Identificación molecular de agentes causales de mastitis en ganado

bovino de las islas Santa Cruz, Floreana e Isabela, provincia de Galápagos.

Ing. Mejía Ortega, Claudia Tamara

DESARROLLO DE UN PROGRAMA DE MANEJO Y CONTROL PARA MASTITIS

BOVINA CON BASE EN LA CONTEXTUALIZACIÓN DEL PROBLEMA EN LA
PROVINCIA DE GALÁPAGOS-ECUADOR.
CV-GNP-0051-2018 : Jorge Ron Román
3

TOMA DE MUESTRAS

CAPACITACION BPO

ENCUESTAS

PRUEBA CMT

“Desarrollo de un programa de control para mastitis bovina con base en la contextualización del problema
en la provincia de Galápagos – Ecuador”
3 “Desarrollo de un programa de control para mastitis bovina con base en la contextualización del problema
en la provincia de Galápagos – Ecuador”

Agencia de Regulación y Control de la Bioseguridad y Cuarentena para Galápagos (ABG)

3 INTRODUCCIÓN
Generalidades de la industria leche en las islas Galápagos

o 10 000 animales
o 1 324 ton/año leche y derivados
UPA; CGREG; MAGAP, (2014)

o 1900 introducción competidor de

pastoreo de especies nativas
CIL, (2015)

o 1997 1° Estudio epidemiológico

Cruz et al., (2016)

o 2012 Línea base de enfermedades:

fiebre aftosa, brucelosis, diarrea viral
bovina, Trypanosoma sp., Babesia sp.
ABG, (2012)

Fuente de imagen:
http://www.carlospi.com/galapagospark/desarrollo_sustentable_agropecuario.html
4 INTRODUCCIÓN
Mastitis Infección de origen multifactorial

células
somáticas

ubres
Agente causal
inflamación

Fernández, (2012)
Mastitis clínica y subclínica
Microbiología Biología molecular
o Staphylococcus aureus
o Escherichia coli
o Bacillus spp.
o Staphylococcus
coagulasa negativos

Passarge,(2007)
Fuente de imagen:
https://razasporcinas.com/pigmarket/producto/guias-practicas-produccion-bovina-mastitis-bovina/
https://www.solomamitis.com/academia-solomamitis/abc-solomamitis/mastitis
5 OBJETIVOS
Objetivo general

Identificar mediante métodos moleculares los agentes causales de mastitis en ganado bovino
de las islas Santa Cruz. Floreana e Isabela, provincia de Galápagos.

Objetivos específicos

Amplificar el gen 16S de los agentes causales de mastitis mediante PCR convencional.

Caracterizar las bacterias causantes de mastitis mediante secuenciación Sanger de los productos de PCR.

Realizar análisis filogenético con los segmentos obtenidos de la secuenciación.

 7 MATERIALES Y MÉTODOS
“Desarrollo de un programa de control para mastitis bovina con base en la contextualización del problema
en la provincia de Galápagos – Ecuador”
Obtención de muestras

Isla n° Fincas n° vacas n° de

muestreadas muestras
Santa 5 6 24
Cruz
24
Isabela 3 3 12
12
Floreana 1 1 1
1
TOTAL 37
Guazha, (2020)

37.83 % positivas para

65 muestras LB
mastitis subclínica

Colonias aisladas
Fuente de la imagen:
https://ekomilks.com/
8 MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción de ADN PCR gen 16S ARNr Electroforesis

Máster Mix

25 μL
o Agua
o Buffer
o Primers
o dNTPs
o Taq Hot Start
o ADN
Gel agarosa 1.5%
Nombre Tamaño
27F 1500 pb
1492R 1500 pb
Promega,(2020)
Koskinen et al., (2009)

Fuente de imagen:
https://www.hettweb.com/products/mikro200/
11 MATERIALES Y MÉTODOS
Secuenciación y análisis bioinformático

1. Secuenciación 2. Ensamblaje 3. BLAST

Macrogen, Inc.

4. Alineamiento 5. Árbol máxima verosimilitud

• 1 000 Bootstraps
• Deleción parcial de gaps

Fuente de imagen:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://genecodes.com/free-download
12 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuantificación e integridad de ADN

Tabla 1. Resultados de concentración y radios de Figura 1. Electroforesis de ADN extraído con kit Wizard de Promega
absorbancia de las 65 muestras

[DNA]
ng/uL
Promedio 243.8 1.99 1.66

Valores de Absorbancia:
o = 1.8 – 2.0 Valores de Concentración de ADN:
o 10 ng / μL
o = 2.0 – 2.2 o Bandas débiles

Integridad de ADN comprometida:

Wilfinger et al., (1997)
o Bandas borrosas y extendidas
Sánchez et al., (2012)
13 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Amplificación del gen ARNr 16S bacteriano por PCR

Figura 2. Amplificación por PCR del gen ARNr 16S del ADN obtenido de aislados
de muestras de leche de ganado bovino de las islas Galápagos.
MP 1 2 5 7 10 13 15 16 17 39 61 97 102 109 131 135 141 150 160 200 C160 CN

Addis et al., (2016); Fukuda et al., (2016)

- MP marcador de peso molecular 1Kb. Carril (1 - 200): productos de PCR.
- Carril C160: Control positivo S. aureus (RNA 16S staph+, nuc+, mecA-, blaZ+), autorizada o 341F y 907R
para su uso por el departamento de Bacteriología de la Universidad de Liège, Bélgica. o 27F y 1492R
- Carril CN control
Esencial en procesos de traducción
14 Árbol de RESULTADOS Y DISCUSIÓN
máxima
56 secuencias
verosimilitud
Staphylococcus haemolyticus
- Oro y Pichincha: 55% Amer et al., (2018)
Oportunistas

