EQUIPO 4

¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Una preparación pura de proteínas es esencial para poder determinar sus propiedades
y su actividad, pues cada célula puede tener miles de tipos de proteínas
Los métodos clásicos de separación de proteínas aprovechan propiedades que varían
de una proteína a otra, incluyendo propiedades, carga y tamaño. A estos métodos se le
han añadido recientemente otros como lo es el clonaje del DNA
La fuente de proteínas son generalmente
células microbianas. Para poder purificar una
proteína es necesaria la ruptura de estas
células y así poder liberar estas proteínas en
una solución conocida como extracto en
crudo.
 ¿Cómo pueden purificarse las proteínas?
Una vez obtenido el extracto, se disponen de diversos métodos para
purificar las proteínas que estos contienen, este extracto se somete a
tratamientos que separa las proteínas en diferentes fracciones en base a
algunas propiedades como su tamaño, a este paso de la conoce como
fraccionamiento
Uno de liso primeros pasos del fraccionamiento utiliza la diferencia de
solubilidad de las proteínas que es una función compleja del pH, la
temperatura, concentración de sal, etc. La solubilidad de ciertas proteínas
disminuye en presencia de ciertas sales, es un efecto denominado “salting
out”. La adición de ciertas sales puede precipitar selectivamente ciertas
proteínas, permaneciendo las otras en solución.
Las proteínas de interés pasan por procesos de
purificación. La diálisis, por ejemplo, es un procesos que
separa las proteínas de los solutos pequeños
aprovechando el mayor tamaño de las proteínas
 ¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

Los métodos más potentes para el fraccionamiento de las

proteínas utilizan la cromatografía de columna, que aprovecha
la diferencia de cargas, tamaños y demás propiedades de las
proteínas. La fase estacionaria se introduce en una columna y
una disolución tamponada (fase móvil) pasa a su través
La cromatografía de intercambio iónico aprovechas las diferencias en el
signo y la magnitud de las cargas eléctricas netas de las proteínas a un pH
determinado. La matriz de la columna es una resina que tiene unidos grupos
cargados; los que tienen unidos grupos anicónicos se llaman
intercambiadores catiónicos y los que tiene un grupo catiónico se llaman
intercambiadores anicónicos
Gracias a la afinidad de cada proteína por los grupos cargados está afectada por el pH y las
concentraciones de iones salinos libres.
 ¿Cómo pueden purificarse las proteínas?
En la cromatografía de intercambio catiónico, a matriz solida
tiene grupos cargados negativamente, en la fase móvil las
proteínas con carga neta positiva migran a través de la matriz
más lentamente que las que tienen carga negativas. Obtenidas
las fracciones se pueden analizar para averiguar la presencia de
la proteína de interés o conocer cierta propiedad.
La cromatografía de excusión molecular también conocida
también como de filtración en gel, separa proteínas en base a su
tamaño. En este método, las proteínas de mayor tamaño emergen
de las columnas antes que las pequeñas, un resultado que parece
extraño a primera vista. La fase solida consiste en unas pequeñas
perlas hagas de material entrecruzados. Las proteínas grandes al
no poder entrar en las cavidades, toman un camino más corto,
rodeando las partículas por el exterior mientras que las pequeñas
penetran las cavidades y son más tardadas.
 ¿Cómo pueden purificarse las proteínas?

La cromatografía por afinidad se basa en la afinidad de unión de

proteínas. Las partículas de la columna tienen en este caso un grupo
químico unido covalentemente llamado ligando, una molécula que
se une a una macromolécula, en este caso una proteína, cuando se
carga una mezcla de proteínas cualquiera que tenga afinidad por este
ligando se unirá a la molécula de resina, retardando la función
biológica de la proteína a través de la columna.
Los métodos cromatográfIcos pueden incrementar su rendimiento gracias
al uso de HPLC (High?Performance Liquid Chromatography, es una
técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla.) La HPLC
usa bombas de alta presión que acelere el movimiento de las moléculas
de proteínas a trabe de la de la columna. Al disminuir el tiempo de
tránsito en la columna, la HPLC puede limitar la expansión de las bandas
de proteínas por difusión y así mejorar la resolución.
LAS PROTEINAS PUEDE SEPARARSE
Y CARACTERIZARSE POR
ELECTROLISIS.
Otra importante técnica para la separación de
proteínas se basa en el desplazamiento de las
proteínas cargadas en un campo eléctrico, proceso
denominado electroforesis. Estos procedimientos no
son utilizados generalmente para purificar proteínas
en grandes cantidades dado que existen usualmente
métodos alternativos más sencillos y que los
métodos electroforéticos suele afectar
negativamente a la estructural y por tanto a la
función de las proteínas.
 LAS PROTEINAS PUEDE SEPARARSE Y CARACTERIZARSE POR
ELECTROLISIS
No obstante la electroforesis es sumamente importante
como método analítico, su ventaja es que las proteínas
pueden visualizarse además de separarse, lo que permite
al investigador hacer una estimación rápida del número
de proteínas
La electroforesis de proteínas se lleva a cabo generalmente en geles
formados por el polímero entrecruzado de poliacrilamida. Este gel actúa
como aun tamiz molecular retrasando la migración de manera
proporcional a su cociente carga/masa. El desplazamiento también
puede ser afectado por la forma de proteína.
En la electroforesis, la fuera que mueve la macromolecula es el
potencial eléctrico E. La movilidad electroforética de la molécula, µ, es
el cociente entre la velocidad de la velocidad de la partícula V, y el
potencial eléctrico.
 LAS PROTEINAS PUEDE SEPARARSE Y CARACTERIZARSE POR
ELECTROLISIS 𝜇 =𝑉 /𝐸
“el desplazamiento de una proteína en un gel en una electroforesis es por lo
tanto, función de su tamaño y forma”
Un método electroforético muy utilizado para la estimación de pureza y masa
molecular emplea el detergente dodecil sulfato sódico (SDS).
El enfoque isoeléctrico es un procedimiento utilizado para
determinar un punto isoeléctrico de una proteína, se establece un
gradiente de pH dejando que una mezcla de ácidos y bases
orgánicas de baja masa molecular (anfolitos) se distribuya
espontáneamente en un campo eléctrico generando a través del gel.
Cuando se aplica una mezcla de proteínas, cada una de ellas alcanza
un pH que coincide con su punto isoeléctrico, de este modo las
proteínas con distintos puntos isoeléctricos se distribuyen de
manera diferente a lo largo del gel.
 Es posible cuantificar proteínas no aisladas
A fin de purificar las proteínas es esencial disponer de un método para detectar y
cuantificar dicha proteína en presencia de muchas proteínas más en cada etapa. A
menudo la purificación debe de realizarse en ausencia de cualquier información sobre el
tamaño y las propiedades físicas.
En este caso de proteínas enzimáticas, se puede determinar la cantidad de enzima en una
disolución, con el fin de conocerse:
• La ecuación global de la reacción catalizada
• Un procedimiento analítico para determinar la desaparición de
sustrato o aparición de un producto en ciertas reacciones
• Si la enzima requiere cofactores tales como iones metálicos
• La dependencia de la actividad enzimática respecto de la
concentración del sustrato
• pH optimo
• Una zona de temperatura de la cual sea estable la enzima con
actividad elevada
 Es posible cuantificar proteínas no aisladas

Después de cada paso de

purificación, se determina la
actividad de la preparación (en
unidades de actividad enzimática), se
determina independientemente la
cantidad total de proteína y el
cociente de los 2 valores de la misma.
La actividad y la proteína
generalmente disminuyen en cada
paso. Los datos finalmente se
recogen en una tabla de purificación.