Investigaţia prin tehnica FISH

(fluorescent in situ hybridization)

Vysis CEP® X
Xp11.1-q11.1
SpectrumGreen TM

Vysis LSI® SRY

Yp11.3
SpectrumOrange TM
 Citogenetica clasica - limite

- rezolutia de ~ 4-5 Mb;

- necesar - celule in diviziune;
- dificultatea de a elucida rearanjamentele
complexe sau pe cele care implica regiuni
cromozomiale cu model de benzi similar.
 Citogenetica moleculara

Standard FISH

Multicolor FISH: M-FISH/SKY = vizualizarea

simultana a celor 24 de cromozomi umani
diferiti, in culori diferite.

CGH = detectarea modificarilor cantitative si

localizarea exacta a acestora pe cromozomi
 FISH
Utilizeaza sonde (secvente de acizi nucleici -
ADN, ARN) marcate cu fluorocromi (marcare
directa) sau cu haptene (marcare indirecta).

Poate marca:
cromozomi metafazici
nuclei interfazici
cromozomi elongati
fibra de cromatina
ADN–ul monocatenar se leaga complementar cu o
alta catena ADN (marcata in prealabil cu
fluorocromi), rezultand un ADN dublu catenar
HIBRID
• Sonde centromerice • Sonde telomerice

• Sonde specifice pt un locus • Painting cromozomial

 Standard FISH
Rezolutia metodelor FISH

cromozomi metafazici: 2–5 Mb

nuclei interfazici: 0,2–2 Mb

cromozomi elongati (prin

diverse procedee mecanice- 5 kb–500 kb
stretched chromosomes)
fibre de cromatina/ADN
 Aplicaţiile FISH

Cercetare:

1. ADN:

-determinări cantitative
-localizarea unui fragment pe cromosom
-depistarea unor mutaţii (deleţii şi duplicaţii sub-
microscopice)
-prezenţa secvenţelor ADN exogene în celulă (ADN
viral)
2. La nivel cromosomial:

- vizualizarea cromosomilor, a unor regiuni cromosomiale

(telomer, centromer)

- depistarea unor anomalii structurale cromosomiale

(translocaţii, deleţii, duplicaţii)

- colorarea diferită a perechilor de cromosomi sau a benzilor

cromosomiale (sunt evidenţiate rearanjamentele intra-
cromosomiale)

- diagnosticul sindroamelor de microdeleţie

3. La nivelul celulelor interfazice:

- diagnosticul unor aneuploidii, de exemplu:

- evidenţierea prezenţei a trei cromosomi 21 în

amniocite

- diagnosticul prenatal al sexului prin

evidenţierea cromosomului Y fără a fi necesară
cariotiparea
4. Genom:
Hibridizarea genomică comparativă (CGH)

- ADN test (tumoral) este marcat cu fluorocrom verde

- ADN normal de control cu un fluorocrom roşu

În amestec cele două probe hibridizează cu cromosomii

metafazici normali şi evidenţiază:
- duplicaţie (exces de verde)
- deleţie (exces de rosu) în ADN test
• Avantaje:
- Rapid
- Specific
- Diagnosticul unor rearanjari cromozomiale complexe
- Posibilitatea PGD (Diagnostic genetic de preimplantare-
folosit in tehnicile de fertilizare in vitro)

