Analitičke metode

u kliničkoj/medicinskoj bihemiji
Najčešće korišćene analitičke
metode:

 Fotometrija
 Fluorometrija, nefelometrija i turbidimerija
 Elektroforeza
 Elektrohemija
 Osmometrija
 Hromatografija
 Radioaktivnost i njeno merenje
 Masena spektrometrija
 Imunohemijske metode
 Fotometrija

• Metoda koja koristi merenje jačine svetlosti propuštene

kroz rastvor i izvodi se na aparatu koji se naziva
FOTOMETAR.

• Najčešće korišćena analitička metoda za određivanje

koncentracije sastojaka telesne tečnosti na osnovu
razlike u intenzitetu emitovane monohromatske i svetlosti
propuštene kroz rastvor.

I0 I
 Fotometrija

• Intenzitet upadnog zraka svetlosti je VEĆI od intenziteta

propuštenog zraka svetlosti zbog APSORPCIJE svetlosti
od strane molekula rastvora.

• Molekuli prisutni u rastvoru prelaze u EKSCITIRANO ili

pobuđeno stanje.

I0 I

I0 > I
 Fotometrija

• Koncentracija supstance u rastvoru fotometrijski se može

odrediti samo u slučaju:
• da je supstanca u rastvoru obojena
• da supstanca u rastvoru gradi obojeno jedinjenje sa
reagensom.

• Bojeni rastvori APSORBUJU svetlo

PROPORCIONALNO intenzitetu boje, a intenzitet boje
zavisi od KONCENTRACIJE supstance u rastvoru!!!
 Fotometrija

• Transmisija ili transparencija je sposobsnost

OBOJENIH rastvora da APSORBUJU svetlost određene
talasne dužine.
I
T = ---------
I0

•TRANSMISIJA je odnos intenziteta UPADNE i

PROPUŠTENE svetlosti.
 Fotometrija

•APSORBANCA ili EKSTINKCIJA se izražava kao negativan

logaritam transmisije.
A = - log T
•APSORBANCA je BEZDIMENZIONALNA veličina koja se
očitava na fotometru kao brojna vrednost.
 Fotometrija – osnovni zakon

Lamber - Berov zakon:

“Intezitet monohromatske svetlosti prilikom prolaska kroz

određeni rastvor opada eksponencijalno sa dužinom
pređenog puta kroz rastvor i porastom koncentracije
molekula koji apsorbuju svetlost u rastvoru”

A = K x c x 1
K = molarni apsorpcioni koeficijent za supstancu koju
određujemo
c = koncentracija ispitivane supstance u rastvoru
1 = dužina pređenog puta svetlosti je 1cm (širina kivete)
 Fotometrija

•Koncentracija supstanci u rastvoru se određuje samo kod

onih supstanci koje mogu da APSORBUJU svetlost (obojene
supstance).

• Svaka supstanca pokazuje MAKSIMUM APSORPCIJE

svetlosti SAMO na jednoj ili više talasnih dužina.

• Dva osnovna tipa fotometrije:

• kolorimetrija
• spektrofotometrija
 Fotometrija
-Kolorimetrija-

•Metoda kojom se određuje koncentracija neke supstance

u rastvoru poređenjem sa bojom rastvora poznate
koncentracije te supstance na aparatu koji se naziva
KOLORIMETAR.

1. Izvor svetlosti, 2. Filter, 3. Optička

ćelija, 4. Fotoosetljiva ćelija, 5. Merač
 Fotometrija
-Kolorimetrija-

 Za izdvajanje svetlosti određenih talasnih dužina kod

kolorimetra koristimo filtere određene boje.
 Boja filtera treba da bude KOMPLEMENTARNA boji
rastvora koji ispitujemo.
 Fotometrija
-Kolorimetrija-

• Kolorimetar izdvaja svetlost određenih talasnih dužina

iz polihromatske (bele) svetlosti pomoću odgovarajućih
filtera.
• Opseg talasnih dužina svetlosti izdvojenih jednim
filterom je veliki, tako da ne možemo upoređivati
dva jedinjenja koja apsorbuju svetlost u uskim granicama
talasnih dužina.
Ako merimo apsorbancu ŽUT-om rastvoru,
boja filtera koji biramo može biti:

 Crvena
 Žuta
 Zelena
 Narandžasta
 Plava
 ljubičasta
 Fotometrija
- Spektrofotometrija -

• Metoda određivanja količine apsorbovane svetlosti

aparatom koji se naziva SPEKTROFOTOMETAR.

