ELISA

(ENZIME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

 - Mogući su mnogi sistemi koji koriste različitu
kombinaciju reagenasa
Mnogostranost - Pasivno vezivanje na mikrotitarsku ploču
- Laka separacija vezanih i nevezanih reaktanata
korakom ispiranja

- Upotreba mikrotitarskih ploča i srodnog pribora

- Veliki kapacitet
Jednostavnost
- Brza
- Jeftina
- Kitovi za izvođenje

Zašto Osjetljivost - Enzimsko pojačavanje katalizatora

ELISA? - Idealan raspon osjetljivosti za dijagnostiku

Boja - Multikanalni spektrofotometar

- Podaci se mogu sačuvati
- Statistička analiza podataka
Mjerljivost

Očitavanje okom
 Najčešće primjenjivani postupak u dijagnostici zaraznih bolesti životinja
 Najčešće se dokazuju specifična Ab u serumu
 Mogu se dokazivati i Ag
 Izvodi se u mikrotitarskim pločama (96 jamica)
 Očitavanje spektrofotometrom
 Primarna Ab- vežu se za specifični Ag
 Sekundarna Ab-detektuju primarna Ab vezana za Ag. Mogu biti označena enzimom
 Enzim-substanca koja može reagovati u niskoj koncentraciji kao katalizator da ubrza
specifičnu reakciju. U ELISA se uobičajeno koristi nekoliko specifičnih enzima sa svojim
specifičnim substratima.
 Ispiranje-punjenje i ispiranje jamica na mikrotitarskoj ploči s puferom da bi se odvojili vezani
od nevezanih reagenasa. Predstavlja ključni element za uspješno izvođenje ELISA
 Enzimski konjugat-enzim koji je ireverzibilno vezan za protein, obično Ab (npr. rabbit
antiguinea vezan sa horseradish peroxidase (HRP))
 Substrat-hemijska komponenta sa kojom enzim reaguje specifično. Ova reakcija se koristi, u
nekim slučajevima, da se stvori signal koji se očitava kao reakcija u boji (direktno kao
promjena boje substrata ili indirektno njegovim djelovanjem na druge hemikalije). Hemikalija
koja mjenja boju kao rezultat interakcije enzima sa substratom.
 Stopiranje-proces stopiranja djelovanja enzima na substrat. To utiče na zaustavljanje daljnje
promjene boje u ELISA.
 Očitavanje-mjerenje boje stvorene u ELISA. To je mjerenje pomoću posebnog
spektrofotometarskog očitanja sa specifičnim talasnim dužinama za određene boje dobivene
 Optimalno razrjeđenje reagenasa: antigena, seruma, antiseruma...
 Temperatura i vrijeme inkubacije
 Protokol
 Uputstvo proizvođača
 Boja u jamicama-pozitivna reakcija
 Boja zavisi od vrste enzima i substrata (zelena/narandžasta*-narandžasta/smeđa**; plava*-žuta**;
zelena*-zelena**; smeđa*-smeđa**) *-nestopirana reakcija; **-stopirana reakcija (sa stop solucijom)
 Očitavanje spektrofotometrom na određenoj talasnoj dužini (nm)

 Npr. HRP (enzim)-TMB (substrat)-plava boja (nestopirana reakcija)-žuta boja (stopirana

