặc gây
sulfamethazine được xác độc cho người tiêu thụ
+ Thúc đẩy sự xuất hiện của
định là tác nhân gây ung các vi khuẩn kháng kháng
sinh.
thư.
.

7
1.2. TỔNG QUAN VỀ
QUINOLONE

KHÁI NIỆM

CƠ CHẾ

MỘT SỐ THÔNG TIN

THÊM

8
 KHÁI NIỆM

Kháng khuẩn quinolone được

định nghĩa là 1-substitued-1,4-
dihydro-4-oxo-3-
pyridinecarboxylic acids và có
vòng ở vị trí số 5,6.

9
 CƠ CHẾ

• Quinolones ức chế sự sao chép DNA của vi khuẩn bằng

cách ngăn chặn miền ligase của gyrase DNA vi khuẩn.
• Những enzyme này thường cắt chuỗi xoắn kép của DNA,
đưa một phần khác của sợi qua khoảng trống, sau đó
hàn gắn vết cắt. Nhưng quinolone liên kết với các enzym,
ngăn không cho chúng hàn gắn các vết cắt.

10
MỘT SỐ THÔNG TIN THÊM
FDA yêu cầu thay đổi
• Ảnh hưởng đến môi
nhãn an toàn đối với
trường vi sinh của
một loại kháng sinh
đất.
fluoroquinolones để
tăng cường cảnh báo • Ô nhiễm nước thải.

về nguy cơ tác dụng • Ảnh hưởng đến hệ

phụ đối với sức khỏe thực vật và động vật
tâm thần và rối loạn trong đất.
đường huyết nghiêm
trọng.

11
 1.3.1. HPLC DÙNG CHO
ĐỊNH LƯỢNG SULFONAMIDE
Combs và cộng sự dùng HPLC pha đảo, kết
hợp hệ thống ion hoá áp suất khí quyển –
khối phổ (APCI-MS) để xác định hàm lượng
8 loại sulfonamide trong gan gà
Tolika và cộng sự đã áp dụng đầu dò
Diode Array (PDA) cho hệ thống HPLC để
xác định dư lượng 10 sulfonamide trong
sữa

1999 2011

1990 2000

Long và cộng sự dùng sắc ký lỏng pha đảo
với cột ODS-C18 để xác định hàm lượng của
sulfathiazole, sulfadiazine, sulfamethizole,
sulfamethoxazole, sunfisoxazole, và
sulfadimethoxine trong sữa
Naoto Furusawa dùng HPLC với đầu dò
diode quang để xác định dư lượng của
sulfamethizole và sulfadimethoxine trong
sữa
12
 1.3.2. HPLC DÙNG CHO
ĐỊNH LƯỢNG QUINOLONE
Yorke và Frox định lượng 6 quinolone khác Evaggelopoulou và Samanidou dùng
nhau trong mẫu gà dùng làm thực phẩm HPLC để xác định dư lượng của 7
quinolone khác nhau trong mô cá hồi
Đại Tây Dương
2000 2013

1980 2001

Delepine và cộng sự đã Okerman, Touraki dùng HPLC kết hợp nhiều

định lượng được 9 đầu dò khác nhau (UV/Vis, huỳnh quang
quinolone trong cơ của hoặc máy sắc ký khí-khối phổ (GC-MS)) để
loài heo định lượng được nhiều quinolone hoặc
fluoroquinolone cùng lúc 13
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tách sulfonamide và

Mục tiêu
quinolone từ sữa

Cô lập từng sulfonamide và

quinolone bằng HPLC

Định lượng chúng bằng đầu

dò UV và fluorescene

14
 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 2 3 4
Phương pháp lý luận Phương pháp chuẩn hoá Phương pháp cô lập Phương pháp định lượng

15
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)
Sulfonamide Quinolone
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

pH=4.7
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

AcCN

pH=4.7
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Lớp trên

AcCN
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Lớp trên

10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

n-hexane

AcCN
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Lớp trên

10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới

AcCN
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút

Lớp trên

10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới AcCN

cô đặc, sau đó pha loãng

với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1)
H2O
ly tâm 14000 rpm, 10 phút.
4.1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN Mẫu Sữa
(1g)

1 mL KH2PO4 0.1% (pH = 4.7), 2 phút

Sulfonamide Quinolone
1 mL CCl3CO2H 2.5% (pH = 0.84), 2 phút
10 mL AcCN, ly tâm 4000 rpm, 15 phút 10 mL AcCN, ly tâm 5000 rpm, 20 phút

Lớp trên Lớp trên

10 mL n-hexane 10 mL n-hexane
ly tâm 3500 rpm, 5 phút ly tâm 3500 rpm, 5 phút

Lớp dưới Lớp dưới

cô đặc, sau đó pha loãng cô đặc, sau đó pha loãng

với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1) AcCN với 0.5 mL AcCN : H2O (1:1)
ly tâm 14000 rpm, 10 phút ly tâm 14000 rpm, 10 phút.

