Molecular adaptations of TIMs to extreme temperatures

Marco Antonio Alvarez Santana

Tesis de Doctorado
Université de Liege, Belgique
 pH
La vida está presente sobre toda la superficie de la tierra

Salinidad Presión

Lago Nukuru (pH~10) Lagos sulfuroso (pH~1)

Lagos salados (3-30% NaCl ) Fondo del océano ( 0,1-120 MPa)

 Temperatura

-Geysers (T ~100°C) -Los mares polares (T ~ 0°C)

-Volcanes submarinos -Las calotas glaciares
-Aguas termales -La profundidad de los océanos
 Los microorganismos adaptados a la temperatura se clasifican en 4 grupos

100 100 100 100

Hipertermófilos
y termófilos
50 50 50 50

Mesófilos
Psychrotrofos
0 Psychrofilos 0 0 0

< 15 °C 20-30 °C 20-45 °C > 50 °C

Cómo pueden ellos adaptarse a condiciones extremas de temperatura?

Las estrategias de adaptación propuestas son:

1) Una adaptación por vía de ligandos

específicos o de solutos compatibles.

2) Un aumento en la velocidad de síntesis v/s la

velocidad de degradación de proteínas(turnover).

3)3) Una adaptación

Una adaptación intrínseca
intrínseca de de
las proteínas de la célula
las proteínas de la célula
 Cuáles son las reglas moleculares que dirigen el proceso de
termoadaptación de las proteínas?

Estudio comparativo de estructuras primarias

-uso prferencial de un aminoácido

Preferencia de residuos en α -hélices de proteínas termófilas

Análisis de estructuras secundarias
Argos (1979) Menendez (1989) Warren (1995)

-preferencia de un aminoácido A A Y
-motivos E R G
Q
V
P

Estudio de estructuras terciarias

-interacciones (puente de H, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, etc).
-densidad del packing hidrofóbico Bohm y Jaenicke (1994)
 El modelo de estudio:

Triosafosfato isomerasa (TIM)

1) « El catalizador perfecto » (Albery y Knowles, 1976)

2) La proteína de referencia del motivo de plegamiento « α/β barrel »

Las estructuras 3D de TIMs conocidas : TIM Referencia

Chicken Banner et al, 1975
Yeast Lolis et al, 1990
T.brucei Wierenga et al, 1991
E.coli Noble et al, 1993
Human Mande et al, 1994
B.stearo Delboni et al, 1995
P.falciparum Velanker et al, 1997
T.cruzei Maldonado et al, 1998
L.mexicana Williams et al, 1999
 glucose
ATP
ADP
glucose-6-phosphate

fructose-6-phosphate
ATP
ADP

fructose-1,6-biphosphate

Dihydroxyacetone phosphate D-glyceraldehyde-3-phosphate

TIM NAD
Pi
NADH

Metabolismo lipídico 1,3-bisphosphoglycerate

ADP
ATP

3-phosphoglycerate

-La TIM es una enzima central de la vía glicolítica 2-phosphoglycerate

H2O
phosphoenolpyruvate
ADP
ATP

pyruvate
 La TIM cataliza la interconversión de DHAP en GAP

B-
B B-
H
H
H H
OH
H
OH H O
A
HA
O O OH OH
O O
HA

P P P

Dihidroxiacetona fosfato enediol Gliceraldehido fosfato

(DHAP) (GAP)
 La estructura de la TIM

-La TIM es un dímero (~56 kDa) compuesta de 2 subunidades idénticas.

