GASNA

HROMATOGRAFIJA
 Gasna hromatografija - GC
 GC je separaciona analitička metoda za razdvajanje
isparljivih supstanci iz smeše

 Princip razdvajanja zasniva se na raspodeli supstanci

iz smeše između mobilne i stacionarne faze

Stacionarna faza određuje:

1. Vrstu GC tehnike
2. Tip gasne hromatografije
 Gasna hromatografija - GC
 GC je metoda kojom se mešavina komponenata u isparljivom
obliku odvaja na svoje sastojke kretanjem MOBILNE FAZE
(GAS) preko nepokretne - stacionarne faze
 Pojedinačne komponente uzorka će pod kontrolisanim uslovima
biti prisutne delimično u pokretnoj a delimično u nepokretnoj
fazi u skladu sa PRITISKOM PARE
 Komponente sa visokim pritiskom pare (one koje brzo
isparavaju) biće brže eluirane nego neke druge sa manjim
pritiskom pare
 Ako neka komponenta ima selektivniju interakciju sa
stacionarnom fazom u odnosu na neku drugu komponentu,
razlika u eluciji i efikasnosti odvajanja će biti povećane
 Vrste i tipovi GC
 Gasno-čvrsta hromatografija (GSC) –
sorbent, stacionarna faza ČVRSTA (i široka
površina) a mobilna faza je gasovita

 Razdvajanje supstanci iz smeše zasniva

se na njihovom različitom afinitetu prema
adsorbensu (stacionarnoj fazi) i zbog toga
predstavlja tip ADSORPCIONE hromatografije
 Vrste i tipovi GC
 Gasno-tečna hromatografija (GLC) -
stacionarna faza je neisparljiva tečnost naneta na
inertni čvrsti nosač
 Razdvajanje supstanci iz smeše zasniva se na
njihovom različitom podeonom koeficijentu - Kp za
supstance iz smeše
 GLC je tip PODEONE hromatografije; ovde se
Kp odnosi SAMO NA STACIONARNU fazu i određuje
se na osnovu afiniteta supstance

 Mobilna faza i za GSC i za GLC je INERTNI GAS

(AZOT, HELIJUM ili ARGON), koji pod pritiskom
donosi smešu do kolone a zatim razdvojene
supstance prenosi u detektor koji je povezan sa
računarom i rekorderom – zato se zove NOSEĆI GAS
 Gasna hromatografija - princip
 Efluent iz kolone nosi
razdvojene sastojke iz
uzorka do detektora da bi
se eluirali

 Signal iz detektora, posle

umnožavanja ulazi u
rekroder gde se beleži

 Grafički prikaz je
HROMATOGRAM –
osnovna ravna linija sa
brojnim pikovima, po
jedan pik za svaku
komponentu uzorka
 Gasna hromatografija - princip
 Vreme zadržavanja,
RETENCIONO vreme – vreme
proteklo između ubrizgavanja
uzorka i pojave maksimalnog pika
na detektoru je karakteristična
osobina za svaku komponentu u
2.regulator pritiska određenom sistemu
 TR – retenciono vreme je sredstvo
1.boca sa gasom
za kvalitativnu identifikaciju
3.Uzorak 4. injektor
 Veličina pika (površina ili visina)
proporcionalna je količini
komponente – sredstvo za
5. Kolona 6. termostat kvantitativno određivanje
7. Detektor 8. PC 9. štampač komponenti
Pojmovi u gasnoj hromatografiji
 Razdvajanje supstanci
Razdvajanje supstanci u GLC i GSC zavisi od:
1. Fizičko-hemijskih osobina supstanci
2. Od fizičkih osobina stacionarne faze
3. Vrste i efikasnosti kolone

• Razdvajanje se odvija na koloni a glavni pokazatelj

efikasnosti kolone je N - broj teoretskih platoa
kolone
• Efikasnije su kolone sa većim brojem teoretskih
platoa
• N se izračunava na osnovu eksperimentalnog
hromatograma uz prethodno izračunavanje
retencionih parametara
Izračunavanje broja teoretskih platoa N kod
gasno-hromatografske kolone

