Master Sciences Analytiques Et Instrumentation

Dosage du cortisol libre urinaire par chromatographie

gazeuse couplée la spectrométrie de masse

Présenté par :
Fatima-ezzahra CHALAOUANE
Hind MEJDOUBI
DMANE Soufiane.​
LAAYCHI Abdelhak.​
EL-BOUZIDI Ahmed.​ Encadré par :
Laila CHLIKHA Pr Adil EL Yadini
 Eléments

I- Introduction

II- Méthodologie

III- Procédure

IV- Interprétation des Résultats

V- Conclusion
 I- Introduction

A. Le cortisol :

Le cortisol est une hormone

stéroïdienne produite par les
glandes surrénales, qui sont situées Rôle dans le
Régulation Régulation
au-dessus des reins. Il appartient à la Anti- Rôle dans la métabolisme
du de la
inflammatoir réponse au des graisses
famille des glucocorticoïdes. Le métabolisme pression
e naturel stress et des
cortisol remplit de nombreuses des glucides artérielle
protéines
fonctions essentielles dans le corps
humain, notamment :
 I- Introduction

B. Le dosage du cortisol libre urinaire :

Diagnostiqu
Evaluation e des
des troubles troubles
du sommeil surrénaliens

Le dosage du cortisol
libre urinaire est Evaluation
Suivi du des troubles
important pour traitement métabolique
plusieurs raisons:

Recherche Évaluation
scientifique du stress
chronique
 I- Introduction

C. Objectif de l’analyse CG-SM :

L'analyse du cortisol par CG-SM est utilisée pour quantifier les niveaux de cortisol dans un
Evaluation
échantillon biologique, généralement du sang, de l'urine ou de la salive. L'objectif de cette
des troubles
du sommeil
analyse est de mesurer avec précision la concentration de cortisol présent dans
l'échantillon, ce qui permet de tirer des informations importantes sur la santé et la
physiologie d'un individu.

Evaluation
des troubles
métabolique

Recherche
scientifique
 II- Méthodologie

A. Méthodologie de l'étude :
• du cortisol libre
urinaire par
Extraction,
chromatographie
dérivation,
gazeuse couplée à la
et analyse
spectrométrie de
masse.

• avec une méthode

Comparaison immunologique
(FPIA).

• la GC-MS pour sa
Préférence
spécificité élevée.
 II- Méthodologie

B. Chromatographie Gazeuse:
Équipement utilisé :

La chromatographie gazeuse
sépare, identifie et quantifie les
composés volatils dans les
échantillons gazeux ou liquides.
chromatographe gazeux Finnigan
9001 couplé à un spectromètre de
masse Finnigan GCQ.

Colonne capillaire CP-Si18 CB-MS.

Elle utilise la mobilité différente
des composés dans une colonne
de chromatographie.
Injection des échantillons en mode
split 10:1 à 280 °C.
 II- Méthodologie

C. SPECTROMETRIE DE MASSE

identifier

TECHNIQUE
ANALYTIQUE quantifier

ÉTUDIER LA
COMPOSITION
DES MOLÉCULES FIG. COMPOSANTS D’UN SPECTROMÈTRE DE MASSE
 II- Méthodologie

SPECTROMÈTRE DE MASSE FINNIGAN GCQ

SOURCE D’IONISATION
L'ionisation se fait par
impact dlectronique (El) avec
un faisceau d'dlectrons de 70 eV

ANALYSEUR Déflexion par un champ quadrupolaire

 II- Méthodologie

E. PROTOCOLE DE L'ANALYSE

Préparation de l'échantillon INJECTION DES ÉCHANTILLONS ACQUISITION DES DONNÉES ANALYSE DES RÉSULTATS Interpretation des resultats
 III- Procédure

A. Préparation des échantillons

- À 5 mL d'urine d'une récolte de 24 h, sont rajoutés 100 ng

de standard interne [9,11,12,12-2H4]-cortisol.

- Puis déposés sur une cartouche Sep-Pak ® Cls

préalablement conditionnée au méthanol (5 mL) puis à
l'eau milliQ (10 mL)

- Après écoulement de l'urine, la cartouche est lavée par 5

mL d'eau, 3 mL d'un mélange eau-méthanol (70:30) et 5 mL
de n-heptane.