-Cada monómero adopta una estructura tridimensional de tipo « barril α/β ».
 La estructura barril α /β de la TIM

α6
α7 α5
β7 β6
β8 β5
α8
β1
β4 α4
β2
β3
α1
α2 α3
 El sitio activo de la TIM

Loop flexible Glu

His
Lys
Loop interfase

Helice de unión
del grupo fosfato
 Microorganismos modelos:
rya
Plants

ca
Animals
Fungi

Eu
Flagelates
Ciliates
Microsporids
Slime molds
Diplomonads

Thermotoga maritima bacterium.

ia
Topt: ~ 80°C ter Green non-sulfur
A rc
ha
c
bacteria Sulfolobus

Ba Desulfurococcus

ea
Vibrionaceae
Proteobacteria Gram Positives
Pyrodictium Thermoproteus

Pyrococcus Methanobacteria
Thermotoga
Cyanobacteria Thermotogales Methanothermus

Archaeglobus
Flavobacteria

Halobacteria

Methanopyrus

Aquifex Mc. jannaschii Methanoplanus

Methanosarcina
Mc. thermolithotrophicus
Mc. vanniellii

Vibrio marinus bacterium. LUCA

Topt: ~ 15°C
 Objetivos del trabajo

Estudio de las adaptaciones moleculares de proteínas a temperaturas extremas

-Modelo de estudio:
Triosafosfato isomerasa proveniente de una especie psychrofila (Vibrio marinus)
y de una especie hipertermófila (Thermotoga maritima).

-Producción de proteínas :
Aislamiento de genes codificantes para VmTIM y TmTIM
Construcción de vectores de expresión.
Producción, purificación y caracterización de las enzimas recombinantes.

-Determinación de estructuras tridimensionales de ambas proteínas.

-Análisis de factores moleculares responsables de la adaptación

a temperaturas extremas.
Clonaje, expresión y purificación de VmTIM y TmTIM

M
M

TI
TI

m
Tm

M.M.
V

Rendimientos:

V.marinus TIM: 80 mg proteína pura / lt de cultivo

T.maritima TIM: 50 mg proteína pura / lt de cultivo

 Estudio de la adaptación molecular de VmTIM a bajas temperaturas

Caracterización:

Microcalorimetría (DSC)
Medida de la inactivación por temperatura:
Temperatura (°C) Kinact (sec-1)
Td: 40.8°C
5°C <5.0x10-5
10°C <5.0x10-5
15°C 2.4x10-4
20°C 3.8x10-4

Cp (kcal/mol/°C)
25°C 1.0x10-3

T 1/2 = 10 min (25°C)

VmTIM posee una mutación puntual en la « hélice de unión al grupo fosfato »

E.coliTIM 212…………IDGALVGGASLKADAFAV……
V.marTIM …………IDGALVGGAALDAKSFAA……
MoraxTIM …………IDGALVGGASLKADSFLT……
T.marTIM …………IDGGLVGGASLK.ESFIE……
BacillTIM …………IDGPLVGGASLEPASFLQ……
P.B.H.
 Estudio del rol de Ala238 en VmTIM

Mutación : Ala238 Ser

Microcalorimetría (DSC)

Caracterización del mutante A238S:

Datos cinéticos
(10°C) Unidad VmTIM A238S
Km mM 1.9 + 0.2 4.8 + 0.6

Kcat min -1 4.2 + 0.1x105 2.8 + 0.1x105

Kcat/Km min –1 mol -1 2.2 + 0.2x105 0.6 + 0.06x105

Datos de estabilidad
T 1/2 min (25°C) 10 27

Conclusión:
-A238 asegura la actividad enzimática de VmTIM a bajas temperaturas
-Serina estabiliza la estructura de VmTIM
 La estructura tridimensional de VmTIM

°
Resolución 2.7A

Flexible loop

Interface loop

Phosphate binding
helix
 La TIM de Escherichia coli como referencia mesófila
La VmTIM y la eTIM presentan un 66% de identidad de secuencia

eTIM

VmTIM

RMS : 0.59 A°
 Estudio estructural de la mutación A238S en VmTIM

Val234
Gly235

Val234
Gly235

Lys11
Asn9
Ser238 Lys11

Ala238 Asn9

eTIM VmTIM
 Conclusión:

-La presencia de un residuo Ala en la « phosphate binding helix »

en VmTIM permite asegurar una actividad óptima a bajas temperaturas

-La ausencia de dos interacciones podría favorecer un aumento de la

flexibilidad de la región « phosphate binding helix ».