1. Izvor svetlosti, 2. Monohromator, 3. Kvarcno ogledalo,

4. i 5. Kvarcne ćelije, 6. Pretvarač svetlosti u električnu
7. Upoređivač, 8. Pokazivač rezultata
 Fotometrija
-spektrofotometrija-

• Svetlost u spektrofotometru prolazi kroz prizmu ili

optičku rešetku.
• Svetlost se dodatno razlaže prema talasnim dužinama
dajući monohromatsku svetlost koja se meri u uskim
granicama talasnih dužina.

• Možemo upoređivati dva jedinjenja koja apsorbuju

svetlost u uskim granicama talasnih dužina.
Shema spektrofotometra
Shema spektrofotometra
Izvori svetlosti - lampe

 Za vidljivi, VIS deo spektra

koriste se volframove lampe
(360 – 950nm)

 Za ultraljibičasti, UV deo spektra

koriste se deuterijumske i vodonične lampe
(190 – 420nm) i živine cevi za dobijanje
linijskih spektara
Monohromator

 Od polihromatske svetlosti treba da se

izdvoji monohromatska svetlost.

 Monohromator se sastoji od:

 Ulaznog i izlaznog razreza
 Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)
 Disperzionog elementa: prizma ili difrakciona
rešetka.
Disperzioni elementi
Kivete

 Staklene za VIS oblast spektra

 Kvarcne za UV oblast spektra
 Najčešće prečnika 1cm (dužina optičkog puta)
Kivete
 Fotometrija

• SLEPA PROBA

•Da bi bili sigurni da ostala jedinjena prisutna u rastvoru

zajedno sa ispitivanom supstancom ne apsorbuju svetlost
iste talasne dužine koristi se slepa proba (SP).

• SP je rastvor u koji smo dodali sva jedinjenja kao i u

ispitivani rastvor sem ispitivane supstance čiju
koncentraciju određujemo.

• Prema slepoj probi podešava se minimum apsorbcije,

tj. maksimum propuštene svetlosti.
 Fotometrija

Standardni rastvori

• Da bi se izračunala koncentracija neke supstance u

uzorku telesne tečnosti koristimo standarni rastvor
te iste supstance poznate koncentracije.

A uzorka
C uzorka = ----------- x C standarda
A standarda
 Fotometrija

Standardna kriva

• Da bi se odredila zavisnost koncentracije supstance

od apsorbance prvo se konstruiše standardna ili
kalibraciona kriva.

• Kriva se konstruiše određivanjem apsorbanci u 5-10

rastvora poznatih koncentracija i nanošenjem vrednosti
koncetracija na X osu, a vrednosti apsorbanci istih
koncentracija na Y osu.
 Fotometrija

Dve posebne vrste fotometrije su:

• PLAMENA EMISIONA FOTOMETRIJA (kvantitativno

određivanje natrijuma i kalijuma u telesnim tečnostima).

• ATOMSKA APSORPCIONA SPEKTROFOTOMETRIJA

(određuje koncentraciju elemenata u telesnim tečnostima).

Atomi se ne ekscitiraju kao kod plamene metode,

već se odvajaju od svojih hemijskih veza i ostaju u
neekscitiranom stanju.
 Fluorometrija, nefelometrija i
turbidimerija
 FLUORESCENCIJA
 Interakcija zračne energije sa molekulima ili česticama u rastvoru
može da dovede do fluorescencije ili svetlosnog rasejanja.
 Nastaje kada molekul tj. Fluorofora apsorbuje svetlost jedne
talasne dužine (λ) a zatim je re-emituje na dužoj tj.većoj talasnoj
dužini.
 Kao rezultat, emitovana fluorescentna svetlost ima manju E a veću
talasnu dužinu.
 Razlika između max λ pobuđujuće svetlosti i max λ emitovane
fluorescentne svetlosti predstavlja konstantu koja se označava kao
*Stouks-ov pomak*.
 Ova konstanta je mera gubitka energije u toku trajanja pobuđenog
stanja pre povratka u osnovno singlet stanje.
 Emisija fluorescentne svetlosti se karakteriše brzim (10-8s)
vremenom gašenja.
 Priroda fluorescencije

