Princip imunohemijske analize,

primjer ELISA testa na prisustvo

polihloriranih bifenila (PCB)

Sarajevo, 22.11.2012.
 Imunohemijske reakcije
Princip
Reagensi:
antitijela za detekciju i prečišćavanje antigena
antigeni za identifikaciju i kvantifikaciju specifičnih
antitijela

Detekcija antigena ili antitijela je moguća ukoliko

reakcija antigen-antitijelo može biti vizuelizovana ili
izmjerena.
Antitijela: poliklonalna i monoklonalna (antitijela za
gotovo svaki tip makromolekula)
 Poliklonalna antitijela
• Antiserum uglavnom sadrži smjesu antitijela
(Poliklonalna antitijela) koji prepoznaju i vežu
se za isti antigen, ali se mogu vezati za različite
epitope (slika 1).

• Antigen koji ima više mjesta za vezivanje

antitijela-multivalentni antigen.
 Monoklonalna antitijela
Monoklonalna antitijela-visoko specifična za
jedan epitop na multivalentnom antigenu (slika
2).
•Proizvode se iz jedne ćelijske linije primjenom
tehnologije hibridoma (iz ćelijskih linija
mijeloma miša)
•Hybridomi-antitijela koja proizvode tumorske
ćelije (veliki broj kopija istog antitijela)
Hibridomi se proizvode prema proceduri:

• injektira se specifični antigen u životinju

domaćina (uglavnom miš);
• izolacija B ćelija koje prozivode antitijela iz
slezene miša;
• B ćelije se fuziraju sa specifičnim tipom
tumorskih ćelija koje lako rastu u kulturi i
proizvode antitijela;
• izolacija hibridoma (fuziranih ćelija) koje
proizvode antitijela za antigen od interesa.
• Tehnike koje se baziraju na reakciji antigen-
antitijelo se mogu podijeliti u dve kategorije:
indirektne i direktne.

• Indirektne metode-direktna vizuelizacija

imunoprecipitata-relativno neosjetljive-potrebno
dovoljno reaktanata za formiranje vidljivih
precipitata, donosno agregata imunih kompleksa.

• Direktna mjerenja antigen-antitijelo kompleksa su

veoma osetljiva, jer se koriste uređaji koji
direktno mjere reakciju i ne zavise od formiranja
vidljivog precipitata.
 Precipitacione metode

Metode sa precipitacijom se izvode se u

polutečnom mediju:

•Radijalna imunodifuzija
•Imunoelektroforeza
•Elektroimunodifuzija
•Dvodimenzionalna imunoelektroforeza
•Aglutinacija
 Metode sa obilježivačima
Antigeni i antitijela su obilježeni fluoroforima
(imunofluorescentne metode), radioaktivno (radioimunološke
metode), enzimima (enzimske imunološke metode) ili
hemiluminiscentnim obilježivačima (luminiscentne
imunološke metode).

Obilježivači

•Radioaktivni obilježivači -najčešće se koristi izotop 125I sa

poluživotom od 60 dana.
•Enzimski obilježivači -enzimi koji se često koriste su alkalna
fosfataza, peroksidaza rena i glukozo-6-fosfat dehidrogenaza.
•Fluorescentni obilježivači -najčešće se koriste fluorescin i
rodamin.
•Luminiscentni obilježivači- esteri akridinijuma i izoluminol.
 Obilježavanje antitijela
• Direktno obilježavanje antitela postiže se
vezivanjem antitijela sa obojenom ili
radioaktivno obilježenom molekulom.