-Esto facilitaría el acceso del sustrato al sitio activo de la enzima a

bajas temperaturas

Alvarez et al., (1998) Journal Biological Chemistry, Vol. 273, pp 2199-2206

 Estudio de las adaptaciones moleculares de TmTIM a altas temperaturas

Caracterización:
Microcalorimetría (DSC)

Medida de la inactivación por la temperatura:

Température (°C) Ki (sec-1) Td : 102°C

60°C <5.0x10-5

∆Cp (kcal/mol/°C)
70°C <5.0x10-5
80°C 1.1x10-4
90°C 2.6x10-4
95°C 1.0x10-3

T 1/2 = 10 min (95°C)

 Cristalogénesis de TmTIM en microgravedad

A B

Earth Space

United States Microgravity Laboratory-2 (USML-2) on Space Shuttle Columbia, space mission STS-73. (1995)

International Space Laboratory, Soyuz Launcher, Odissea space mission. (2002)

 La estructura tridimensional de T.maritima TIM

Resolución 2.8A°

Flexible loop

Phosphate binding
helix
Interface loop
 La TmTIM adopta una organización tetramérica

En el cristal

PGK PGK

TIM TIM

TIM TIM

PGK PGK

Schürig et al., 1995

 En solución:

Cromatografía de filtración
Dynamic Light Scattering (DLS)

100
80

Intensity
60
40
20
0

0 10 20 30 40 50 60
Diameter (nm)

Static Light Scattering (SLS)

MM : 116 + 3.1 kDa

Conclusión :
La organización tetramérica parece ser una propiedad intrínseca de TmTIM
Las TIMs termófilas poseen una mutación puntual situada en la región
denominada « loop 1»
E.coliTIM 1 MRHPLVMGNWKLN.GSRHMV………
V.marTIM MRHPVVMGNWKLN.GSKEMV………
MoraxTIM MQAWVIGNWKQNPATSHDV………
T.marTIM RKLILAGNWKMH.KTISEA………
B.stTIM MRKPIIAGNWKMH.KTLAEA………
 Estudio del rol del par de residuos His12/Lys13 en las TIMs termófilas
Mutantes : TmTIM = H12N/K13G
bTIM = H12N/K13G
H12N
K13G
0,0017
H12N/K13G bTIM
0,0016
0,0015
0,0014
K13G bTIM H12N/K13G TmTIM
0,0013 H12N bTIM
0,0012
TmTIM
0,0011
bTIM
Kinact (s-1)

0,0010
0,0009
0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Temperatura (°C)
 Estabilidad estructural de TIMs termófilas

Td (°C)
bTIM
Sauvage 76
H12N 77
K13G 73
H12N/K13G 73
TmTIM
Sauvage 102
H12N/K13G 105

-La termoestabilidad estructural no es afectada por las mutaciones

 Análisis de la estructura tridimensional del mutante H12N/K13G bTIM

Leu237
Leu237

His12 Lys10
Lys10 Asn12
Trp9
Trp9

Gly13
Lys13

bTIM H12N/K13G bTIM

¿Como podría explicarse la inactivación enzimática de H12N/K13G bTIM sin una

modificación estructural?
La simulación de la dinámica molecular confirma el efecto destabilizador de la mutation en bTIM

2 PG 2 PG
Lys10
Lys10

His12 His12
0,0017
0,0016
Leu237
0,0015
0,0014 Leu237
0,0013
0,0012
Lys13 bTIM Lys13 TmTIM
0,0011
Kinact (s-1)

0,0010 TmTIM
bTIM
0,0009
0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Temperatura(°C)
 2 PG 2 PG
Lys10
Lys10

His12
0,0017 Asn12
Leu237
0,0016
Leu237
0,0015
0,0014
0,0013
0,0012 Gly13
0,0011 K13G bTIM Lys13 H12N bTIM
Kinact (s-1)

0,0010
0,0009 K13G bTIM H12N bTIM

0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Temperatura (°C)
 2 PG
2 PG
Lys10
Lys10