- Les molécules sont éluées par 3 mL de méthanol qui est

ensuite évaporé sous flux d'azote.

A. Préparation des échantillons
Préparation de la formaline
acidifiée
Préparation du spirocétal
bisméthylènedioxycortisol
[BMD] (durée 3H)
Estérification par
I‘anhydride
heptafluorobutyrique
(BMD-HFB)(durée 1H)
III- Procédure
- Du paraformaldéhyde (2 g) est dissous par agitation dans un mélange d'eau (6 mL) et
d'acide chlorhydrique concentré (6 mL) dans un bain-marie à 40 °C jusqu'à dissolution
complète.
- L'extrait urinaire sec est repris dans 200 µL de dichlorométhane et traité par 500 µL de
formaline acidifiée.
- Le mélange est agité à température ambiante pendant 2 heures.
- Après centrifugation, la phase organique est prélevée et 200 µL de dichlorométhane sont
ajoutés au reliquat puis agités pendant 10 minutes.
- Après centrifugation, la phase organique est prélevée et ajoutée à la précédente.
- La phase organique est diluée par addition de 300 µL de dichlorométhane et lavée par une
solution aqueuse saturée en bicarbonate sodique (500 µL.
- Après agitation au vortex pendant 15 minutes, la phase organique est séchée sur sulfate de
magnésium anhydre puis évaporée à sec sous un flux d'azote.
- Le résidu est repris par du toluène anhydre (500 µL) et traité à l'anhydride
heptafluorobutyrique (50 µL) à 50 °C.
- Après 30 minutes, le toluène est évaporé et le résidu est repris par du cyclohexane (100 µL).
 III- Procédure

B. Calibration et contrôle
- La quantification est effectuée sur la somme de deux ions caractéristiques à m/z 600 et 509 pour le cortisol et
604 et 513 pour le standard interne (SI).

- Une calibration en cinq points est réalisée à l'aide des solutions standard de cortisol de concentration 5, 10,
20, 90 et 200 ng/mL et de cortisol tétradeutéré à 20 ng/mL.

- La courbe de calibration est construite par régression linaire des moindres carrés non pondérée du rapport
des surfaces de pic (cortisol sur standard deutéré) en fonction de la concentration de cortisol présente dans
l‘échantillon.

Un contrôle à deux niveaux, placé en début et

fin de série, est utilisé pour valider les analyses.
 III- Procédure

C. Injection des échantillons dans le GC-MS.

- Les injections sont effectuées en mode split de 10:1

à 280 °c à l'aide d'un échantillonneur automatique
as2000.​

- La séparation chromatographique est effectuée sur

une colonne capillaire CP-Sil8 CB-MS (30 m x 0,25
mm x 0,25 µm).

Colonne capillaire Schéma simplifié de l’injecteur avec

système de fuite
 III- Procédure

C. Injection des échantillons dans le GC-MS.

- L'hélium est utilisé comme gaz vecteur à

une vélocité constante de 45 cm/sec.

- Si l’échantillon contient des espèces

non-volatiles, celles-ci sont retenues
sur le coton et donc non-injectées
dans la colonne, ce qui permet de la
protéger.

- Les espèces volatiles sont vaporisées

et entraînées par le gaz vecteur vers la
tête de la colonne.
 III- Procédure

D. Résultats
- Les stéroïdes sont isolés de l'urine par extraction sur phase solide C-18 puis traités
successivement par du formaldéhyde en milieu acide puis par de l'anhydride
heptafluorobutyrique pour conduire au dérivé bisméthylènedioxy-heptafluorobutyrate
(BMD-HFB) du cortisol.
 III- Procédure

D. Résultats.
- La quantification du cortisol est réalisée sur deux ions caractéristiques à m/z 600 et 509
pour le cortisol et les ions respectifs à m/z 604 et 513 pour le standard deutéré.
 III- Procédure

D. Résultats.
- La limite de quantification déterminée par dérivation de standard après dilution est de 5
ng/mL.

- La réponse est linaire de 5 à 1 000 ng/mL.