• Dezavantaje:
- Costuri
- Necesita aparatura si software specializate
- Probele nu pot fi stocate
- Lamele trebuie citite foarte repede
- Accesibilitate redusa
- Nu poate fi aplicat de rutina
 IZOLAREA ADN
Etape ale izolarii şi purificarii ADN-ului genomic:
1. Obţinerea sedimentului celular.
2. Distrugerea peretelui celular: se realizeaza prin tratament cu
lizozim.
3. Liza peretelui nuclear.
4. Deproteinizare enzimatică.
5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină: proteinele/peptidele sunt
precipitate cu soluţie KCl.
6. Precipitarea acizilor nucleici: se realizeaza cu alcool izopropilic.
7. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract: in marea majoritate a
experimentelor, în vederea îndepărtării moleculelor ARN din extract
se efectueaza şi tratament cu RNază A.
8. Este necesară şi parcurgerea unei etape de spălare a sedimentului
ADN cu etanol 70% rece.
9. Resuspendarea sedimentului ADN: sedimentul ADN este uscat 20
min apoi resuspendat.
 TEHNOLOGIA PCR
• Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în
Lanţ) este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite
secvenţe de ADN.
• Pe scurt, tehnica PCR permite ca o singura copie a unei secvente de ADN
sa fie copiata de milioane de ori sau chiar sa fie modificata pe parcursul
amplificarii (atunci cand este dorit acest lucru: ex. introducerea unei mutatii).

Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive
de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează
cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).
Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de
replicare ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de
desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu
sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar
singura enzimă folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN-dependentă
(cu funcţie de replicază).

Principalele 3 etape ale unei reacţii PCR pot fi sintetizate astfel:

 TIPURI DE PCR
• Revers PCR (utilizat pentru amplificarea ARN): denaturarea structurilor
secundare ale moleculelor ARN, ataşare un primer complementar capului 3’ al
moleculei ARN şi are loc sinteza primei catene de ADNc. In această reacţie se
foloseşte o ADN polimerază ARN-dependentă (revers-transcriptază), Hibridul
ARN:ADN obţinut în această reacţie de revers-transcriere este supus unei
reacţii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, după care la catena ADN
rămasă este ataşat un primer complementar cu capul 3’ al acesteia. După
sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse într-o reacţie
PCR obişnuită.

• MS PCR (Mutation Specific PCR): în experimentele de mutageneză situs-

specifică, modificările dorite pot fi introduse în ampliconi pe calea primerilor, fie
că este vorba de inserţii sau de deleţii.

• Obţinerea de sonde ADN/ARN marcate: foarte multe tehnici de obţinere de

sonde ADN/ARN folosesc variante de reacţii PCR. Astfel, într-o variantă, se
folosesc primeri marcaţi (în sistem radioactiv sau neradioactiv de marcare) şi
dNTP nemarcate. Ampliconii obţinuţi într-o asemenea reacţie sunt molecule
dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reacţii PCR intră în structura
produşilor de reacţie).
 TIPURI DE PCR
Real Time PCR (PCR cantitativ)
•Real Time PCR este o metoda diferita fata
de RT-PCR (reverse transcriptase PCR).
•Real Time PCR este o metoda care
include atat amplificarea fragmentului ADN
in timp real cat si analiza acestuia.
•Se folosesc cantitati foarte mici de proba.
Se pot amplifica atat probe ADN cat si
probe ADNc cu aceeasi viteza si eficienta.
•Un numar mult mai mare de probe de
concentratii diferite pot fi analizate in
acelasi timp.
•Amplificarea fragmentului ADN se poate
vizualiza cu ajutorul moleculei reporter pe
tot parcursul reactiei, nu la sfarsit.
 Aplicatii Real-Time PCR
Real-Time PCR poate fi utilizat pentru:
• Genotipare
 Trisomii si detectarea numarului de gene unice din genom
 Genotiparea microdeletiilor
 Haplotipare
 Analiza cantitativa a microsatelitilor
 Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sangele matern
 Diagnosticul cancerelor
• Cuantificarea expresiei genelor
• Masurarea expunerii la radiatii
• Studiul ADN mitocondrial
• Detectia metilarii
• Detectia inactivarii cromosomului X
 SECVENTIEREA
• Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii
nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat

• In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie chimic

prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger

• Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la unul

din capetele sale, denaturarea, urmata de separarea prin electroforeza in gel a
celor doua catene

• Are loc apoi taierea ADN-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de

ADN cu lungime variabila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de
poliacrilamida

• Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar

incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in
functie de baza existenta in secventa de analizat de catre dideoxinucleotide
Clonarea moleculara si Expresia genelor
• ADN-ul poate fi manipulat in laborator.