His12
0,0017
H12N/K13G bTIM
0,0016 Asn12
0,0015
0,0014 Gly13 Leu237
0,0013
0,0012
Lys13
0,0011 H12N/K13G bTIM bTIM
Kinact (s-1)

0,0010
H12N/K13G bTIM bTIM
0,0009
0,0008
0,0007
0,0006
0,0005
0,0004
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Temperatura (°C)
 Conclusión

-La sustitución del par de residuos His12/Lys13 por Asn/Gly tiene un efecto sólo
en bTIM y no en TmTIM

-La presencia del residuo Gly13 aumenta significativamente el movimiento

molecular en la región loop 1

-Considerando la proximidad del residuo catalítico Lys10 a la región del loop 1,

esto podría explicar la rápida inactivación del doble mutante de bTIM

Alvarez et al., (1999) Journal Biological Chemistry, Vol. 274, pp 19181-19187

Maes et al., (1998) Journal Biological Chemistry, Vol. 273, pp 2199-2206
 Conclusión final
• 2 nuevas TIMs adaptadas a temperaturas extremas fueron caracterizadas
VmTIM: una enzima psychrofila.
TmTIM: una enzima hipertermófila.

• La estructura tridimensional de VmTIM, TmTIM y del mutante

H12N/K13G bTIM fueron resueltas por cristalografía de rayos X

• Una estrategia de mutación puntual parece ser adoptada por la VmTIM y

bTIM para optimizar sus actividades enzimáticas a las temperaturas respectivas

• La organización tetramérica de TmTIM podría ser un factor determinante

de la adaptación de la enzima a altas temperaturas
Mutagénesis dirigida Calorimetría

La adaptación molecular
a condiciones extremas

Cristalografría Simulación de la dinámica

molecular
 Agradecimientos

Vrije Universiteit Brussel (V.U.B, Bruxelles)

-L. Wyns
-D. Maes

Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix (F.U.N.D., Namur)

-E. Depierreux
-J. Wouters
Analyse du contenu en acides aminés entre TIMs adaptés aux differents températures.

Vm Tb Lm Pf Hu Ch Ye Ec Bs Tm
A-Ala 48 34 33 15 28 28 25 45 29 15
C-Cys 2 3 4 4 5 4 2 3 4 3
D-Asp 12 8 8 14 12 13 15 10 12 9
E-Glu 22 13 15 19 17 17 17 21 20 29
F-Phe 8 8 6 13 8 8 11 6 9 12
G-Gly 23 19 16 14 25 27 22 22 22 24
H-His 6 5 6 5 4 8 3 8 6 4
I-Ile 17 19 19 19 15 17 15 19 16 23
K-Lys 13 17 17 22 20 22 21 16 12 19
L-Leu 18 17 17 19 15 17 19 17 19 23
M-Met 6 3 3 2 2 2 0 7 5 5
N-Asn 12 10 11 17 8 7 12 9 5 6
P-Pro 8 7 10 4 10 7 7 7 13 7
Q-Gln 8 13 13 12 11 9 7 11 14 8
R-Arg 7 9 8 8 8 7 8 8 11 14
S-Ser 10 18 13 18 12 12 16 11 13 12
T-Thr 11 12 16 13 14 11 12 9 12 10
V-Val 19 25 25 21 25 22 26 19 25 24
W-Trp 2 5 5 2 5 5 3 2 2 2
Y-Tyr 4 5 6 7 4 4 6 5 4 6
Total 256 250 251 248 248 247 247 255 253 255
% Charged 21.1 18.8 19.1 25.4 23.0 23.9 24.7 21.6 21.7 27.8
% Polar 18.4 23.2 23.5 26.2 19.8 19.0 20.2 18.8 19.8 15.7
%Apolar 51.6 50.4 51.0 42.7 47.2 46.2 46.2 51.0 49.8 47.1
%Glycines 9.0 7.6 6.4 5.6 10.1 10.9 8.9 8.6 8.7 9.4
Charge -14 +5 +2 -3 -1 -1 -3 -7 -9 -5