Molekularni markeri

• Marker je svaki faktor indikacije –gen ili segment DNK sekvence,

poznate lokacije i efekta ekspresije, koji se uzima kao trag ili
signal u nasljeđivanjudrugih takvih jedinica-predhodno
nepoznate lokacije. Marker može biti:
• svaki gen poznate hromosomske lokacje i jasno definiranih
okvira fenotipske ekspresije
• antigenski fragment upotrebljiv za razlikovanje tipova ćelija
• segment DNK, RNK i protein poznate veličine i /ili svojstava koja
su upotrebljiva za kalibraciju elektroforetskog gela
Osobine dobrog marker sistema su:
• Polimorfnost –pojavljivanje u više alelnih varijanti
• Reproducibilnost- stabilnost rezultata u istim eksperimentalnim
uslovima
• Kodominantnost- direktnoa detektibilnost hetrozigota
• Diskriminativnost- detektibilnost razlika među bliskim
srodnicima
• Neovisnost od uticaja sredine
• Neutralnost- nepodložnost djelovanju selekcije
• Jednostavnost, brzina, i ekonomičnost u većim uzorcima
proučavanih jedinki
• Markeri se uslovno mogu podijeliti na:
• Indirektni genetički marker- i fenotipski (morfološke-
morfometrijski, mjeristički, i sl. i biohemijsko- proteinski)
• Direktni genetičke markeri

• Za markere koji uključuju proučavanje alela preko proteina se često

koristi termin indirektni genetički markeri, dok se pojam
direktni genetički markeri koriste za direktno ispitivanje DNK
(ili promjena u DNK).
• Za klasifikaciju molekularno – genetičkih markera postoji veći broj
kriterija. U narednom poglavlju bit će prikazana njihova klasifikacija
obzirom na pojedine kriterije.
• I tip klasafikacije markera obzirom na vrstu genoma koji se
analizira:
• nuklearni
• mitohondrijalni
• Plastidni

• II tip klasifikacije markera prema analiziranim regionima genoma:

• markeri za analizu kodirajućih regiona (RAPD, AFLP...)
• markeri za analizu nekodirajućih regiona (minisateliti,
mikrosateliti)

• III tip klasifikacije markera prema vrsti analiziranog materijala:

• indirektni markeri (genetička istraživanja indirektno preko
proteina)
• direktni markeri (direktna istraživanje DNK)

• IV tip klasifikacije prema predhodnom predznanju analizirane DNK

sekvence i lokusa:
• bez predhodnog predznanja o sekvencama i lokusima (npr. RAPD,
DAF tehnika )
• sa predhodnim predznanjem o sekvencama i lokusima (npr. AFLP,
mikrosateliti)
• V tip klasifikacije prema tipu genetičke varijacije:
• bazirana na dužini fragmenata (npr. RFLP)
• bazirana na specifičnom izgledu elektroforetskog profila (npr.
RAPD)
• bazirana na promjenama u pojedinačnim nukleotidima (npr.
sekvenciranje)

• VI tip klasifikacije prema veličini analiziranog genoma:

• analiza pojedinačnih lokusa (npr. "single-locus" mikrosateliti)
• analiza većeg broja lokusa istovremeno, tzv. multiplih lokusa, i to:
• - DNK fingerprinting (npr. istraživanje minisatelita, ili "multiplex"
mikrosatelita),
• - Generalno pretraživanje genoma (npr. RFLP tehnologija i
restrikcione mape)
• - Korištenje anonimnih markera (npr. RAPD ili druge AP-PCR
tehnike )

• VII tip klasifikacije prema mogućem uočavanju stepena zigotnosti:

• dominantni - nije moguće uočiti stepen zigotnosti (npr.
RAPD,AFLP..),
• kodominantni - moguće je uočiti stepen zigotnosti (npr.
mikrosateliti, aloenzimi)
 a) Proteinski markeri
Ova vrsta marker sistema (indirektni genetički markeri) se počela koristiti mnogo prije DNK markera (direktnih
genetičkih markera). Proteinski markeri se mogu koristiti za različita istraživanja DNK, ali samo njenih kodirajućih
regiona, uključujući sve vrste DNK fingerprinting, mogućnost otkrivanja promjena u pojedinačnim nukleotidima u
. DNK molekuli, odnosno, utvrđivanju dužinskih varijacija fragmenata
• Korištenje proteinskih markera ima značajnih prednosti i pogodnosti u odnosu na druge marker sisteme, kao što su:
• Moguća primjena jeftine tehnologije,
• Jednostavna ekstrakcija proteina iz ispitivanih tkiva,
• Mogućnost da se analizira veliki broj uzoraka u relativno kratkom vremenskom periodu, itd.
• Dobro razvijene statističke tehnike za adekvatnu analizu i prezentaciju rezultata.
•  
• Međutim, primjena proteinskih markera ima i ozbiljnih nedostatka, kao što su:
• Mogućnost istraživanja i otkrivanja polimorfizma samo u kodirajućim regionima DNK
• Generalno, to nisu neutralni markeri, jer se nalaze pod «udarom» selekcije – to se posebno odnosi na proteine od izuzetnog
metaboličkog ili ontogenog značaja za organizam,
• Alelizam je ponekad teško determinisati,
• Osjetljivost proteina i uzoraka na temperaturne promjene,
• Sakupljeni uzorci moraju biti odmah zaleđeni, što često nije pogodno za terensko ispitivanje. Naime, za adekvatnu analizu,
neophodno je imati neoštečen i aktivan enzim što se može postići samo ako se uzorak zaledi odmah pri sakupljanju.
• Nemogućnost otkrivanja «skrivenih varijacija», tj. proteinski markeri ponekad nisu u mogućnosti da detektuju sve
promjene u DNK, jer svaka nukleotidna promjena se ne ogleda u promjenama aminokiselina, niti u promjenama
elektroforetske mobilnosti proteina,
• Za određena populaciona istraživanja, korištenje proteina nije adekvatna metodologija, jer se, u principu, njihovom
primjenom istražuje veoma mali dio genoma koji, obično, ne sadrži tako velike varijacije koje bi bile iskazane i, na taj način,
ukazale na skoriju divergenciju u populacijama.
•
• Generalno, proteinske markere možemo podijeliti na:
• 1) Proteinsku elektroforezu koja predstavlja tehniku ispitivanja pojedinačnih lokusa (single
locus technique) - prvi put je korištena na pticama 1930-ih od strane Landsteiner i njegovih
saradnika. Tehnika se sastoji u tome da se uzorci krvi ili tkiva individua puštaju kroz gel gdje se
različite forme proteina razdvajaju ovisno od njihovog električnog naboja, a vizuelizacija se vrši
korištenjem specifičnih boja koje su karakteristične za određenu vrstu proteina. Ovaj marker
sistem se može koristiti i za utvrđivanje heterozigota koji imaju alele sa odnosom
kodominantnosti, pa se ovi markeri mogu koristiti za taksonomska, populaciona, i druga
istraživanja.
• Jedan od nedostataka ovih, i drugih proteinskih markera, je osjetljivost proteina na promjene
temperature, ili druge vanjske faktore, što može značajno uticati na elektroforetsku mobilnost
• proteina. Takođe, rezolucija proteinske elektroforeze nije uvijek adekvatna za detekciju razlika
između populacija, ili individua.
• 2) Analizu izoenzima što predstavlja analizu i istraživanje različitih formi enzima koji su
funkcionalno slični, a determinisani su sa jednim ili više gena koji su smješteni na jednom ili više
lokusa.
• 3) Analizu aloenzima što predstavlja analizu izoenzima koji su produkt različitih alela, ali koji
su smješteni isključivo samo na jednom lokusu.
•
Direktni genetički markeri

• Pod genetičkim markerima se podrazumjevaju sve alelne

varijante jednog gena, ili DNK polimorfizmi, koji se
koriste kao eksperimentalne probe za utvrđivanje
individualne, tkivne, ćelijske, nuklearne, hromosomske,
ili genske pripadnosti, odnosno, različitosti. To znači da
su genetički markeri bilo koji karakteri koji mogu
predstavljati znak ili signal prisustva ili lokacije gena, ili
bilo kojih drugih nasljednih karakteristika individue u
populaciji.
• RFLPs (Restriction Fragment Length
Polymorphisms)
• RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA)
• DAF (DNA Amplification Fingerprinting)
• AP-PCR (Arbitrary Primed PCR)