reakcija)-očitavanje na 450 nm
 Direktna ELISA
 Ag dodan na mikrotitarsku ploču se pasivno adsorbuje u inkubacionom periodu
 Nakon inkubacionog perioda ispire se nevezani Ag
 Ab označena sa enzimom (konjugat) specifična za Ag se dodaju i inkubiraju
 Konjugat se veže za Ag adsorbovan na mikrotitarskoj ploči
 Nakon inkubacije nevezani konjugat se ispire
 Dodaje se substrat i enzim katalizira reakciju dajući obojen produkt
 Reakcija je završena nakon određenog vremena (stopirana) i boja se mjeri (očitava) spektrofotometrom
 Indirektna ELISA
 Ag dodan na mikrotitarsku ploču se pasivno adsorbuje u inkubacionom periodu
 Nakon inkubacionog perioda ispire se nevezani Ag
 Dodaju se Ab i inkubiraju sa već adsorbiranim Ag. Specifična Ab će se vezati za Ag. Nevezana Ab će se izaprati
nakon inkubacije
 Dodaju se antiglobulini označeni sa enzimom (konjugat). Antiglobulini su Ab usmjerena protiv određene vrste
životinje u kojoj su originalna Ab stvorena (anti-species)
 Označeni antiglobulini će se vezati za Ab koja su vezana za Ag. Višak konjugata se ispire nakon inkubacionog
perioda
 Dodaje se substrat i razvija se boja kao rezultat prisustva enzima
 Poslije inkubacije razvoj boje se stopira i očitava spektrofotometrom
 Sendvič ELISA (Sandwich ELISA)
 Direktna Sendvič ELISA
 Ab se pasivno vežu za mikrotitarsku ploču u inkubacionom periodu
 Nakon inkubacionog perioda nevezana Ab se ispiru i dodaje se Ag
 Ag se veže za već vezana Ab na mikrotitarskoj ploči. Nevezani Ag se ispire nakon inkubacije
 Dodaju se konjugirana Ab specifična za Ag. Ova Ab mogu biti ista kao i ona korištena na mikrotitarskoj ploči ili od
drugog izvora (vrste).
 Vezivanjem konjugata tokom inkubacije formira se „sendvič“. Nevezani konjugata se ispire nakon inkubacionog perioda
 Dodaje se substrat i omogućava se razvoj boje u određenom vremenskom periodu
 Poslije inkubacije razvoj boje se stopira i očitava spektrofotometrom
 Sendvič ELISA (Sandwich ELISA)
 Indirektna Sendvič ELISA
 Ab se pasivno vežu za mikrotitarsku ploču u inkubacionom periodu
 Nakon inkubacionog perioda nevezana Ab se ispiru i dodaje se Ag
 Ag se veže za već vezana Ab na mikrotitarskoj ploči. Nevezani Ag se ispire nakon inkubacije
 Dodaju se Ab specifična za Ag. Ova Ab su od različite vrste u odnosu na Ab korištena na mikrotitarskoj ploči
 Druga Ab se vežu u toku inkubacionog perioda, a nevezana se ispiru nakon inkubacionog perioda. Ovim se
formira „sendvič“
 Dodaje se anti-species konjugat koji se veže za serum vrste od koje su druga Ab
 Nakon inkubacionog perioda ispire se nevezani konjugat
 Dodaje se substrat i omogućava se razvoj boje u inkubacionom periodu
 Poslije inkubacije razvoj boje se stopira i očitava spektrofotometrom
 Direktna ELISA
 Ag+Ab označeno enzimom+substrat boja

 Indirektna ELISA
 Ag+neoznačeno Ab+antiglobulin označen enzimom+substrat boja

 Sendvič ELISA
 Direktna Sendvič ELISA
 Ab+Ag+Ab označeno enzimom+substrat boja

 Indirektna Sendvič ELISA

 Ab+Ag+Ab+antiglobulin označen sa enzimom+substrat boja
Korisni linkovi:

 https://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100
 https://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-M
 https://www.youtube.com/watch?v=EXQBoYnJ4yk
 https://www.youtube.com/watch?v=849HN1ueUhs
 https://www.youtube.com/watch?v=ECjGF1qMx6w
 https://www.youtube.com/watch?v=CaEwcf5ntWw
 https://www.youtube.com/watch?v=LAV-rkpu3xI
INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE
(IHA)
 IHA sa antitijelima-za identifikaciju specifičnih virusa ili za mjerenje
nivoa antitijela u serumu

 Zasniva se na sposobnosti antitijela da se vežu za hemaglutinacijske

izdanke virusa i da neutrališu njegovu sposobnost aglutinacije
eritrocita
 Ako izostane aglutinacija eritrocita-u serumu su prisutna antitijela za
virus od interesa

 Može se koristiti da se ustanovi da li izolat nekog virusa pripada ovoj

vrsti virusa.