- La droite de calibration moyenne, établie sur 20 calibrations différentes par régression

linaire entre le rapport des surfaces de pic (y) et la concentration de cortisol (x) dans
l‘échantillon (ng/mL), est y = 0.063 x + 0,072 et le coefficient de corrélation est supérieur à
0,993.

- Le coefficient de variation (CV) intra-essai est de 7,0 % (n = 8) et le CV inter-jour est de 11%

(n = 20) à une concentration de 30 ng/mL.
 III- Procédure
D. Résultats.
- La limite de sensibilité en full scan est de 250 pg injectés (2 ng/mL).
- La limite de quantification sur échantillons urinaires est de 1 ng/mL. La récupération, déterminée sur des
échantillons contrôlées enrichis par 40 ng/mL de cortisol, est de 90 ± 10 %.
- Le coefficient de corrélation de la régression linaire entre la méthode FPIA (y) et la GC-MS (x) vaut 0,953 et la
comparaison des deux techniques par la méthode de Passing-Bablok sur 106 échantillons est y = 1,205 x +
1,79.
- La réactivité croisée de stéroïdes de structure proche de celle du cortisol a été évaluée par le dosage du
cortisol apparent dans du tampon enrichi par des quantités de stéroïdes équivalentes à celles mentionnées
par la firme Abbott.
 IV- Interprétation des Résultats

L'étude discute des méthodes de dosage du cortisol libre urinaire et de la comparaison entre la chromatographie en phase gazeuse
couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) et la méthode immunoessai (FPIA).

1. Comparaison des méthodes de dosage :

- La GC-MS est considérée comme une méthode très spécifique et sensible pour mesurer le cortisol.
- En revanche, la FPIA (méthode immunologique automatisée) est moins précise, notamment en raison de la surestimation
significative des niveaux de cortisol, en particulier à des concentrations élevées.

2. Interférences :
- La FPIA est sensible aux interférences de certains médicaments et stéroïdes exogènes, ce qui peut entraîner des résultats inexacts.
- La GC-MS, en revanche, n'est pas affectée par ces interférences, ce qui en fait une méthode plus fiable.

3. Limites de valeurs de référence :

- Pour améliorer la spécificité du diagnostic de l'insuffisance surrénalienne, il est proposé de restreindre l'intervalle des valeurs de
référence utilisées avec la FPIA.

4. Fiabilité du diagnostic :
- La FPIA peut donner des faux positifs et des faux négatifs dans certains cas où le catabolisme du cortisol est perturbé, soulevant
ainsi des questions sur la fiabilité du diagnostic basé sur cette méthode.

En résumé, l'étude démontre que la GC-MS est plus précise et spécifique que la FPIA pour le dosage du cortisol libre urinaire, en
particulier à des niveaux élevés de cortisol. Cela souligne l'importance de choisir la méthode appropriée en fonction des besoins
diagnostiques et de prendre en compte les interférences possibles pour éviter des erreurs de diagnostic.
 La comparaison des
deux techniques par la
méthode de Passing-
Bablok indique une
surestimation
significative de la
quantité de cortisol
mesurée par
immunoessai
La comparaison des deux méthodes
limitées aux valeurs inférieures à 80
pg/L en FPIA met en Evidence une
surestimation plus importante (40 %) de
l'immunoessai ainsi qu'une plus grande
dispersion des valeurs. Le graphique de
Bland et Altman qui exprime la
différence entre les deux méthodes
exprimée en pourcentage en fonction de
la moyenne des deux méthodes met en
Evidence une grande imprécision aux
valeurs basses
 V- Conclusion

La GC-MS est une technique spécifique et sensible

permettant le dosage du cortisol libre urinaire identifié
de manière non-ambigu par l'analyse du spectre de
masse du dérivé Cette méthode permet simultanément
l'identification des métabolites majeurs du cortisol ainsi
que d'autres stéroïdes exogènes éventuellement
présents dans l’échantillon sans interférer sur le dosage
du cortisol. La comparaison des résultats obtenus avec
une méthode immunologique confirme la surestimation
significative de la quantité de cortisol déterminée par
immunoessai.
MERCI
!