Tiểu luận Hóa sinh

Tác dụng chống oxy hóa và

bảo vệ gan của nước chiết xuất
từ đậu xanh nảy mầm và lên
men trên gan tổn thương do
Ethanol

NHÓM 4 K64QLTP
GVHD: TS HOÀNG LAN PHƯỢNG
Giới thiệu

Nguyên liệu và phương pháp

Kết quả

Thảo luận

Kết quả
I/ Giới thiệu.
- Gan là cơ quan quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hóa, lưu trữ và bài tiết
các chất chuyển hóa.
- Một số loại độc tố ảnh hưởng tới gan như : etanol, paracetamol, cacbon
tetraclorua,…

Các độc tố gan

- Tăng tính thẩm thấu màng

Tế bào gan chuột => - Quá trình peroxy hóa lipit
- Sự chết tế bào

=> Tương tự với sự phát triển bệnh gan mãn tính ở người
 Độc tố gan
Tế bào trong gan Giải phống chất trung gian tiền
viên như NO, interferon-gamma

Sự OXH hóa lipid + suy Tích tụ các loại nitơ phản

thoái màng => tổn thương ứng ROS
và viên gan
 Đậu xanh là một chất
bảo vệ gan trong thực
phẩm chức năng.

Quá trình lên mem và nảy mầm

của đậu xanh được công nhận là có
tác dụng nâng cao giá trị dinh
dưỡng, đăc biệt là nồng độ của các
hợp chất hoạt động như Axit amin,
GABA cao hơn của các loại thực
phẩm khác.
 Giá đậu xanh nảy mầm và lên mem đã
ghi nhận mức tăng: 7,3 – 27,9 lần GABA
và 8,7 – 13,2 lần cải thiện axit amin so
với đậu xanh bình thường.

Ngoài ra, cải thiện mức độ oxy hóa, mức

NO liên quan đến đánh giá mô bệnh tốt
hơn chỉ ra rằng những chất chiết xuất này
có thể thúc đẩy phục hồi hiệu quả các tổn
thương trên tế bào gan
Nguồn chất chống OXH từ tự nhiên : Đậu xanh

Vai trò:
- Tăng mức độ SOD và FRAP trong tế bào chất của gan choột
Þphục hồi hiệu ứng tổn thương gan gần vố mức bình thường
- polyphenol, flavonoid, anthocyanins
ÞTác dụng chống OXH mạnh
ÞBảo vệ, chống lại tổn thương gan
Sự nảy mầm và lên mem đậu xanh

