PCR EM TEMPO REAL –

E. coli
 INTRODUÇÃO
 A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real é uma técnica de
Biologia Molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma
extremamente rápida. Com a PCR em tempo real, quantidades mínimas de
material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas,
permitindo a detecção rápida dos marcadores genéticos de doenças infecciosas
ou doenças genéticas.
 INTRODUÇÃO
 Ao contrario da PCR Tradicional, a PCR em tempo real possibilita o
monitoramento da síntese de produtos de amplificação no decorrer da própria
reação de síntese PCR e não apenas no final da reação como ocorre na PCR
tradicional.
 As principais vantagens esta na possibilidade de execução de estudos
quantitativos dos ácidos nucleicos e não apenas qualitativos e na eliminação do
risco de contaminação, pois esta reação ocorre em um sistema tubular fechado,
não havendo também a necessidade de eletroforese para visualização das
amplificações.
 PCR TEMPO REAL
 A técnica tende ser menos laboriosa, mais precisa e com menos risco de
contaminação, pois a detecção é visualizada diretamente no equipamento
 COMO FUNCIONA A PCR EM TEMPO REAL
 O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado
de Cycle Threshold(CT). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na
fluorescência.
 FUNCIONAMENTO DE PCR TEMPO REAL

A amplificação mostra 3 fases distintas: (1) linha basal: não houve produtos de PCR suficientes para detectar
A fluerencia; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais
Aumento no numero de produtos.
APLICAÇÃO DE PCR TEMPO REAL EM E.coli
 Aplicação
 Cepas patogênicas de Escherichia coli (Avian PathogenicE. coli - APEC) são os
agentes causais da colibacilose (causadora de enterite, artrite, onfalite,
coligranuloma, salpingite, septicemia, aerossaculite, doença respiratória crônica
(DRC), celulite aviária, síndrome da cabeça inchada, peritonite, osteomielite e
sinovite) . No entanto, as cepas podem ser encontradas na microflora normal do
trato intestinal das aves e mamíferos e dificultam a caracterização do agente
causal. As cepas patogênicas diferem das comensais por apresentarem fatores
de virulência (FVs) e proporcionarem infecções extraintestinais.
 Aplicação
 O presente trabalho teve como objetivo estabelecer e validar uma metodologia
para diferenciação de APEC (Avian Pathogenic-E. Coli – cepas patogenicas)e
AFEC(Avian Fecal- E. coli – cepas não patogênicas) por PCR em tempo real
utilizando os cinco alvos ((iss, iutA, hlyF, ompT e iroN) previamente descritos.
 Aplicação
 Atualmente, já se sabe que AFECs podem ser transformadas em APECs, quando
ocorre transferência horizontal destes plasmídeos. Estes fatores de virulência
(iutA, iss, iroN e ompT e hlyF) apareceram em maior frequência em APEC do
que em AFEC, sendo assim são considerados de alta eficiência na diferenciação
de cepas patogênicas.
 Aplicação
 O desenvolvimento da PCR em tempo real, demonstrou alta eficiência na
detecção dos FVs iroN, ompT e hlyF, com 100% de concordância, sensibilidade
e especificidade quando comparado com a técnica padrão (PCR convencional).
 Aplicação – Conclusão
 Este estudo indica que a técnica desenvolvida apresenta alta concordância,
sensibilidade e especificidade para os alvos testados até o momento. E, desta
forma, caso seja confirmado comportamento semelhante para o duplex iss/iutA,
a técnica desenvolvida poderá contribuir para o diagnóstico mais eficiente desta
importante patologia que acomete granjas em nosso país.
 Equipamentos de PCR para Tempo Real

ABI 7500
StepOne Plus da Applied Biosystems

ICYeler IQ (Bio Rad)

PCR EM TEMPO REAL