 LUMINISCENCIJA je emitovanje evetlosne ili zračne energije pri ćemu

se elektroni vraćaju sa ekscitovanog (pobuđenog) ili visoko-
energetskog nivoa na niži energetski nivo.
 Vrste luminiscentnog fenomena uključuju:
 Fluorescenciju
 Fosforescenciju
 Hemiluminiscenciju
 Iako se ovi fenomeni razlikuju u načinu na koji se elektroni prevode u
pobuđeno stanje, oni daju slične emisije zračne energije.
 Fluorescentna luminiscencija i fosforescentna luminiscencija nastaju
kada molekul apsorbuje zračnu energiju.
 Molekuli apsorbuju svetlosnu energiju u diskretnim jedinicama ili
kvantima.
 Energija kvanta svetlosti izražena je formulom E=hν ili E=hc/λ,
gde je E – enegija, h je Plankova konstanta, c – brzina
svetlosti, ν je frekvecija a λ je talasna dužina.
 Priroda fluorescencije

 FOSFORESCENCIJA pokazuje veći pomak u talasnoj dužini emitovane

svetlosti nego što je to kod fluorescencije, a vreme gašenja
fosforescentne emisije traje duže (10-4 – 100s) nego kod fluorescentne
emisije.
 HEMILUMINISCENCIJA i BIOLUMINISCENCIJA
 U ovim pojavama pobuđivanje elektrona je izazvano hemijskom reakcijom.

 Hemiluminiscencija – dolazi do oksidacije organskog jedinjenja

(luminol) oksidantom (H2O2, hipohlorit, O2), a energija svetlosti se javlja
iz pobuđenog produkta dobijenog u hemijskoj reakciji.
 Bioluminiscencija – poseban oblik hemiluminiscencije; u biološkim
sistemima kod kojih postoji katalitički enzim *luciferaza* koji svojim
dejstvom povećava efikasnost luminiscentne reakcije.
 Ove analize imaju veću osetljivost nego većina direktnih
fluorescentnih analiza.
Analiti koji se određuju fluorescencijom

 BIOHEMIJSKI MARKERI:  ENZIMI:

 Glukoza  Oksidoreduktaze
 Bilirubin  Hidrolaze:
 Protoporfirin  Glukozidaze
 Magnezijum  Proteaze
 Kalcijum
 Kateholamini  TERAPEUTSKI LEKOVI:
 Žučne kiseline  Fenitoin
 Fenobarbital
 NEKI MARKERI  Amikacin
KOAGULACIJE:  Tobramicin
 Heparin  Gentamicin
 Antitrombin III  Teofilin
 Plazminogen  primidon
NEFELOMETRIJSKO I TURBIDIMETRIJSKO
MERENJE RASUTE SVETLOSTI

 TURBIDITET – zamućenje ili mutnoća. Osobina

fluida (tečnosti i gasova) koja opisuje prisustvo
suspendovanih ili koloidnih supstanci u rastvoru.
 Izaziva slabljenje (smanjenje) intenziteta upadnog zraka svetlosti pri
prolazu kroz rastvor sa česticama.
 Merenje smanjenja intenziteta upadnog svetlosnog zraka izazvanog
rasipanjem, odbijanjem i apsorpcijom svetlosti naziva se
TURBIDIMETRIJA.
 Jedinice u kojima se izražava zamućenje su NTU (engl
( . Nephelometric
Turbidity Units), FTU (engl. Formazine Turbidity Units). 
NEFELOMETRIJSKO I TURBIDIMETRIJSKO
MERENJE RASUTE SVETLOSTI

 NEFELOMETRIJA – je definisana kao detekcija

svetlosne energije rasute ili reflektovane ka
detektoru koji nije na direktnom putu
propuštene svetlosti.
 Opšti nefelometri mere rasipanje svetlosti pod
pravim uglom (90°) u odnosu na upadni zrak svetlosti.