- Argentina : Resistencias Srednik et al., (2015)

antibióticos

Staphylococcus equorum
- Egipto: infecciones Yasser et al., (2018)

mixta con S. aureus

Staphylococcus aureus
- Galápagos: 13% Guazha, (2021)
- Bolívar: 55% Andrade & Sánchez, (2018)
- Pichincha: 55% Acuña & Rivadeneira, (2008)
- Napo: 12%
Espinoza & Mier, (2013)
15 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Filograma

Staphylococcus agnetis
- USA: Oportunista Calcutt et al., (2014)
- Finlandia: similar a S. hyicus

Staphylococcus chromogenes
- Oro y Pichincha: 55% Amer et al., (2018)
Oportunistas + S. aureus

- Argentina y Colombia: Srednik et al., (2015)

resistencia antibiótica
 16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Micrococcus luteus
- Pakistán: mastitis en búfalos Baloch et al., (2011)

Macrococcus caseolyticus
Macrococcus bohemicus
- Suiza: gen mecD resistencia (Schwendener et al., 2017)

Bacillus licheniformis
Guazha, (2020) Bacillus subtilis
- Bolívar y El Oro: 21 % Navarrete, (2019); Amer et al., (2018)
35% Bacillus sp.
Bacillus megaterium
- Sudán e India: 2% Mukesh et al., (2019)
17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Lactococcus garvieae
Rothia terrae
- Oportunistas mínimos Rodrigues et al., (2016)
mastitis en rumiantes

Arthrobacter gandavensis
- Bélgica: se desconoce su papel Storms et al., (2003)
infección mixta

Cellulomona flavigena
18 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Pseudomonas putida
- USA: ambientales Almeida, (2016)

Escherichia coli
- Ecuador: ambientales Amer et al., (2018); Bonifaz & Conlago, (2016);
Navarrete, (2019); Espinoza & Mier, (2013)

Enterobacter tabaci
Enterobacter cloacae
- provincia de Bolívar: 2% Andrade & Sánchez, (2018)

Enterobacterias
19 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3. Representación de los microorganismos identificados como agentes causales de mastitis en las islas Galápagos

25%

21%

20%

20 15% 14% 14%

Porcentaje de distribución

microorganismos

agentes causales de 10%

mastitis
5% 5%
5% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4%
2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2%

0%
s s s is s e s e a i is a li s e s p s
reu ticu ene rm neti iea teu aca utid rium bac btil gen . co ticu rum rra i cu er s ticu
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A.
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Ps

Microorganismos identificados
20 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 4 Distribución de agentes causales de mastitis distribuidos en las islas Santa Cruz, Isabela y Floreana.

SANTA CRUZ ISABELA FLOREANA

N identificado por isla

e us cus nes mis etis eae eus cae tida ium aci tilis ena coli cus um rae icus r sp cus
ur lyti oge ifor t r r
a o agn arvi . lu cloa pu ter . tab sub vig E. olyti quo . te em e
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S.
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S. B. om B. . M Art c
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e
Ps
Microorganismos identificados

Staphylococcus aureus fue agente causal de mastitis para las tres islas Santa Cruz y Floreana. En la isla Isabela el agente causal mayoritario
fue el Staphylococcus chromogenes. En la Isla Santa Cruz, el organismo predominante como agente causal fue Staphylococcus aureus.
21 CONCLUSIONES

o Se logró amplificar por PCR del gen 16S de 1 500 bp, identificando los agentes causales de mastitis en las islas Galápagos.

o Se confirma la hipótesis, estableciendo a Staphylococcus spp. y Bacillus spp. como principales agentes causales de mastitis
aislados de muestras de leche de ganado bovino de las islas Galápagos. Sin encontrar en el estudio Streptococcus sp.

Staphylococcus aureus Staphylococcus chromogenes Staphylococcus aureus

 22 CONCLUSIONES

Figura 5 Distribución de agentes causales de mastitis distribuidos

en las islas Santa Cruz, Isabela y Floreana.

11
SANTA CRUZ ISABELA FLOREANA
o Staphylococcus aureus en al menos
uno de los cuartos positivos para
mastitis subclínica

N identificado por isla

o Principal agente causal de mastitis
bovina presente en las tres islas: r
s s s is s e s e a ci is a li s e
eu ticu ene rm neti iea teu aca tid rium ba btil gen . co ticu rum rra icu er s ticu
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Santa Cruz, Isabela y Floreana. S. emo om hen S. L. g M E. c nas ega E B. . fla
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S. S B o m B. M M Art A. c
d
Staphylococcus aureus P s eu
Microorganismos identificados
23 RECOMENDACIONES
o Se recomienda realizar un estudio de genoma completo o Estudios de microorganismos compartidos.

o Se recomienda realizar estudios de genes de resistencia a

antibióticos en los Staphylococcus spp. encontrados en el estudio.
23 GENES DE RESISTENCIA

11
Staphylococcus aureus

BlaZ Codifica la síntesis de B-lactamasas Penicilina Se recomienda antibiogramas

mecA Codifica la PBP2a (Penicillin-binding Meticilina

protein)

mecC Codifica la PBP2a (Penicillin-binding Oxacilina

protein)
24 AGRADECIMIENTOS

Dr. Jorge Ron Román, Ph.D.

Carrera de Ingeniería Agropecuaria
IASA I - ESPE

Lic. Alma Koch Kaiser, M.Sc.

Carrera de Ingeniería en Biotecnología
Matriz Sangolquí – ESPE

Ing. Cristina Cholota

Técnico del Laboratorio de Biotecnología Animal