• Vizuelizacija antigen-antitelo kompleksa

postiže se i indirektno, naknadnom
inkubacijom sa obilježenim sekundarnim
antitijelom (anti-antitijelom).
Homogene i heterogene metode
• Homogene-kompleks antigen-antitijelo
se može direktno mjeriti bez prethodne
separacije
• Heterogene-potrebna separacija antigen-
antitijelo kompleksa (primjena čvrste
faze-paramagnetne čestice ili plastični
nosač)
• Heterogene-kompetitivne i
nekompetitivne
 Kompetitivni esej
• Obilježeni i neobilježeni antigen-vezivanje za
antitijelo
• Analit-neobilježeni antigen
 Nekompetitivni esej
Obilježeni analit (antitijelo)-signal direktno
proporcionalan prisutnom antigenu
 Enzim imunološke metode (ELISA)
• Heterogeni imunoesej
• At je vezano na čvrstu fazu-doda se uzorak sa Ag
• Nastali konjugat se ispere puferom, nakon čega se
dodaje enzimom obilježeno drugo At koji stvara
„sendvič kompleks” sa ranije stvorenim kompleksom
Ag i prvog At.
• Nevezani suvišak obilježenog At ispere se puferom i
doda se supstrat za enzim.
• Potom se odredi aktivnost enzima koja je obrnuto
proporcionalan koncentraciji enzima.
• Ako se određuje At, onda se Ag veže za čvrstu fazu, a
drugi reagens je enzimom obilježeno At specifično za
At u uzorku.
 Postojani organski polutanti (POP)

 Izrazito stabilne supstance koje perzistiraju u okolišu, imaju

sposobnost bioakumulacije i izazivaju značajne neželjene
efekte na zdravlje ljudi i okoliš.

 Po svojoj građi su najčešće hlorirani derivati, aromatskih i

poliaromatskih spojeva, koje karakteriše mala
hidrosolubilnost, visoka rastvorljivost u mastima, velika
molekulska masa i semivolatilnost.

 POP molekulskih masa manjih od 236 odlikuje manja

toksičnost, slabija bioakumluacija i manje izraženi
ireverzibilni efekti nego polutante veće molekulske mase.
 Velika rastvorljivost u mastima omogućava im dobar prolaz
kroz fosfolipidne membrane i bioakumulaciju u masnim
tkivima živih organizama.

 Otporni su na hemijsku, biološku i fotolitičku razgradnju u

okolišu.

 Transport POP odvija se atmosferom iz koje se ispiraju

kišom, te dospijevaju u tlo a potom u vodotoke i mora.
Transport na male udaljenosti se može odvijati sukcesivnim
isparavanjem sa tla, depozicijom i ponovnim isparavanjem.

 Mogu se prenositi atmosferom na velike udaljenosti i

kondenzirati se u hladnijim regionima, što predstavlja
globalnu prijetnju za ljudsko zdravlje i okoliš.
Prema preporukama Ekonomske komisije Ujedinjenih naroda
za Evropu, da bi se neka supstanca mogla svrstati u grupaciju
POP-a, mora ispunjavati slijedeće uslove:
Mogućnost transporta atmosferom na velike
udaljenosti-napon para supstance mora biti manji od 1
kPa i poluživot u atmosferi veći od dva dana,
Toksičnost-moraju biti dokazani neželjeni efekti na
ljudsko zdravlje i okoliš,
Dugotrajnost-poluživot u vodi mora biti veći od dva
mjeseca, a u zemljištu i sedimentima veći od šest
mjeseci,
Bioakumulacija-mora biti dokazano da je faktor
bioakumulacije u ribama veći od 5000, ili da je logaritam
koeficijenta distribucije oktanol/voda (logKo/w) veći od 5.
 Protokol ekonomske komisije Ujedinjenih nacija za Evropu
(UNECE) konvencije o prekograničnom zagađenju postojanim
organskim polutantima (engl. The Protocol to the Rregional
UNECE Convention on Long-Range Transboundary Air Pollution
(CLRTAP) on POPs),

 Štokholmska konvencija o postojanim organskim polutantima

(engl. The Global Stockholm Convention on POPs)

 Bazelska konvencija o kontroli prekograničnog prenosa i

odlaganja opasnog otpada (engl. Basel Convention on the
Control of Transboundary Movements of Hazardous Wastes
and Their Disposal)