- GABA(axit 𝛾 𝛾 -amino butyric) : aa hoạt động như 1 chất ức chế tế

bào thần kinh ở động vật có vú, có thể được chiết xuất từ động vật
- GABA : + chống tang huyết áp
+ chống ung thư
+ chống các tác nhân gây viêm..
+ và 1 số lợi ích sức khỏe khác
=> sản phẩm đậu tương lên men (GABA) là loại sản phẩm truyền thống
chứa nhiều oligopeptit + aa tự do (GABA) -> giảm mức cholesterol
trong huyết tương ~ tương quan chức năng gan khi chuyển hóa lipid
trong cơ thể
 II/ Nguyên liệu
2.1 Nguyên liệu
• Hypoxanthine, xanthine oxidase, superoxide dismutase, Folin-
Ciocalteu reagent, aluminium chloride, sodium nitrate, axit ascorbic, và
axit gallic
• Thuốc thử Griess
• Chất cấy chủng Rhizopus 5351
• Chất chiết xuất từ cây kế sữa
2.2 Động vật
Chuột Balb/c đực từ 8–10 tuần tuổi nặng 20–25 g được duy trì trong
điều kiện tiêu chuẩn với nhiệt độ (22 ± 5⁰C)
2.3 Nguyên liệu thực vật
• Đối với đậu xanh lên men, khoảng 1000 g hạt đậu xanh tách vỏ ngâm trong nước lạnh
ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ
• Đậu xanh ngâm nước rửa sạch kỹ lưỡng và hấp trong 40 phút. Sau đó, những hạt đã
hấp này được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và được trộn với chất cấy chủng Rhizopus 5351
=> chủng Rhizopus 5351 cho năng suất cao nhất về tổng số axit amin và hàm lượng GABA
trong đậu xanh lên men sau 48 giờ ủ ở 30⁰C
• Hạt đậu xanh nảy mầm được chuẩn bị bằng cách cho hạt đậu xanh nảy mầm bên trong
thùng chứa Anae-rocukt A được cung cấp khí CO2 trong thời gian lên tới 72h
• Để kiểm soát, hạt đậu xanh được nghiền trực tiếp thành bột mà không cần lên men
hoặc nảy mầm trước.
• Bột nghiền mịn sau đó được chiết xuất bằng cách sử dụng nước khử ion (tỷ lệ 1: 20) ở
25⁰C trong 30 phút và được đặt trong tủ ấm lắc ở tốc độ 300 vòng /phút trong 30 phút ở
nhiệt độ phòng .
• Hỗn hợp sau đó được ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 10.000 vòng / phút và phần nổi phía
trên được thu thập. Chất nổi trên được bơm thêm vào để đông khô ở nhiệt độ vận hành -
50⁰C
2.3.1 Xác định axit amin và GABA
• Bột đông khô được hòa tan trong nước cất và được lấp đầy qua bộ lọc ống tiêm
0,2 μm trước khi phân tích UPLC.
• Quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện bằng cách trộn 70 μL dung dịch đệm
AccQ Tag Ultra borate với 10 μL dung dịch chiết xuất đã lọc, tiếp theo là thêm 20
μL thuốc thử AccQ Fluor bằng ống Pcr 1.5ml.
• Tất cả các phân tích được thực hiện trên hệ thống Waters Acquity UPLC
• Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Waters Empower 2. Acquity UPLC
AccQ-Tag Ultra Column
• Tốc độ dòng được đặt ở 0,7 mL / phút và thể tích tiêm cho tất cả các mẫu
• và chất chuẩn là 1,0 μL.
• Nhiệt độ cột được đặt ở 55°C
2.4 Trong Vivo Tác dụng bảo vệ gan-Ethanol gây ra độc tính trên gan ở Chuột.
Tổng số 72 con chuột Balb / c được phân phối ngẫu nhiên thành 8 nhóm (n = 8).
Các con chuột được xử lý trước bằng đường uống với ethanol và chiết xuất từ nước thực vật
trong tối đa 21 ngày. Thí nghiệm được thiết kế như sau:
• Nhóm 1. Nhóm bình thường, chuột (p.o.) với 100 µL nước muối bình thường trong
14 ngày.
• Nhóm 2. Nhóm không xử lý etanol, chuột (p.o.) với 100 µL 50% (v / v) etanol trong
7 ngày, sau đó là 14 ngày với 100 µL 1 X PBS.
• Nhóm 3. Nhóm đối chứng tích cực, chuột (p.o.) với 100 µL 50% (v / v) ethanol trong
7 ngày, sau đó là 14 ngày với 100 µL silybin (50 mg / kg).
• Nhóm 4. Nhóm được xử lý liều thấp, chuột (p.o.) với 100 µL ethanol 50% (v / v)
trong 7 ngày, tiếp theo là 14 ngày sử dụng 100 µL chiết xuất đậu xanh (200 mg / kg).
• Nhóm 5. Nhóm được điều trị liều cao, chuột (p.o.) với 100 µL ethanol 50% (v / v)
