Introduction

La chromatographie est une technique séparative analytique et/ou

préparative. Elle consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une
phase stationnaire immobile, à l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse,
de nature différente. Chaque molécule sera plus ou moins rapidement
entraînée selon son affinité pour, respectivement, la phase stationnaire et la
phase mobile, permettant la séparation des différents constituants présents.
À partir de ce principe très général, il existe de très nombreux types de
chromatographie en fonction de la nature de la phase stationnaire, de la
nature de la phase mobile, et de la nature des interactions entre ces phases et
les molécules à purifier. En effet, selon les cas, les facteurs physico-chimiques
qui interviennent comme critère de séparation sont totalement différents : ce
peut être la masse moléculaire, la charge, l’hydrophile/hydrophobicité, la
structure tridimensionnelle, etc. Évidemment, le choix est effectué au cas par
cas en fonction des besoins. Il n’est d’ailleurs pas rare d’utiliser
successivement plusieurs types de chromatographies différentes au cours
d’une même purification.
 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

• Le principe de la chromatographie est basé sur les différences d’affinité des composés
d’un mélange entre une phase mobile et une phase fixe. De manière plus précise, les
différents constituants du mélange sont entraînés par la phase mobile et sont séparés
graduellement sur la phase fixe (ou stationnaire) en fonction de leur adsorption ou de
leur solubilité (→ solution), selon la technique chromatographique utilisée.
• La phase mobile peut être soit un liquide (elle est alors appelée éluant), soit un gaz
 (elle est alors appelée gaz vecteur).
• La phase fixe quant à elle peut être solide (gel de silice, alumine, etc.) ou liquide.
• Chaque constituant du mélange étudié a une vitesse de migration caractéristique qui
permet de le séparer des autres et ainsi de l’identifier. De manière générale,
l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans
l'échantillon. Le diagramme obtenu par chromatographie est
appelé chromatogramme et traduit la variation du composé étudié (espèce
minoritaire) dans la phase mobile (éluant ou gaz vecteur) en fonction du temps.
 PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

• Le principe de la chromatographie est basé sur les différences d’affinité des

composés d’un mélange entre une phase mobile et une phase fixe. De
manière plus précise, les différents constituants du mélange sont entraînés
par la phase mobile et sont séparés graduellement sur la phase fixe (ou
stationnaire) en fonction de leur adsorption ou de leur solubilité (→ solution
), selon la technique chromatographique utilisée.
• La phase mobile peut être soit un liquide (elle est alors appelée éluant), soit
un gaz (elle est alors appelée gaz vecteur).
• La phase fixe quant à elle peut être solide (gel de silice, alumine, etc.) ou
liquide.
• Chaque constituant du mélange étudié a une vitesse de migration
caractéristique qui permet de le séparer des autres et ainsi de l’identifier. De
manière générale, l'échantillon est analysé par comparaison avec des
substances déjà connues dans l'échantillon. Le diagramme obtenu par
chromatographie est appelé chromatogramme et traduit la variation du
composé étudié (espèce minoritaire) dans la phase mobile (éluant ou gaz
vecteur) en fonction du temps.
 LES DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

• On peut classer globalement les différentes techniques chromatographiques en deux

grandes familles : les chromatographies en phase liquide et les chromatographies en
phase gazeuse.
• 2.1. CHROMATOGRAPHIES EN PHASE LIQUIDE (CPL)
• Il existe différents types de chromatographies en phase liquide suivant la méthode de
séparation utilisée.
•  CHROMATOGRAPHIE PAR ADSORPTION
• L'appareillage est constitué d'une colonne chromatographique (en verre ou en acier
inoxydable), remplie de particules solides de diamètre inférieur à 20 µm (généralement de
l'alumine ou du gel de silice). Quelques microlitres de la solution à analyser sont
introduits en tête de colonne. Les constituants séparés en sortie de colonne sont détectés
par spectroscopie UV ou par réfractométrie.
• Comme son nom l'indique, cette chromatographie est fondée sur l'adsorption sélective
des constituants liquides sur la phase solide de la colonne. En fait, il se produit une
succession d'adsorptions et de désorptions, ces dernières étant provoquées par l'ajout
d'un solvant en fin de séparation.
 LES DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

