KROMATOGRAFI LAPIS

TIPIS-DENSITOMETRI

Abdul Rohman
Fakultas Farmasi UGM
2023
 PENDAHULUAN

• Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan bentuk kromato­

grafi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis.
• KLT merupakan metode pemisahan campuran analit de­
ngan mengelusi analit melalui suatu lempeng
kromatografi lalu melihat komponen/analit yang terpisah
dengan penyemperotan atau pe­ngecatan.
• Dalam bentuknya yang paling sederhana, lempeng-
lempeng KLT dapat disiapkan di laboratorium, lalu
lempeng diletakkan dalam wadah dengan ukuran yang
sesuai, lalu kromatogram dapat discanning secara visual
Thin Layer Chromatography
 Keuntungan KLT
• KLT banyak digu­nakan untuk tujuan analisis
• Identifikasi pemisahan kom­ponen dapat dilakukan
dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau de­ngan
radiasi menggunakan sinar ultra violet
• dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),
menurun (descending), atau dengan cara elusi 2
dimensi;
• ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena
komponen yang akan ditentukan merupakan bercak
yang tidak bergerak
Teknik KLT
 Teknik KLT

• Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut

pengembang akan ber­gerak sepanjang fase diam
karena pengaruh kapiler pada pengem­bangan
secara menaik (ascending), atau karena pengaruh
gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending).
• KLT dalam pelak­sanaannya lebih mudah dan lebih
murah dibandingkan dengan kromatografi berbasis
kolom (kromatografi cair kinerja tinggi dan
kromatografi gas).
Teknik KLT
 FASE DIAM
• Sifa-sifat umum penjerap pada KLT harus serupa
dengan sifat-sifat pada penjerap dalam kromatografi
kolom.
• Dua sifat penjerap yang penting adalah ukuran partikel
dan fase diam yang digunakan dalam KLT.
• Penjerap KLT merupakan penjerap berukuran kecil
dengan diameter partikel antara 10-30 μm.
• Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan
semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka
semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan
resolusinya
 Jenis Penjerap
Penjerap Mekanisme sorpsi Penggunaan
Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid.
Silika yang dimodifikasi Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa non polar.
dengan hidrokarbon
Serbuk selulosa Partisi Asam amino, nukleotida,
karbohidrat.
Alumina Adsorpsi hidrokarbon, ion logam, pewarna
makanan, alkaloid.
Kieselguhr Partisi Gula, asam-asam lemak.
(tanah Diatomae)
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida, halida
dan ion-ion logam.
Gel sephadex Eksklusi Polimer, protein, kompleks logam.
β-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansiomer.
stereospesifik
 Penamaan Fase diam KLT
Simbol/Singkatan Makna
“Sil“ Suatu produk yang mengandung silika gel seperti Anasil dari
pabrik Analabs
G Pengikat (lapisan halus) gipsum (CaSO4.½ H2O)
S Pengikat starch (pati)
O Pengikat organik seperti polimetakrilat atau polikarboksilat.
Lapisan-lapisan ini bersifat keras dan tahan terhadap abrasi.
H atau N “No foreign binder“ (tidak ada pengikat luar). Produk dengan
kode ini juga dapat mengandung berbagai macam penjerap yang
berbeda seperti silika gel hidrat atau asam silikat koloidal untuk
meningkatkan stabilitas lapisan.
HL Hard layer (lapisan keras), merupakan lapisan yang tahan
terhadap abrasi yang mengandung pengeras anorganik
HR “Higly refined“
P Lapisan untuk preparatif
P + CaSO4 Lapisan preparatif yang mengandung pengikat kalsium sulfat
(gips)
Penamaan Fase diam KLT
F atau UV Ditambah bahan yang berfluoresensi seperti seng silikat
teraktivasi mangan
254 dan 366 Digunakan setelah simbol F atau UV, untuk menunjukkan panjang
gelombang eksitasi senyawa berfosforisensi yang ditambahkan
60 Silika gel (dari E. Merck) yang mempunyai ukuran pori 60A o (10Ao
= 1 nm). Ukuran pori yang lain ditandai 40, 80, dan 100.
D Lempeng dibagi ke dalam serangkaian saluran (channel) yang
pararel
K Simbol yang digunakan oleh semua produk Whatman
RP “Reversed phase“; RP18 atau RP-C18 menunjukkan bahwa gugus
oktadesilsilan diikatkan secara kimia ke dalam silika gel
4,7, atau 9 Bilangan yang dicantumkan setelah nama penjerap dan
menunjukkan pH bubur penjerap
 Fase Gerak

• Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka,

tetapi lebih sering dengan mencoba-coba
karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
• Sistem yang paling sederhana ialah campuran
2 pelarut organik karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat
terjadi secara optimal.
 Petunjuk Fase Gerak
• Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat
tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitive
• daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa
sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk
memaksimalkan pemisahan
• Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik
digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya
seperti campuran air dan metanol dengan
perbandingan tertentu.
 Penotolan sampel
• Sampel harus diaplikasikan/ditotolkan pada lempeng KLT dengan
cara hati-hati dan dengan pertimbangan bahwa gangguan yang
mungkin timbul pada lempeng KLT karena penotolan harus
dikendalikan sekecil mungkin.
• Pada umumnya, sampel secara manual ditotolkan melalui pipa
kapler, mikropipet atau melalui penyuntik mikro-kaca yang telah
terkalibrasi sedemikian rupa sehingga tetesan yang datang tepat
menyentuh permukaan lempeng, sementara ujung alat penotol
masih tetap di atas penjerap lempeng KLT.
• Pemisahan pada KLT yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin
 Penotolan sampel
Tujuan analisis Diameter Konsentrasi Banyaknya
bercak (mm) sampel (%) sampel (μg)

Densitometri 2 mm untuk 0,02-0,2 0,1-1

(kuantitatif) volume sampel (untuk HPTLC)
0,5 μL
1-10
(konvensional)
Identifikasi 3 mm untuk 0,1-1 1-20
volume sampel
1 μL
Uji kemurnian 4 mm untuk 5 100
volume sampel
2 μL
Penotolan sampel otomatis
 Pengembangan KLT-1

• Menaik

garis depan pelarut

arah pengembangan

pelarut
 Pengembangan KLT-2

• Menurun Pelarut melalui sini

Arah
pengembangan

pelarut

Pendukung supaya lempeng KLT

bebas dari pelarut (fase gerak)
 KLT Dua Dimensi

• Pengembangan KLT 2 arah atau 2 dimensi

bertujuan untuk meningkatkan resolusi
sampel

pengembangan
kedua
adanya
peruraian

Pengembangan
pertama
 DETEKSI BERCAK
• Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik.
• Mengamati lempeng di bawah lampu ultraviolet yang dipasang
panjang gelombang emisi 254 atau 366 nm.
• Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat
pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang
akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecokelat-kecokelatan.
• Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber
tertutup
• Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan
densitometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas
radiasi Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat
sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder)  Densitometri
 DETEKSI BERCAK

Metode deteksi Warna bercak solut Penggunaan

Ninhidrin Pink ke ungu Asam-asam amino
dan amina
   

2,4-dinitrofenil hidrazon Oranye/merah Senyawa-senyawa

karbonil
 

Bromokresol hijau/biru Kuning Asam-asam organik

2,7-fluoresein Kuning-kehijauan senyawa organik
vanilin/asam sulfat Merah/hijau/pink Alkohol, keton
Rhodamin B Berfluoresensi merah Lemak
Anisaldehid/antimon Berbagai macam Steroid
triklorida
Difenil amin/seng Berbagai macam Pestisida
 Nilai Rf
• Dalam KLT dan juga kromatografi
kertas, hasil-hasil yang diperoleh
dinyatakan nilai Rf.
garis depan
• Nilai Rf merujuk pada migrasi
relatif analit terhadap ujung jarak yang ditempuh
fase gerak (B)

depan fase gerak atau eluen, A

dan nilai ini terkait dengan B dW
Rf =
B
koefisien distribusi (K) kom­ ° dA

ponen.
jarak yang ditempuh solut
A

• Nilai Rf didefiniskan
sebagaimana dalam persamaan: titik awal penotolan

sampel yang ditotolkan

Jarak yang ditempuh solut

Rf = Jarak yang ditempuh fase gerak
Penggunaan Nilai Rf
Application of TLC