trong 7 ngày, tiếp theo là 14 ngày sử dụng 100 µL chiết xuất đậu xanh (1000 mg / kg).
• Nhóm 6. Nhóm được xử lý liều thấp, chuột (p.o.) với 100 µL 50% (v / v) ethanol
trong 7 ngày, sau đó 14 ngày sử dụng 100 µL chiết xuất đậu xanh nảy mầm (200 mg / kg).
• Nhóm 7. Nhóm được xử lý liều cao, chuột (p.o.) với 100 µL 50% (v / v) ethanol
trong 7 ngày, sau đó 14 ngày sử dụng 100 µL chiết xuất đậu xanh nảy mầm (1000 mg / kg).
• Nhóm 8. Nhóm được xử lý liều thấp, chuột (p.o.) với 100 µL 50% (v / v) ethanol
trong 7 ngày, sau đó là 14 ngày sử dụng 100 µL chiết xuất đậu xanh lên men (200 mg / kg)
• Nhóm 9. Nhóm được xử lý liều cao, chuột (po) với 100 µL ethanol 50% (v / v) trong
7 ngày, sau đó là 14 ngày với 100 µL lên men chiết xuất đậu xanh (1000 mg / kg).
2.5. Hóa sinh huyết thanh.
Hoạt động của enzym đánh dấu huyết thanh bao gồm alanin transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG), và
tổng cholesterol được đo bằng máy phân tích sinh hóa và thuốc thử điều chỉnh từ Roche (Đức).
2.6. Đánh giá mô bệnh học gan.
• Gan được cắt bỏ, cố định trong dung dịch formalin 10%, nhúng trong parafin, cắt thành độ dày 4 micromet, và nhuộm bằng
hematoxylin và eosin (H&E)
• Được quan sát dưới kính hiển vi trường sáng
• Đánh giá gan được phân loại dựa trên những thay đổi về mạch máu và tình trạng hoại tử
• Không thay đổi (không thay đổi phân biệt, 0%); thay đổi nhẹ (30%); thay đổi vừa phải (31–60%); thay đổi nghiêm trọng (61–90%);
thay đổi rất nghiêm trọng (91–100%).
2.7 Chất chống oxy hóa trong ống nghiệm của đánh giá đồng nhất về gan
Gan chuột được chia lưới trong PBS lạnh đông và đồng nhất trước khi ly tâm ở tốc độ 2000 vòng / phút trong 5 phút ở 4°C. Dịch nổi được
thu thập và trải qua các thí nghiệm khác nhau
2.7.1. Xác định Superoxide Dismutase (SOD)
• Mẫu được thêm với 0,1 mol / L EDTA, 0,15 mg / mL natri xyanua, 1,5 mmol / L NBT, 0,12 mmol / L riboflavin, và đệm phosphat
0,067 mol / L đến thể tích cuối cùng là 300 µL
• Một đơn vị SOD được tính bằng lượng protein cần thiết để đạt được mức ức chế 50%
2.7.2. Xác định Malondialdehyde (MDA)
Một phần 100 µL chất đồng nhất ở gan được pha loãng với 400 µL PBS và trộn với 12,5 µL BHT ( 8,8 mg / mL) và 250 µL TCA, 30%.
Hỗn hợp được xoáy và giữ trên đá trong 2 giờ. Tiếp theo, hỗn hợp được ly tâm ở 2000g trong 15 phút. Phần nổi phía trên thu được được
đun sôi trong 15 phút cùng với 37,5 µL 0,1 M EDTA và 125 µL axit thiobarbituric (TBA, 1%).
2.7.3. Xác định công suất chống oxy hóa khử sắt (FRAP)
Thuốc thử được chuẩn bị bằng cách trộn dung dịch đệm axetat 300 mM, 10 mM và 20 mM FeCl3.6H2O, dung dịch O trong HCl 40 mM.
Dung dịch làm việc mới được chuẩn bị bằng cách trộn 25mL đệm axetat, 2,5 mL dung dịch TPTZ và 2,5 mL dung dịch FeCl3.6H2O và sau
đó làm ấm ở 37 ° C trước khi sử dụng. Một phần 150 µL chiết xuất hoạt tính sinh học (5 mg / mL) từ đậu xanh, đậu nảy mầm và lên men
được cho phép phản ứng với 2850 µL dung dịch FRAP và lắc mạnh trước khi ủ trong bóng tối trong 30 phút
2.7.4. Xác định Oxit Nitric.
Các chất đồng nhất ở gan (100 µL) được đưa vào đĩa vi mô, tiếp theo là thuốc thử Griess 100 µL (1% sulphanilamide và 0,1% N-1-
naphthyl ethylenediamine dihydrochloride trong 2,5% axit polyphosphoric). Sau đó, độ hấp thụ được lấy ở bước sóng 540nm bằng ELISA
Reader
2.8. Phân tích thống kê.
Các phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) và giá trị trung bình của nhóm được so sánh
bằng phép thử Duncan. P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
III/ Kết quả
Bảng 1: ảnh hưởng của chất chiết xuất từ đậu xanh trên huyết thanh ALT,
AST, TG và cholesterol trong ngộ độc gan do ethanol ở choột