Lớp trên Lớp trên

  Lọc nylon 0.2

HPLC Sắc ký đồ
 4.2. HOÁ CHẤT VÀ DỤNG CỤ
Hoá chất Dụng cụ

- Mẫu sữa phân tích. -  Dụng cụ xử lý mẫu: Bình cầu 250 mL; Cốc thủy
tinh 250 mL, 100 mL; Phễu chiết 100 mL; Ống đong
- Các hoá chất cho quá trình tách chiết và
25 mL; Đũa thủy tinh; Cân điện tử 4 số Satorius AG
HPLC: potassium dihydrophosphate, acetonitrile, n-
Germani CPA3235; Máy khuấy từ gia nhiệt Stone
hexane, trichloroacetic acid, và nước cất.
Staffordshire England ST15OSA; Máy ly tâm; Lọc
- Các hoá chất chuẩn hoá và hiệu chỉnh hệ nylon 2 m.
thống: sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamethazine,
- Cột sắc ký C18 250 mm x 4.6 mm WatersTM.
sulfamethizole, sulfamethoxypyridazine,
sulfamonomethoxine, sulfamethoxazole, - Hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity II LC System
sunfasoxazole, sulfadimethoxine, sulfaquinoxaline, (Phòng Phân tích Trung Tâm, trường Đại học Sư
ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, Phạm TPHCM).
sarafloxacin, oxolinic acid, nalidixic acid và
flumequine.
5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Quy trình tách sulfonamide

và quinolone ra khỏi sữa.
- Sử dụng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) để định
lượng sulfonamide và
quinolone trong sữa.

25
 6.1. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Địa điểm:
- Mẫu sữa lấy tại các siêu
Thời gian: thị ở thành phố Hồ Chí
Tháng 10/2021 đến tháng Minh.
5/2022. - Phòng Phân tích Trung
tâm, trường Đại học Sư
phạm Thành phố Hồ Chí
Minh.

26
 6.2. KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU
STT Công việc thực hiện Sản phẩm Thời gian

1 Xác định đề tài Tên đề tài 1/10/2021 – 5/10/2021

2 Tổng quan tài liệu Cơ sở lí luận và thực tiễn của đề tài 10/2021 – 11/2021

3 Đề xuất các phương pháp thực nghiệm Các phương pháp thực nghiệm

Khảo sát ý kiến chuyên gia về các phương pháp thực 11/2021 – 1/2022
4 Các phương pháp thực nghiệm
nghiệm