 Ove metode najčešće se koriste za imunoodređivanja

imunoglobulina, proteina i lekova.
 Elektroforeza

 Elektroforeza se odnosi na kretanje naelektrisanih

rastvoraka ili čestica u tečnoj sredini pod uticajem
električnog polja.
 Iako se izraz elektroforeza koristi za opisivanje kretanja
svih vrsta čestica, upotreba izraza jontoforeza je
ograničena na kretanje malih jona pod uticajem električnog
polja.
 Najčešće se koristi za kvantitativno određivanje proteina u
serumu, urinu i likvoru.
 Metode koja se koriste za razdvajanje i kvantitativno
određivanje količine naelektrisanih čestica rastvorenih
supstanci pod uticajem električnog polja.
 Elektroforeza

•Brzina kretanja naelekrisanih čestica proteina u rastvoru

pod uticajem električnog polja zavisi od:

1. Neto naelektrisanja molekula proteina

2. Veličine i oblika molekula proteina
3. Jačine električnog polja
4. Viskoznosti medijuma u kome se molekuli kreću
Q

Kxrx

elektroforetska pokretljivost, Q = neto naelktrisanje, K= konstanta,

r = poluprečnik čestice,  = viskoznost medijuma
 Elektroforeza

Osnovni princip elektroforetskih metoda:

• Brzina naelektrisanih čestica u električnom polju

je direktno proporcionalna neto naelektrisanju
čestica, a obrnuto proporcionalna veličini čestica i
viskoznosti medijuma!
 Elektroforeza

- Zonska elektroforeza odnosi se na kretanje naelektrisanih

makromolekula u poroznoj osnovnoj sredini.

- Elektroforetske metode se mogu podeliti na osnovu vrste

medijuma u kome se čestice proteina kreću na:

• Elektroforeza na papiru
• Elektroforeza na agaroznom gelu
• Elektroforeza na celuloznom acetatu
• Elektroforeza na poliakrilamid gelu
• Elektroforeza na skrobnom gelu.
 Potenciometrija
 Potenciometrija predstavlja merenje razlike električnog
potencijala između dve elektrode u elektrohemijskoj ćeliji.
 Elektrohemijska (galvanska) ćelija se uvek sastoji od dve elektrode
(elektronski ili metalni provodnici) povezane elektrolitičkim rastvorom
(jonski provodnik).
 Elektroda ili polućelija se sastoji od metalnog provodnika koji je u
kontaktu sa elektrolitskom rastvorom.
 Jedan od elektrolitskih rastvora je nepoznat ili rastvor koji se ispituje;
može da se zameni odgovarajućim standardnim rastvorom u cilju
kalibracije aparature ili kontrole kvaliteta rada.
 Prema konvenciji LEVA elektroda je uvek referentna, dok je DESNA
elektroda indikatorska (za merenje).
 Merenje potencijala ćelije vrši se potenciometrom.
 Potenciometrija

 Metoda koja meri razlike u električnom potencijalu između

dve elektrode, omogućujući merenje pH telesnih tečnosti
kao i koncentraciju nekih elektrolita i metabolita.
 Direktno potenciometrijsko merenje u nerazblaženim i
nerazređenim uzorcima daje mogućnost određivanja
koncentracije slobodnih, nevezanih jona, ili aktivnosti jona.
 Aktivnost jona (a) jednaka je brojnoj vrednosti proizvoda
molaliteta slobodnih jona (m; mol/kg) i koeficijenta
aktivnosti (γ), a = m x γ.
 Ako se potenciometrijska merenje koriste za određivanje
koncentracije svih jona (i slobodnih i vezanih), uzorak mora
biti razređen odgovarajućim rastvaračem koji oslobađa
vezane jone iz njihovih vezujućih agenasa – indirektna
potenciometrija.
Gde se sve koriste principi
potenciometrijskih merenja
 redoks elektrode
• Inertne metalne elektrode
• Srebro/srebro-hloridna elektroda
 jon-selektivne membranske elektrode
 Staklene elektrode
• Vodonik-jon selektivne staklene elektrode
• Na+-selektivne elektrode
 Elektrode u čvrstom stanju
• Čvrsto-obrazovane membrane
• Homogene-membranske elektrode
 Jono-izmenjivačke elektrode
• Tečne jon-izmenjivačke membrane
• Kalijumova jon-selektivna membrana
• Amonijum jon-selektivna membrana
 gasne elektrode
 pCO2 elektroda
 NH3-gasna elektroda
 enzimske elektrode
 Osmometrija