W
 GC sistem
 U GC sistemu gas protiče pod pritiskom
 Protok F je zapremina gasa koja prođe kroz kolonu u
jedinici vremena (cm3/min; mL/min)
 Interval vremena koji protekne između iniciranja
uzorka i eluiranja centra zone ili maksimuma pika je
RETENCIONO VREME - tR
 Zapremina gasa potrebna za eluiranje maksimuma
zone je retenciona zapremina - VR
 Efikasnost kolone se može porediti pomoću HETP
vrednosti (L/N – L dužina kolone i N broj teoretskih
platoa) osim ovog parametra na efikasnost kolone
utiču oblik i veličina čestica čvrstog nosača
 Razdvajanje supstanci GLC
tehnikom
Nakon prevođenja uzorka u gasovito stanje
smeša ispitivanih supstanci ulazi u kolonu gde se
supstance rastvaraju u tečnoj stacionarnoj fazi

 Razdvajanje supstanci zavisi od:

1. Napona pare supstance
2. Intermolekulskih sila koje utiču na rastvorljivost
 Henrijev zakon
• Odnos napona pare i koncentracije supstance u
tečnoj stacionarnoj fazi definisana je

Henrijevim zakonom
p - parcijalni pritisak supstance x
p0 - napon pare čiste supstance x
γ - koeficijent aktiviteta koji je u funkciji od x

Kod veoma malih koncentracija supstance koeficijent aktiviteta je

veoma važna konstanta pod uslovom da je p0 konstantno
 Podeoni koeficijent, Kp u gasnoj
hromatografiji

• Razdvajanje supstanci odvija se na bazi njihovih različitih

podeonih koeficijenata

• Veća razlika u podeonim koeficijentima uslovljava bolje

razdvajanje kao i upotrebu kraće kolone

• Efikasnost tečne stacionarne faze može se odrediti preko

relativne retencije koja predstavlja odnos podeonih
koeficijenata supstanci koje se razdvajaju: α=KB/KA
Efikasnost stacionarne faze
izražene preko retencije
 Rezolucija

Tačna procena razdvajanja supstanci iz smeše vrši

se na osnovu izračunavanja njihove rezolucije R
 Preanalitička ispitivanja u GC
Za izvođenje GLC potrebno je odrediti:
1. Rezoluciju kojom se postiže potpuno i brzo
razdvajanje
2. Optimalnu brzinu (v) protoka mobilne faze (gasa)
3. Zapreminu (V) tečnosti stacionarne faze
4. Minimalno retenciono vreme (tR)
R - rezolucija, L-dužina kolone,
V - brzina proticanja gasa,
Vo - neretenciona zapremina
Ws - odmerena količina tečne
stacionarne faze
 Retencioni parametri
 Retencioni parametri koji se koriste u GLC analizi su
retenciono vreme i zapremina
 Retenciono vreme predstavlja vreme potrebno da se
eluira maksimum zone, mereno od vremena
ubacivanja smeše
 Retenciono vreme je direktno proporcionalno dužini
kolone, a obrnuto proporcionalno brzini proticanja
gasa
 Retenciono vreme opada ako se smanji količina
stacionarne faze
VR=Fc x tR Fc – protok gasa u koloni
 Pritisak gasa u koloni
 Pritisak gasa na ulazu u kolonu je VEĆI od pritiska na
izlazu iz kolone
 Zapremina na ulazu u kolonu je manja a veća na
izlazu iz kolone
 Zbog toga se izračunava srednja vrednost VR
 To se postiže izračunavanjem faktora stišljivosti (j)
za gradijent pritiska u koloni

Pi- ulazni pritisak

Po- izlazni pritisak
 Retenciona zapremina

Sve retencione zapremine zavise od količine tečne

stacionarne faze
Iz tog razloga ČISTA retenciona zapremina (VN) se
koristi za izračunavanje SPECIFIČNE retencione
zapremine Vg:

Ws –odmerena količina stacionarne faze u koloni

Ta – temperatura ambijenta (sobna)
Tc – temperatura kolone
Instrumentalni gasno-hromatografski
sistem
 Noseći gas
 Noseći gas je hemijski inertan i prema uzorku i prema
tečnoj stacionarnoj fazi
 Izbor mobilne faze vrši se na osnovu efikasnosti GC i
osobina detektora. Najčešće se koriste AZOT i
HELIJUM
Detektor Noseći gas
Termokonduktivni detektor Helijum, vodonik,
argon, azot.
Plameno-jonizacioni detektor Azot