1. Ảnh hưởng của chất chiết xuất từ đậu xanh trên các dấu hiệu sinh học chức năng
gan
- ALT và AST là dấu hiệu sinh hóa thường được sử dụng để đấng giá giai đoạn đầu của
tổn thương gan
= xử lí bằng đậu xanh lên men ở liều cao ( 1000mg/kg) cho thấy tỷ lệ ức chế cao nhất
của ALC huyết thanh ( 63,73%) và AST (69,84%) ; tiếp theo là đậu xanh nảy mầm liều
cao (1000mg/kg) thì ALT (45,25%) và AST (47,75%) khi so sánh với nhóm đối chứng
2. Ảnh hưởng của chất chiết xuất từ nước lên huyết thanh TG và Cholesterol
- Một dấu hiệu khác để xác nhận tổn thương gan cấp tính do rượu được chỉ định là
nộng độ TG và Cholesterol trong huyết thang tăng.
- Như bảng 1, điều trị bằng chiết xuất làm giảm mức tăng TG vafCholesterol với mức
giảm đáng kể trong đậu xanh lên men liều cao ( 1000mg/kg) với 38,4% và 23,42%
tương ứng
3. Ảnh hưởng của các chất chiết xuất từ đậu xanh đến mức độ SOD,MDA, FRAP và
NO trong dịch treo mô đồng thể ở gan
- Ảnh hưởng của việc sử dụng chiết xuất từ nước đậu xanh, đậu xanh nảy mầm và đậu
xanh lên men đối với chất chống oxy hóa gan được thể hiện ở bảng 2.
 - Đậu xanh lên men có thể làm giảm mức MDA 3,6 lần từ 7,17 ± 0,17 xuống 2,00 ± 0,23 (nmol
/ g protein) và mức NO 1,6 lần từ 14,72 ± 0,75 xuống 9,03 ± 0,06 (μmol / mg protein).
- Trong khi đó, nó cũng làm tăng mức độ enzym SOD và hoạt tính FRAP lên 2,3 lần và 2,2
lần, về cơ bản góp phần vào tác dụng bảo vệ gan chống lại các gốc tự do.
- . Liều cao nhất của đậu xanh lên men (1000 mg / kg / ngày) được cho là có thể so sánh cao
nhất với các nhóm thuốc thông thường và tiêu chuẩn.
4. Đánh giá mô bệnh
IV/ Thảo luận
- Ethanol gây ra tổn thương ở gan và thận của người , động vật khi tiếp xúc trong thời gian nhất định.
- Sự chuyển hóa ethanol gây ra sự phân hủy protein, lipit, DNA do sự biến đổi của các gốc tự do.
- Các tế bào gan bị giảm chức năng do ethanol bao gồm: viêm nhiễm, apoptosis, hoại tử và xơ gan.
- Tiếp xúc kéo dài với ethanol làm tăng mức TNF-a, cytokine tiền viêm, làm kích hoạt các chemokine
gây viêm khác( NO). Giảm khả năng chống oxy hóa , tăng AST, ALT, TG, cholesterol
- Trong nghiên cứu, 1 lượng chiết xuất cao đậu xanh lên men cho thấy tác dụng bảo gan của nó khi khôi
phục mức AST, ALT, cholesterol lại mức bình thường.
- Mức độ giảm AST, ALT, cholesterol ở đậu xanh thấp hơn so với đậu xanh len men và nảy mầm.
- Thông qua các xét nghiệm MDA, SOD, FRAP và NO các đặc tính chống oxy hóa của chiết xuất được
kiểm tra trong mô gan chuột:
+ MDA trong gan tăng do ethanol gây ra cho thấy mức độ phát triển quá trình peroxy hóa lipit, có thể dẫn
đến tổn thương gan.
+ SOD, FRAP giảm do sự suy giảm các enzym chống oxy hóa, bảo vệ tế bào chống lại các axygen phản
ứng.