 Roterdamska konvencija (engl. Rotterdam Convention on the

Prior Informed Consent Procedure for Certain Hazardous
Chemicals and Pesticides in International Trade).
 Polihlorirani bifenili
Polihlorirani bifenili (PCB) su klasa hemijskih jedinjenja u
kojima su 2-10 atoma hlora vezani za molekulu bifenila

Clx 3 2 2' 3' Cly

1 1'
4 4'

5 6 6' 5'
Slika 8. Opšta struktura PCB-a
 Tabela 1. Hemijsko grupisanje polihloriranih bifenila

Broj Grupa Molekularn Molekulska Broj

atoma homologa a formula masa izomera
hlora
0 Bifenil C12H10 154,1 1
1 Mono-CB C12H9Cl 188,0 3
2 Di-CB C12H8Cl2 222,0 12
3 Tri-CB C12H7Cl3 256,0 24
4 Tetra-CB C12H6Cl4 289,9 42
5 Penta-CB C12H5Cl5 323,9 46
6 Heksa-CB C12H4Cl6 357,8 42
7 Hepta-CB C12H3Cl7 391,8 24
8 Okta-CB C12H2Cl8 425,8 12
9 Nona-CB C12HCl9 459,7 3
10 Deka-CB C12Cl10 493,7 1
 Osobine polihloriranih bifenila
Osnovne karakteristike PCB-a:
izrazita hemijska i termička postojanost,
dobre dielektričke karakteristike,
netopivost u vodi,
 izrazita lipofilnost,
spora razgradivost,
nisu eksplozivni,
imaju veoma nisku električnu provodljivost,
 vrlo visoku toplotnu vodljivost,
 ekstremnu stabilnost na visokim
temperaturama.
 Praćenje polihloriranih bifenila u okolišu

• Upoređivanje rezultata-sadržaj nađenih PCB može se izraziti kao

Aloclor, ili kao koncentracija pojedinih kongenera ili homologa.

• Studije praćenja sadržaja PCB u atmosferi uglavnom ukazuju na

veću prisutnost nisko-hloriranih, isparljivijih kongenera,
pogotovo u sjevernim dijelovima Zemlje, bliže polovima.

• Koncentracije PCB u zemljištu i sedimentu, posebno više

hloriranih kongenera, uglavnom prate trend opadanja i u većini
regiona koji su praćeni dostigli su ravnotežno stanje.
 Proizvodnja i upotreba polihloriranih bifenila

 Dielektrični i rashladni fluidi u kondenzatorima i

transformatorima,
 Fluidi za prenos toplote, u hidrauličnim tečnostima i mazivima,
 Plastifikatori u bojama, adhezivima, polimerima,
 Aditivi u formulacijama pesticida.
 PCB mogu nastati i slučajno, nepotpunim sagorijevanjem
organskih materija, naročito polivinilhlorida ali i drugih
plastičnih materija.
 Izvori PCB-stari električni aparati, televizori i hladnjaci, koji su
napravljeni prije nego što je njihova proizvodnja prestala.
 Izloženost polihloriranim bifenilima

Najznačajniji izvor PCB-a za čovjeka je hrana, kao

što su: ribe, meso i mliječni proizvodi.

Ljudi koji žive u blizini opasnih mjesta curenja trafo

ulja mogu biti izloženi PCB konzumiranjem kontaminirane
hrane ili vode, ili udisanjem PCB-a u vazduhu.

Djeca su izložena na isti način kao odrasli-opasniji

unos zbog manje tjelesne mase!!!
 Toksikokinetika polihloriranih bifenila

Polihlorirani bifenili mogu se apsorbovati nakon

inhalacije, ingestije ili dermalnog izlaganja.

Metaboliziranje PCB srodnih spojeva odvija se u jetri uz

učešće mikrozomalnih enzima, citohroma P-450, pri
čemu nastaju manje lipofilni metaboliti, koji se mogu
konjugovati sa glutationom ili glukuronskom kiselinom.