Elektron – hvatajući detektor Azot

 Noseći gas
Noseći gas koji se unosi u GC sistem mora da ima:
1. Visoki stepen čistoće (bez prisustva H2O i O2)
2. Konstantan pritisak
3. Konstantan protok
4. Konstantnu temperaturu injektora kolone i detektora
• Sa povećanjem t° smanjuje se viskozitet gasa, a samim tim
dolazi do promene u brzini protoka gasa
• Kod novih sistema postoji elektronska kontrola protoka gasa
pomoću koje se setuje određen protok i održava se
• Kod starih sistema nemamo mogućnosti za ovakav način
održavanja protoka; znamo samo koliki je ulazni pritisak, a na kraju
detektora se nalazi vodeni stub hvatač gasa, pa merenjem brzine
kretanja mehura gasa određujemo protok gasa u GC sistemu
 Injektor
 Način unošenja uzorka zavisi od agregatnog stanja
uzorka. Temperatura u injektoru je za 50°C > u
odnosu na t° kolone
 Mikrošpricem se ubacuje uzorak u injektor kroz
termostabilnu gumenu barijeru
 Čvrsti uzorci, tečnosti velikog viskoziteta unose se GC
sistem pomoću specijalnih aluminijumskih i staklenih
kapsula. Ova kapsula se ubacuje u specijalni dodatak
na koloni u kome se pod uticajem temperature otvara
a uzorak prelazi u gasovito stanje
 GC kolone
 Kolona je jedna od najbitnijih delova GC sistema

 Na izbor kolone osim fizičko-hemijskih osobina

uzorka utiču:
1. Vrsta materijala cevi kolone
2. Vrsta čvrstog nosača (adsorbensa)
3. Dužina kolone
4. Prečnik kolone
5. % i vrsta tečne stacionarne faze
6. Temperatura kolone
 GC kolone
Vrste kolona:
1. ANALITIČKE (PAKOVANE) KOLONE
2. PREPARATIVNE (PAKOVANE) KOLONE
3. KAPILARNE (NEPAKOVANE) KOLONE
• Analitičke kolone se koriste za razdvajanje, kvalitativnu i
kvantitativnu analizu supstanci neke smeše
• Preparativne se koriste za razdvajanje i sakupljanje
većih količina pojedinih supstanci neke smeše
• Kapilarne kolone se koriste kada je potrebno da se
razdvoje izomeri jedne supstance ili supstance sa
bliskim tačkama ključanja (u ovim kolonama se postiže
visoka rezolucija)
 GC kolone
 Na osnovu materijala od koga su izrađene
kolone se dele na:
1. Staklene
2. Čelične
3. Teflonske
4. Aluminijumske
5. Bakarne

Staklene kolone se retko koriste jer nisu otporne na

visok pritisak i temperaturu
 Nosač stacionarne faze

Uslovi koje treba da zadovolji nosač stacionarne faze su:

1. Da stvara tanak film stacionarne faze na svojoj

površini
2. Da su čestice adsorbensa male (tj. da imaju veliku
površinu)
3. Da su čestice uniformne po obliku i prečniku
4. Da bude inertan (da nema hemijskih reakcija sa
stacionarnom i mobilnom fazom niti sa
supstancama iz smeše)
 Nosač stacionarne faze
• Najčešće se koriste nosači koji potiču od diatomejske zemlje
koji su poznati pod nazivom Chromosorb A,Chromosorb G,
Chromosorb P i Chromosorb W.
Pored ovih noisača mogu se koristiti i neki polimeri (Teflon t-6),
staklene kuglice i drugo
 Klasifikacija stacionarnih faza
 Za klasifikaciju stacionarnih faza prema
polarnosti upotrebljavaju se test supstance:
1. Benzen
2. 1-butanol
3. Penten2-on (2-pentanon)
4. Nitropropan
5. Piridin

Navedene supstance se testiraju na ispitivanoj

stacionarnoj fazi a zatim na standardnoj
stacionarnoj fazi (skvalen)
 Klasifikacija stacionarnih faza
__________

_____________________
McReynoldova konstanta
 Uticaj temperature
 Na podeoni koeficijent - Kp utiče i temperatura kolone
Sa povećanjem temperature smanjuje se Kp
vrednost pojedinih supstanci jer se time povećava
koncentracija uzorka u gasnoj fazi
 Smanjuje se retenciono vreme i rezolucija
supstanci iz razloga što uzorak provodi kraće vreme
u koloni
 Izbor temperature u koloni treba da omogući dobru
rezoluciju (R≥1.5) u što kraćem vremenu
 Temperatura može da se povećava samo do
određene granice jer može da dođe do isparavanja
stacionarne faze i degradacije supstanci
 Detektori
 Razdvojene supstance nošene gasom dolaze u
detektor
 Detekcija zona bazira se na fizičkim i hemijskim
osobinama eluiranih supstanci
 Na osnovu načina merenja detektori se dele na:

1. Diferencijalne
2. Integralne

Najčešće se koriste katarometar, plameno-jonizacioni

detektor, elektron hvatajući detektor i spektro-
fotometrijski detektor
 Toplotni konduktivni detektor TC
 TC detektor ili KATAROMETAR radi na principu
merenja razlika u toplotnoj provodljivosti čistog gasa i
gasa sa eluiranom supstancom pošto napusti kolonu
 Sastoji se od jednog metalnog bloka sa četiri otvora u
kojima se nalaze volframove žice koje su zagrejane
iznad temperature bloka
 Stepen hlađenja volframove žice je u direktnoj
srazmeri sa sastavom gasne smeše. Promena
temperature volframove žice dovodi do promene
otpora koji se pretvara u električni signal pomoću
Vitsonovog mosta
 Noseći gas – HELIJUM, vodonik, ređe azot
 Plameno-jonizacioni detektori (FID)
 FID detektori imaju veliku primenu, primenjuju se kod
uzoraka organskog porekla
 Rad ovih detektora zasniva se na električnoj
provodljivosti gasova koja zavisi od broja jonizovanih
čestica u gasu
 Uzorak koji pređe preko plamenika se zapali i dolazi do njegove
jonizacije pri čemu je povećanje električne provodljivosti
direktno srazmerno koncentraciji uzorka u nosećem gasu
 Odgovor FID detektora zavisi od broja ugljenikovih atoma u
molekulu i on je slabiji ako su prisutni kiseonik i azot
 Ovi detektori su veoma osetljivi i univerzalni
 Alkalni FID detektori spadaju u ovu grupu (koriste se u analizi
pesticida)
Elektron – hvatajući detektori (ECD)
 Rad ECD detektora se zasniva na reakciji
slobodnih elektrona (koji nastaju jonizacijom
nosećeg gasa) i gasovite supstance koja ima
afinitet prema elektronima
 Nastali anjoni analizirane supstance reaguju sa
katjonima gasa i smanjuje se protok jona kroz
detektor što se registruje
 ECD detektor se koristi za supstance koje
sadrže halogene, nitro grupu ili karbonilnu grupu
 Primena GC metoda

 Prednosti u odnosu na tečnu hromatografiju:

1. Ekonomičnija
2. Brža
3. Osetljivija
4. Koriste se inertni gasovi (nema organskih rastvarača)
5. Mogu se određivati homolozi ili optički izomeri

Koristi se i u kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi

 Kvantitativna analiza
 Koristi se za određivanje sadržaja aktivnih
komponenti ili za određivanje stepena čistoće ispitivanih
supstanci
 Normalizacija površina je metoda kojom se može

odrediti procentualni odnos pojedinih supstanci u

analiziranom uzorku
 Mere se površine svih pikova u GLC hromatogramu, a
zatim se površine pojedinačnih pikova dele sa ukupnom
površinom svih pikova
 Kvantitativna analiza
 Pošto odgovor detektora najčešće nije isti za sve supstance iz
smeše određuje se korekcioni faktor koji se može izračunavati
pomoću internog standarda
 Kvantitativna analiza
 Kada se određuje dozirani oblik sa deklarisanom
koncentracijom aktivnih supstanci u smeši koristimo
odgovarajuće kalibracione krive
 Kalibraciona kriva se konstruiše posebno za svaku
supstancu iz smeše na osnovu odnosa koncentracije i
površine (visine) pika
 Moguće je raditi i skraćenim postupkom kada se
napravi standard u deklarisanoj koncentraciji koja
iznosi 100% i uzorak i standard se analiziraju istim
GLC postupkom
 Kvalitativna analiza
 Kvalitativna analiza može biti indirektna i direktna u
zavisnosti od toga da li su ispitivane supstance
dobro isparljive
 Direktna GLC identifikacija se vrši pomoću
retencionih parametara
 Indirektna GLC identifikacija se zasniva na
modifikacijama analiziranih supstanci
 Modifikacije koje se izvode su:
1. Reakcija sa hemijskim agensima da se dobiju
isparljiva jedinjenja
2. Pirolitička degradacija (600°C)
3. Fotodegradacija (UV/VIS zračenje)