• LES DIFFÉRENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

• On peut classer globalement les différentes techniques chromatographiques en deux grandes familles : les chromatographies en phase
liquide et les chromatographies en phase gazeuse.
• 2.1. CHROMATOGRAPHIES EN PHASE LIQUIDE (CPL)
• Il existe différents types de chromatographies en phase liquide suivant la méthode de séparation utilisée.
•  CHROMATOGRAPHIE PAR ADSORPTION
• L'appareillage est constitué d'une colonne chromatographique (en verre ou en acier inoxydable), remplie de particules solides de
diamètre inférieur à 20 µm (généralement de l'alumine ou du gel de silice). Quelques microlitres de la solution à analyser sont introduits
en tête de colonne. Les constituants séparés en sortie de colonne sont détectés par spectroscopie UV ou par réfractométrie.
• Comme son nom l'indique, cette chromatographie est fondée sur l'adsorption sélective des constituants liquides sur la phase solide de la
colonne. En fait, il se produit une succession d'adsorptions et de désorptions, ces dernières étant provoquées par l'ajout d'un solvant en
fin de séparation.
• CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE LIQUIDE-LIQUIDE
• Cette technique chromatographique utilise la différence de solubilité (→ solution) des constituants vis-à-vis de deux liquides non
miscibles.
•  CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION OU PAR PERMÉATION DE GEL (GPC)
• La chromatographie d’exclusion utilise la différence de pénétration des constituants sur un gel de polymère. Lors de leur traversée de la
colonne, seules les molécules dont le diamètre est inférieur à une certaine valeur peuvent pénétrer dans les pores du gel. Les composés
sont ainsi séparés selon la taille de leurs molécules.
•  CHROMATOGRAPHIE PAR ÉCHANGE D'IONS
• Cette technique chromatographique utilise l'échange d'ions entre la phase fixe (résine constituée d'ions) et la phase mobile
préalablement ionisée. Les ions sont en général des acides, des bases ou des cations métalliques. La chromatographie par échange d'ions
est employée pour des substances ionisables, en particulier en chimie minérale.
•  CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
• Chromatographie
• En chromatographie sur papier, le mélange à analyser est préalablement mis en solution. On
dépose une goutte de ce mélange liquide sur une feuille de papier. Le solvant migre par 
capillarité, entraînant avec lui les différents constituants du mélange, qui s'arrêtent plus ou
moins loin de la tache formée par la goutte initiale selon leur interaction avec la cellulose du
papier.
•  CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)
• La chromatographie sur couche mince, étudiée au lycée, est très semblable à la chromatographie
sur papier, la phase fixe étant une fine couche d'adsorbant (généralement de silice) déposée sur
une plaque de verre. Le mélange à étudier est déposé à l’aide d’un capillaire à environ un
centimètre du bord, puis placé dans une cuve contenant l’éluant. L’éluant migre sur la plaque de
silice par capillarité et entraîne les composés du mélange étudié, qui seront séparés s’ils
possèdent des vitesses de migration différentes. La plaque de chromatographie est ensuite lue
directement si les composés sont visibles, ou placé sous une lumière ultraviolette (UV).