Studije na eksperimentalnim životinjama pokazale su da

metabolizam PCB-a zavisi od pozicije i broja atoma hlora
na benzenovom prstenu.
 Toksično djelovanje polihloriranih bifenila

Maligne promjene na eksperimentalnim životinjama i izrazito

kancerogeno djelovanje.

Niske koncentracije PCB- povećana incidenca nastanka

hipertenzije i kardiovaskularnih oboljenja, značajan poremećaj
endokrinih funkcija, reproduktivnih sposobnosti i pojava
neuoloških poremećaja.

Najosjetljivi na toksično djelovanje polihloriranih bifenila su

fetusi, male bebe i djeca.
 Toksično djelovanje polihloriranih bifenila

♣ Efekti na zdravlje: anemija, pojava hlornih akni na

koži, oštećenja jetre i štitne žlijezde, smanjenje
funkcije imunog sistema, promjene u ponašanju i
smanjenje reproduktivnih sposobnosti.

♣ Američka Agencija za zaštitu okoliša (EPA) i

Internacionalna agencija za istraživanje tumora
(IARC) svrstale su PCB-je u grupu 2B, što znači da su
potencijalno kancerogeni za ljude.
 Analitika polihloriranih bifenila

Analiza PCB- sakupljanje i konzervisanje uzoraka,

ekstrakcija,prečišćavanje i određivanje.
Ekstrakcija:
 Ekstrakcija na čvrstim fazama (Solid phase
extraction, SPE)
 Kontinuirana tečno-tečna ekstrakcija
(Continuous liquid/liquid extraction, CLLE)
 Soxhlet ekstrakcija (tlo, sediment i čvrsti uzorci)
 Soxhlet / Dean Stark ekstrakcija
 Ultrasonična ekstrakcija sa kombinacijom
rastvarača
 Ekstrakcija superkritičnim fluidima
 Ekstrakcija mikrotalasima
 Analitika polihloriranih bifenila

Prečišćavanje:
 gel-permeacija,
 prečišćavanje na kolonama sa florisilom ili
silikagelom,
 primjena tečne hromatografije pod visokim
pritiskom (HPLC)
Određivanje:
 Gasna hromatografija sa elektron apsorbujućim
detektorom (GC-ECD)
 Vezani sistem gasna hromatografija-
spektrometrija masa (GC-MS)
 Vezani sistem tečna hromatografija-
spektrometrija masa (LC-MS)
 Imunohemijske metode: ELISA
Primjer: Određivanje PCB primjenom PCB RaPID
AssayKit
PCB RaPID esej kita proizvođača Strategic Diagnostic
Inc., koji se zasniva na enzim-imuno eseju (ELISA test).
Specifičnosti RaPID esej kita su:
• Antitijelo nije vezano za čvrstu površinu, nego za
paramagnetične čestice
• Antigen (PCB ili analog) je markiran peroksidazom
• Supstrat za detektorsku reakciju je 3,3’,5,5’-
tetrametilbenzidin
• Intenzitet razvijene plave boje je obrnuto proporcionalan
koncentraciji PCB
• Limit detekcije je 0,1 ppb
• Prema Američkoj agenciji za zaštitu okoliša
(Environmental Protection Agency, EPA) ova metoda
smatra se pouzdanom za brzi skrinig prisustva PCB-a sa
limitom kvantifikacije 0,5 do 10 ppb.
 Priprema uzoraka
Prije analize uzorci su sušeni na 40˚C do konstantne
mase.
Suhi uzorci (10 g) ekstrahovani su sa 20 ml metanola
uz korištenje Vortex miksera. Nakon
sedimentacije, alikvoti su profiltrirani kroz
membranske filtere (pore veličine 50 μm) i
razblaženi metanolom (25 μl filtrata sa 25 ml
metanola).
Ovako pripremani uzorci korišteni su u analizi.
Ukupno je analizirano 9 uzoraka i svaki uzorak
mjeren je u triplikatu.
 Mjerenje uzoraka
U magnetnu separacionu posudu poredane su numerisane kivete
sa po 200 μl prethodno pripremljenih uzoraka, nultim
diluentom, standardnim rastvorima i kontrolnim rastvorom.
Zatim je u svaku kivetu dodano po 250 μl rastvora enzim
konjugata i 500 μl rastvora antitijela (At) sa magnetnim
česticama.
Nakon mješanja i inkubacije od 15 minuta na sobnoj
temperaturi, dekantiranjem je uklonjen rastvor iznad
sedimentiranih magnetnih čestica. Nakon ispiranja dodatkom
2 x 1 ml rastvora za ispiranje i dekantiranja sadržaja u kiveti,
dodano je 500 μl rastvora za razvijanje boje.
Nakon inkubacije od 20 minuta na sobnoj temperaturi dodatkom
500 μl rastvora 2M sulfatne kiseline prekinuta je reakcija.
Ovako pripremljenim rastvorima izmjerena je apsorbansa na
450 nm.
 Reagensi
Standardi: standardi PCB-a (izraženi kao Arohlor 1254) u rastvoru
pufera:
standard 1-koncentracija 0,25 ppb
standard 2-koncentracija 0,50 ppb
standard 3-koncentracija 1,00 ppb
standard 4-koncentracija 2,50 ppb
standard 5-koncentracija 3,75 ppb
standard 6-koncentracija 5,00 ppb
kontrola: približne koncentracije 3,00 ppb PCB-a (izraženo kao Arohlor 1254) u
rastvoru pufera
• rastvor At sa paramagnetnim česticama
• rastvor enzim konjugata
• diluent/nulti standard
• rastvor za razvijanje boje (hidrogen peroksid i 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin u
organskoj bazi)
• rastvor za zaustavljanje reakcije (2M sulfatna kiselina)
• rastvor za ispiranje (dejonizovana voda)
Svi reagensi korišteni u radu dio su kita proizvođača Strategic Diagnostic Inc.
 Logit B/Bo izračunat je prema slijedećem izrazu:

Logit B/Bo=log

Gdje je Ao srednja vrijednost apsorbance za

negativnu kontrolu,
a A je srednja vrijednost aposrbance za
standard/uzorak.
 Apsorbanca
A (srednja S(standardna
% CV (koeficijent
Uzorak vrijednost tri devijacija za tri
1 2 3 varijacije)
mjerenje mjerenje mjerenje mjerenja) mjerenja)

negativna
1,000 1,000 1,000 1,000 0 0
kontrola
St. 1 0,906 0,908 0,909 0,908 0,001528 0,168291

St. 2 0,809 0,807 0,806 0,807 0,001528 0,189206

St. 3 0,633 0,627 0,626 0,629 0,003786 0,602217

St. 4 0,523 0,516 0,518 0,519 0,003606 0,694711

St. 5 0,417 0,423 0,419 0,420 0,003055 0,727971

St. 6 0,394 0,396 0,390 0,393 0,003055 0,776708

Kontrola 0,392 0,402 0,391 0,395 0,006083 1,539940

Uz A-pov 0,922 0,926 0,920 0,923 0,003055 0,331111

Uz A- sre 0,919 0,921 0,929 0,923 0,005292 0,573294

Uz A-dub 0,921 0,920 0,922 0,921 0,001000 0,108578

Uz B-pov 0,850 0,853 0,851 0,851 0,001528 0,179427

Uz B- sre 0,892 0,882 0,877 0,885 0,006429 0,726726

Uz B-dub 0,874 0,882 0,877 0,877 0,004041 0,460477

Uz C-pov 0,799 0,811 0,811 0,807 0,006928 0,858513

Uz C- sre 0,831 0,816 0,794 0,813 0,018610 2,287181

Uz C-dub 0,616 0,617 0,619 0,617 0,001528 0,247439

 Zadatak:
Na osnovu izmjerenih apsorbanci,
nacrtati standardnu krivu i odrediti
sadržaj PCB u ispitivanim uzorcima
(izraženo u ng/kg uzorka).