5 Thu thập mẫu sữa tại các siêu thị Mẫu sữa
1/2022 – 2/2022
6 Xử lí mẫu sữa Mẫu sữa đã xử lí.

7 Tiến hành khảo sát các đặc trưng của mẫu. Các thông số đặc trưng của mẫu
2/2022 – 3/2022
8 Phân tích, xử lí số liệu, chọn mẫu tối ưu Mẫu tối ưu
Tiến hành phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC
9 Dữ liệu thực nghiệm
đầu dò UV và fluorescene. 3/2022 – 4/2022
10 Phân tích, xử lí số liệu Kết quả thực nghiệm
11 Viết báo cáo Báo cáo tổng kết Tháng 5/2022
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] E. P. Tolika, V. F. Samanidou, and I. N. Papadoyannis, “Development and validation of an HPLC method for the determination of
ten sulfonamide residues in milk according to 2002/657/EC,” Journal of Separation Science, vol. 34, no. 14, pp. 1627–1635, Jul.
2011, doi: 10.1002/JSSC.201100171.
[2] M. J. García-Galán, M. Silvia Díaz-Cruz, and D. Barceló, “Identification and determination of metabolites and degradation
products of sulfonamide antibiotics,” TrAC Trends in Analytical Chemistry, vol. 27, no. 11, pp. 1008–1022, Dec. 2008, doi:
10.1016/J.TRAC.2008.10.001.
[3] V. K. Agarwal, “High-performance liquid chromatographic methods for the determination of sulfonamides in tissue, milk and
eggs,” Journal of Chromatography A, vol. 624, no. 1–2. pp. 411–423, Oct. 30, 1992. doi: 10.1016/0021-9673(92)85692-M.
[4] M. P. Wentland and J. B. Cornett, “Quinolone Antibacterial Agents,” Annual Reports in Medicinal Chemistry, vol. 20, pp. 145–
154, Jan. 1985, doi: 10.1016/S0065-7743(08)61041-6.
[5] J. Marchant, “When antibiotics turn toxic,” Nature, vol. 555, no. 7697, pp. 431–433, Mar. 2018, doi: 10.1038/D41586-018-03267-
5.
[6] D. G. Waller and A. P. Sampson, “Chemotherapy of infections,” in Medical Pharmacology and Therapeutics, 5th ed., W. Derek
and S. Anthony, Eds. Amsterdam: Elsevier, 2018, pp. 581–629. doi: 10.1016/B978-0-7020-7167-6.00051-8.
[7] FDA, “FDA updates warnings for fluoroquinolone antibiotics on risks of mental health and low blood sugar adverse reactions |
FDA,” U. S. Food and Drug Adminstration, Jul. 2018. [Online] Available: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-
updates-warnings-fluoroquinolone-antibiotics-risks-mental-health-and-low-blood-sugar-adverse (accessed Oct. 04, 2021).
[8] L. Riaz et al., “Fluoroquinolones (FQs) in the environment: A review on their abundance, sorption and toxicity in soil,”
Chemosphere, vol. 191, pp. 704–720, Jan. 2018, doi: 10.1016/J.CHEMOSPHERE.2017.10.092.
[9] L. S. Ettre and J. v Hinshaw, “M. S. Tswett, and the Invention of Chromatography: Part I: Life and Early Work (1872–1903),” in
Chapters in the Evolution of Chromatography, London: Imperial College Press, 2008, pp. 49–59. doi: 10.1142/9781860949449_0005.
[10] L. R. Snyder and J. W. Dolan, “Milestones in the Development of Liquid Chromatography,” in Liquid Chromatography:
Fundamentals and Instrumentation, Eds. Amsterdam: Elsevier, 2013, pp. 1–17. doi: 10.1016/B978-0-12-415807-8.00001-8.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
[11] A. R. Long, L. C. Hsieh, M. S. Malbrough, C. R. Short, and S. A. Barker, “Matrix solid phase dispersion (MSPD) extraction and liquid
chromatographic determination of five benzimidazole anthelmintics in pork muscle tissue,” Journal of Food Composition and Analysis, vol.
3, no. 1, pp. 20–26, Mar. 1990, doi: 10.1016/0889-1575(90)90005-7.
[12] M. T. Combs, M. Ashraf-Khorassani, and L. T. Taylor, “HPLC/atmospheric pressure chemical ionization-mass spectroscopy of eight
regulated sulfonamides,” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 19, no. 3–4, pp. 301–308, Mar. 1999, doi:
10.1016/S0731-7085(98)00121-6.
[13] N. Furusawa, “Simplified determining procedure for routine residue monitoring of sulphamethazine and sulphadimethoxine in milk,”
Journal of Chromatography A, vol. 898, no. 2, pp. 185–191, Nov. 2000, doi: 10.1016/S0021-9673(00)00843-8.
[14] B. Delepine, D. Hurtaud-Pessel, and P. Sanders, “Simultaneous determination of six quinolones in pig muscle by liquid
chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry,” Analyst, vol. 123, no. 12, pp. 2743–2747, Jan. 1998, doi:
10.1039/A804911D.
[15] J. C. Yorke and P. Froc, “Quantitation of nine quinolones in chicken tissues by high-performance liquid chromatography with
fluorescence detection,” Journal of chromatography. A, vol. 882, no. 1–2, pp. 63–77, Jun. 2000, doi: 10.1016/S0021-9673(00)00165-5.
[16] L. Okerman, S. Croubels, S. de Baere, J. van Hoof, P. de Backer, and H. de Brabander, “Inhibition tests for detection and
presumptive identification of tetracyclines, beta-lactam antibiotics and quinolones in poultry meat,” Food additives and contaminants, vol.
18, no. 5, pp. 385–393, 2001, doi: 10.1080/02652030120410.
[17] M. Touraki, M. Ladoukakis, and C. Prokopiou, “High-performance liquid chromatographic determination of oxolinic acid and
flumequine in the live fish feed artemia,” Journal of Chromatography B, vol. 751, no. 2, pp. 247–256, Feb. 2001, doi: 10.1016/S0378-
4347(00)00474-6.
[18] J. M. Delmas, A. M. Chapel, and P. Sanders, “Determination of flumequine and 7-hydroxyflumequine in plasma of sheep by high-
performance liquid chromatography,” Journal of chromatography B, vol. 712, no. 1–2, pp. 263–268, Aug. 1998, doi: 10.1016/S0378-
4347(98)00159-5.
[19] E. N. Evaggelopoulou and V. F. Samanidou, “HPLC confirmatory method development for the determination of seven quinolones in
salmon tissue (Salmo salar L.) validated according to the European Union Decision 2002/657/EC,” Food Chemistry, vol. 136, no. 2, pp.
479–484, Jan. 2013, doi: 10.1016/J.FOODCHEM.2012.08.075.
THANK YOU!
SEE YOU SOON

30