• Le principal intérêt de la CCM est l’identification rapide des composés d'un mélange, mais cette
technique ne permet pas le dosage d'un composé.
• CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE PRESSION/PERFORMANCE (HPLC)
• La chromatographie en phase liquide à haute pression (également appelée
chromatographie en phase liquide à haute performance) remplace de plus en
plus la chromatographie liquide sur colonne par simple percolation à 
pression atmosphérique, du fait de sa faible vitesse d’élution. En effet, la
technique HPLC permet d’employer des phases stationnaires de granulométrie
bien plus fine (de 3 à 10 µm) mais qui nécessitent une pression d’entrée de
colonne pouvant aller jusque 400 bars environ.
• Cette technique est ainsi devenue l'une des techniques les plus employées
dans les laboratoires d'analyse chimique du fait de son extrême précision
permettant la recherche de composés à l’état de traces. Couplée à une
méthode de détection adéquate (un spectromètre de masse, par exemple),
cette chromatographie à débit imposé permet l'identification et la
quantification d’une grande variété de composés organiques ou inorganiques.
• 2.2. CHROMATOGRAPHIES EN PHASE GAZEUSE (CPG)
• La chromatographie en phase gazeuse permet de séparer des mélanges de gaz ou de composés 
vaporisables à haute température. Le mélange à analyser est injecté dans une colonne
métallique de quelques millimètres de diamètre contenant la phase fixe. Les composés sont
véhiculés sous pression par un gaz (dit gaz vecteur). Il s'agit généralement de l'hélium (He), de l'
argon (Ar) ou de l’azote (N2).
• Le temps que met un constituant gazeux pour parcourir la colonne est son temps de rétention,
qui est caractéristique du composé. Les constituants sont ainsi séparés par la différence entre
leurs temps de rétention respectifs.
• Le choix de la phase fixe est déterminant pour la réussite de la séparation. Cette phase est
choisie selon sa porosité et ses interactions avec la phase mobile, qui dépendent en particulier
de la différence de polarité entre les deux phases.
• La chromatographie en phase gazeuse est un moyen de séparation très efficace. Elle est
notamment utilisée dans les raffineries et dans l'industrie chimique. On peut la coupler avec
un spectromètre de masse pour identifier les composés du mélange vaporisé au fur et à
mesure de leur élution.
•  
• Une CCM, c’est quoi ? 
• Il s’agit d’une technique d’analyse qui s’appuie sur les différences d’affinités de substances chimiques entre une phase fixe, la plaque, et une phase mobile, l’éluant. Cette différence va permettre la séparation de ces
différentes substances sur la plaque.
• Identification ? Chaque espèce chimique s’élève à une hauteur spécifique, c’est ce qui permet de l’identifier par comparaison avec l’élévation d’une espèce témoin.
• La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes chromatographiques. Elle consiste à placer sur une feuille (papier, silice ou autre, voir plus loin) une tache et de la laisser éluer en la trempant dans
un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le long du support. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des interactions qu'elle subit de la part du support et de l'éluant.
• Protocol
• introduire l’éluant jusqu’à une hauteur d’environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d’éluant vont alors saturer la cuve.

2. Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant.

3. Préparation de la plaque :
a) à environ 1 cm du bas de la plaque, tracer délicatement une ligne au crayon à papier ;
b) indiquer sur cette ligne les positions des dépôts que vous allez effectuer ;
c) effectuer les dépôts souhaités à l’aide de capillaires :

• plonger une extrémité du capillaire dans la solution : quelques millimètres de solution entrent dans le capillaire,
• sur la position choisie, poser verticalement, très peu de temps mais plusieurs fois, l’extrémité du capillaire (l’objectif est d’avoir un dépôt très concentré et peu étalé).
•
4. Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l’éluant ne doit pas toucher les dépôts.

5. SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l’éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur.
•

6. Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l’éluant :d*
•  
• Plusieurs taches

Si on observe qu’un même dépôt s’est divisé en plusieurs taches, alors celui-ci est un mélange.

Attention, si le dépôt ne se divise pas, il ne s’agit pas forcément d’un corps pur.
• Resultats
• À la fin de la CCM, chaque espèce chimique s’est élevée à une hauteur qui lui est propre. Si on observe deux taches situées à la même hauteur, il s’agit de la même substance.

❯ Rapport frontal
Calcul du rapport frontal : Rf​=Hh​
• Exemple :
• Plusieurs taches obtenues à partir du dépôt B : il s’agit donc d’un mélange.
• La première tache du dépôt B est située à la même hauteur que la tache témoin donc la
substance B contient l’espèce témoin T.
•  Réalisation d'une CCM
• La CCM se déroule en trois étapes : préparation de la cuve, préparation de la plaque, et
élution.
• 3.1. Préparation de la cuve
• Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et d'un couvercle. Le couvercle sert
d'une part à éviter l'évaporation du solvant mais surtout à réaliser la CCM en atmosphère
saturée (pression de vapeur saturante du solvant), de façon à avoir des valeurs
reproductibles.
• Préparer l'éluant en respectant les proportions du mode opératoire.
• En placer 5 mm dans le fond de la cuve puis fermer le couvercle.
• Eventuellement placer un papier filtre verticalement dans la cuve de façon à saturer
l'atmosphère en vapeur de solvant
•  Réalisation d'une CCM
• La CCM se déroule en trois étapes : préparation de la cuve, préparation de la plaque, et élution.
• 3.1. Préparation de la cuve
• Un cuve de chromatographie se compose de la cuve et d'un couvercle. Le couvercle sert d'une part à éviter l'évaporation du solvant mais surtout à
réaliser la CCM en atmosphère saturée (pression de vapeur saturante du solvant), de façon à avoir des valeurs reproductibles.
• Préparer l'éluant en respectant les proportions du mode opératoire.
• En placer 5 mm dans le fond de la cuve puis fermer le couvercle.
• Eventuellement placer un papier filtre verticalement dans la cuve de façon à saturer l'atmosphère en vapeur de solvant.
• 3.2. Préparation de la plaque
• Prenons l'exemple d'une plaque sur laquelle 4 taches sont à disposer.
• Découper une plaque aux dimensions raisonnables 8 cm ´ 5 cm.
• Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque.
• Sur ce trait tracer 4 petits points à 1 cm de distance où seront déposés les taches.
• Déposer à l'aide d'une micropipette (ou pipette Pasteur) les solutions sur chaque point, ou à l'aide d'un capillaire fabriqué in situ avec en tube en
verre.
• Elution
• Placer la plaque dans la cuve, fermer et laisser l'éluant diffuser.
• Arrêter la CCM lorsque le front d'éluant est arrivé à 1 cm du haut de la plaque (cette opération prend 15 min, mais dépend du support et de l’éluant).
• Sortir la plaque et tracer au crayon le front de l'éluant.
• Sécher la plaque au pistolet ou à la chaleur d’une plaque chauffante.
•  
• Révélation
• Certains composés sont colorés : il n'est pas nécessaire de les révéler. La plupart sont incolores. Voici quelques méthodes utilisées pour révéler les
plaques.
• Chromatographie sur colonne
• Cette technique est analogue à la CCM (basée sur une interaction électrostatique / liaison H), sauf que
c'est par gravité que l'élution se fait, et non par diffusion.
• 1. Principe
• On utilise une colonne en verre équipée d'un verre fritté et d'un robinet. La colonne est remplie d'une
poudre, généralement de l'alumine ou de la silice. Un mélange est placé en haut de la colonne. Selon la
nature de l'éluant et du contenu de la colonne, certaines molécules sont plus facilement éluées que
d'autres.
• 2. Réalisation de la chromatographie
• 2.1. Préparation de la colonne
• Lorsqu'il n'y a pas de verre fritté dans le bas de la colonne, il est nécessaire de boucher la colonne en
plaçant un morceau de coton. Le coton doit être placé avec une baguette en verre.
• Remplissage de la colonne.
• Lors de l'opération de remplissage, le plus délicat est d'avoir une répartition la plus homogène possible de
l'adsorbant. Il faut éviter :
• D'avoir un remplissage de biais.
• Des trous dans le remplissage.
• Des bulles d'air.