Mặt khác SOD, FRAP tăng và MDA giảm khi có sự tiếp xúc của chiết xuất đậu xanh lên men và nảy mầm.
- Bởi vì: trong đậu xanh lên men và nảy mầm có chứa hàm lượng phenol cao cùng hoạt tính chống oxy
hóa mạnh . Ngoài ra nó còn chứa chất chống oxy hóa dễ bay hơi có thể ức chế sự hình thành mal-
onaldehyde trong huyết tương.
- NO là chất trung gian gây viêm và chất oxy hóa có hoạt tính cao được tạo ra
bởi INOS, được giải phóng bởi các tế bào kupffer khi tiếp xúc với độc tố gan.
Chất chiết xuất từ đậu xanh lên men liều cao là những chất chiết xuất hiệu quả
nhất để phục hồi sự gia tăng của mức NO sau khi
cảm ứng với ethanol ,sau đó là chất chiết xuất từ đậu xanh nảy mầm. Do đó bằng cách ngăn
chặn sản xuất NO trong gan, đậu nảy mầm và len men đã mô tả các đặc tính tiềm năng của
chúng như một tác nhân bảo vệ gan.
- Các hợp chất hoạt tính sinh học flavonoil và phenolic cũng được thấy nhiều trong các sản
phẩm lên men và nảy mầm. Khi cây họ đậu trải qua quá trình lên men và nảy mầm sẽ làm tăng
sự gia tăng hàm lượng GABA và axit amin. Đây là 1 chất có tác dụng bảo gan thông qua cơ chế
duy trì mức độ polyamine nội bào của ethanol và tổn thương gan do tiếp xúc với CCl hiệu ứng.
-Dấu hiệu tổn thương gan như viêm, thâm nhiễm tế bào lympho, hoại tử và các hiệu ứng bóng
phục hồi trở lại gần bình thường sau khi sử dụng liều cao chiết xuất từ đậu xanh nảy mầm và len
men, được hỗ trợ bởi sự giảm ALT, AST, TG, cholesterol, NO, MDA và tăng hoạt động FRAP,
SOD. Mối tương quan giữa các dấu ấn sinh học gan và những thay đổi mô bệnh học cho thấy
rằng chúng có thể được sử dụng để phát hiện sớm tổn thương gan cấp tính. Giảm tổn thương
sinh hóa và mô học được thực hiện bởi đậu xanh nảy mầm và lên men phù hợp với đặc tính bảo
vệ gan của chúng.
- Chưa có nghiên cứu nào chỉ ra sự thay đổi mô bệnh học của các chất chiết xuất từ đậu xanh lên
men và nảy mầm.
 V/ Kết luận

- Chất chiết xuất từ nước đậu xanh đã lên men và nảy mầm đã được làm khô đông lạnh ở
1000 mg/kg thể trọng cho thấy tác dụng bảo vệ gan tiềm năng đối với tổn thương do
ethanol gây ra dựa trên đánh giá sinh hóa huyết thanh và mô học của gan chuột.
- Phần lớn có thể là do hàm lượng axit amin và đặc tính chống oxy hóa mà các chất chiết
xuất này sở hữu liên quan đến hoạt động nhặt rác FRAP và yếu tố liên quan đến oxy hóa,
SOD
=> Kết luận, lên men và nảy mầm tăng giá trị dinh dưỡng và dược liệu của đậu xanh. Hơn
nữa, kết quả có thể so sánh với silybin, một loại thuốc tiêu chuẩn thường được kê đơn để
điều trị bệnh gan. Do đó, kết quả cho thấy khả năng sử dụng tiềm năng của chiết xuất nước
đậu xanh lên men và nảy mầm từ sản phẩm tự nhiên ứng dụng trong tương lai để điều trị
bệnh gan và mất cân bằng oxy hóa.
Thank for watching
Team 4