 Metoda koja meri koncentraciju čestica koje

direktno utiču na osmotski pritisak u rastvoru.
 Osmotski pritisak usmerava kretanje vode (ili rastvarača) kroz
membranu koja razdvaja dva prostora.
 Membrane su polupropustljive, semipermeabilne – propuštaju samo
neke molekule ili jone.
 Membrane se mogu razlikovati po veličini pora i, samim tim, po
sposobnosti da razdvajaju molekule različitih veličina i oblika.
 Membrane koje propuštaju samo molekule vode označene su kao strogo
polupropustljive.
 Delimično polupropustljive su membrane koje pored molekula vode
propuštaju i male molekule i/ili jone.
 Osmoza

 Osmoza predstavlja difuziju
molekula rastvarača kroz polupropustljivu
membranu koja propušta molekule
rastvаrаčа аli ne propuštа molekule rаstvorene supstаnce.
 Osmoza se javlja kаd su koncentracije rastvora sa dvе stranе mеmbrаne
različitе.
 Pošto polupropustljiva membrana propuštа sаmo molekule rаstvаrаčа, аli
ne i čestice rastvorene supstance, dolazi do difuzije rastvarača kroz
membranu tj. molekuli rastvаrаčа prolaze kroz mеmbranu kako bi se
izjednаčilе koncеntrаcije rastvarača sа obe strane membrаne.
 Molekuli rastvarаčа se krеću iz srеdine sa manjom koncentracijom u
srеdinu sa većom koncеntracijom rastvorenih supstanci.
 Predstavlja vrstu pasivnog transporta.
 Osmoza,
osmotski pritisak

 Pri difuziji molekula rastvarača kroz membranu dolazi do

porasta nivoa tečnosti na jednoj strani membrane i
smanjenja nivoa tečnosti na drugoj strani membrane.
 Porast nivoa tečnosti na jednoj strani membrane stvara
hidrostatički pritisak koji se suprotstavlja osmozi tj.
osmotski pritisak koji deluje na membranu. Kada se ova dva
pritiska izjednače doći će do uspostavljanja ravnoteže i
proces difuzije tj. prelazak molekula vode (rastvarača) će se
završiti.
 Pritisak pri kome se uspostavlja ova ravnoteža se naziva
efektivni osmotski pritisak. Osmotski pritisak je veći što je
koncentracija rastvora veća i obrnuto.
 Osmoza

 U prirodi postoji više primera osmoze: kao što je uzimanje vode iz

zemljišta od strane biljaka ili ulaženje vode u ćeliju.

 Ako se ćelije nalaze u vodenom rastvoru, voda (koja u ćeliji vrši

funkciju rastvarača) će težiti da prođe kroz ćelijsku membranu u cilju
da se izjednače koncentracije sa obe strane membrane.
 Tako, ako ćeliju stavimo u hipotoničan rastvor (rastvor koji je manje
koncentracije u odnos na samu ćeliju) doći će do ulaženja vode u ćeliju,
do njenog bubrenja i prskanja.
 U hipertoničnom rastvoru (koncentrovaniji od rastvora u samoj ćeliji),
voda će izlaziti iz ćelije i ona će se smežurati.
 Zbog toga je veoma važno da se održava stalan osmotski pritisak,
odnosno količina vode u organizmu što se naziva osmoregulacija.

 Kod sisara se osmoregulacija vrši preko bubrega – višak vode

iz krvi prelazi u mokraću.
 Hromatografija

 Analitička metoda koja se koristi za

razdvajanje, identifikaciju i određivanje
različitih supstanci u telesnim
tečnostima na bazi njihovih različitih
adsorpcionih osobina.
 Masena spektrometrija
i imunohemijska analiza
Masena spektrometrija
• Metoda koja daje podatke o elementarnom sastavu
i strukturi organskih sastojaka telesnih tečnosti.

Imunohemijska analiza
• Metoda koja se zasniva na određivanju supstanci
telesnih tečnosti na bazi reakcije antigen-antitelo.