• Clonarea moleculară se referă la procedura de izolare a unei

anumite secvenţe ADN şi obţinerea mai multor copii ale acesteia in
vitro. Clonarea este frecvent folosită pentru amplificarea secvenţelor
ADN ce conţin gene, dar poate fi folosită şi pentru amplificarea oricărei
secvenţe ADN cum ar fi promotorii, secvenţe necodate şi secvenţe
aleatoare ale ADN.

• Enzimele de restrictie sunt o clasa speciala de enzime utilizate pentru

a taia ADN-ul la un anumit site de restrictie pe care il recunosc, avand
ca rezultat fragmente de ADN de lungimi predictibile. Utilizarea
enzimelor de restrictie permite ca fragmente de ADN din surse diferite
sa fie reconectate si astfel, prin legarea lor, este obtinut ADN-ul
recombinat. Adesea asociat cu organismele modificate genetic, ADN-
ul recombinat este utilizat in constructia vectorilor care au la baza
plasmidele (fragmente scurte de ADN circular).
Clonarea moleculara si Expresia genelor
• Vectorii de expresie sunt un tip specializat de vectori
de clonare in care semnalele pentru translatie si
transcriptie necesare pentru controlul genei de interes
sunt incluse in vectorul de clonare. Aceste semnale pot fi
create artificial pentru a controla mai usor expresia genei
de interes.

• Expresia genelor este o tehnica de clonare ADN care

utilizeaza vectori de clonare pentru a genera o biblioteca
de clone, in care fiecare clona exprima o proteina.
Biblioteca de expresie este analizata pentru identificarea
clonei care intereseaza si aceasta este recuperata
pentru investigatii ulterioare. Un exemplu ar fi izolarea
unei gene care confera rezistenta la antibiotice.

• Scop: de obicei scopul final al expresiei genelor este a

produce o anumita proteina in cantitate mare.
 EXPRESIA GENELOR APLICATII
Obţinerea insulinei umane
• Noile tehnologii industriale de obţinere a insulinei umane au fost
posibile odată cu extragerea genei insulinei (W.Gillbert şi
colaboratorii săi, 1980) şi crearea moleculelor recombinate de
ADN în baza plasmidelor.
• Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în Escherichia
coli, unde are loc realizarea informaţiei genetice codificate în
molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se
sintetizează şi insulina. Pentru a proteja insulina umană (ea nu
este proprie colibacililor şi este distrusă de enzimele bacteriene),
în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena
insulinei, şi o genă reglatoare care codifică proteine specifice
colibacililor (galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informaţiei
genetice a moleculei recombinate de ADN, se obţine o catenă
polipeptidică hibridă, din care mai apoi se separă insulina.
• Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obţin
aproximativ 200 grame de insulină de pe 1 m3 de mediu de
cultură, adică tot atâta cât se poate extrage din aproape 1600 kg
de pancreas de bou sau porc.
 EXPRESIA GENELOR APLICATII
Obţinerea somatotropine
• Sinteza acestui hormon pe cale artificială s-a început cu
producerea de ADNc cu ajutorul revers-transcriptazei,
având ca matrice ARNm din hipofize (transcripţie
inversă). Acesta a fost clonat, apoi tăiat cu enzime de
restricţie pentru obţinerea secvenţei nucleotidice
corespunzătoare somatotropinei, cu excepţia
fragmentului ce determină primii 23 de aminoacizi.
Fragmentul în cauză era clonat separat, ca rezultat al
unei sinteze chimice, apoi cele două segmente unite, la
ele se adăugă segmente reglatoare şi pe baza
plasmidelor se obţine plasmidul recombinat cu gena HGH
(a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid
recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu
de cultură se obţine 2-2,5 mg somatotropină).