‫تقدير البروتين في الحليب‬

‫• الهدف‪:‬‬
‫‪ -1‬تقدير المحتوى الكلي للبروتين في الحليب‪.‬‬

‫• المقدمه واألساس‪:‬‬
‫يحتوي الحليب على سكر الالكتوز‪ ,‬دهون‪ ,‬وبروتينات‪ .‬البروتين يتضمن‬
‫بروتين الكازين (بروتين فوسفاتي) الذي يكون ‪ %80‬من المحتوى‬
‫البروتيني للحليب‪ ,‬باإلضافه لبروتين الالكتوالبيومين‪ ,‬وقليل من‬
‫الالكتوجلوبيولين‪ .‬هناك أيضًا كميات كبيره نسبيا من الكالسيوم ‪ ,‬الفوسفات‬
‫و فيتامين ‪ A‬وفيتامين ‪ ,B2‬و كميات بسيطه من فيتامين ‪B1 , C , D3‬‬
‫والحديد‪.‬‬
 ‫• اللون األبيض للحليب بسبب السوائل المستحلبه و الملح الكالسيومي‬
‫للكازين‪ .‬المحتوى الدهني لحليب األم يساوي محتواه في حليب البقر‬
‫ولكن حليب األم يحتوي كميات أكبر من الالكتوز وكميات أقل من‬
‫البروتين والكالسيوم والفوسفات‪.‬‬

‫• اللبأ (وهو اول حليب االم) يكون اكثر إصفرارا‪ ،‬ويحتوي على ضعف‬
‫كمية البروتين الموجود في باقي حليب األم والمتضمن بروتين األجسام‬
‫المناعية (األميونوجلوبين(‪) )Immunoglobulins‬‬
 ‫• يقدر المحتوى البروتيني للحليب على أنه كازين باستخدام ”تفاعل يسمى‬
‫تفاعل البايوريت“ ((‪ .Biuret reaction‬هذا التفاعل يعطي نتيجة (لون‬
‫بنفسجي) مع المواد البيبتيديه (أي البروتينات والبيبتيدات) المحتويه على‬
‫األقل على رابطتين بيبتيديتين‪,‬‬
‫بالتالي لن يعطي نتيجة مع ثنائي الببتيد ألنه يحتوي فقط على رابطة ببتيدية‬
‫واحده بين حمضين أمينيين‪ ،‬وكذلك األحماض األمينية الحره بسبب عدم‬
‫احتوائها على روابط ببتيدية‪.‬‬

‫• في الوسط شديد القاعديه تكون الببتيدات و البروتينات معقد مع ايون النحاسيك‬

‫‪( ++Cu‬ملح النحاسيك) والذي له لون بنفسجي يمكن قياسه باستخدام جهاز‬
‫‪.spectrophotometer‬‬
 ‫• إختبار البايوريت (تفاعل البايوريت)‪:‬‬
‫إختبارالبايوريت مصلح عام يطلق على أي اختبار يكشف عن‬
‫البروتينات باستخدام محلول كبريتات النحاس (‪ )CuSO4‬في وسط‬
‫قاعدي‪.‬‬
‫الهدف من اإلختبار‪ :‬للكشف عن البروتينات كميا ونوعيا‪.‬‬
‫أساس االختبار‪:‬‬
‫سمي اإلختبار بالبايوريت كناية عن البروتينات والبيبتيدات التي يتم‬
‫الكشف عنها بواسطة هذا اإلختبار‪ .‬لماذا؟‬
‫ألن البايوريت يحتوي على رابطتين بيبتيديتين ‪.‬‬
 ‫• يتكون البايوريت نتيجه لتسخين جزيئين من اليوريا‪.‬‬
‫‪2NH2 – CO – NH2‬‬ ‫‪NH3 + NH2-CO- NH –CO-NH2‬‬
‫يوريا‬ ‫بايوريت‬

‫الكاشف المستخدم‪ :‬هو كاشف البايوريت‪ ,‬وهو الكاشف المستخدم بشكل شائع‬
‫في اختبار البايوريت‪.‬‬
‫يتكون كاشف البايوريت من هيدروكسيد البوتاسيوم أو الصوديو(‪,KOH‬‬
‫(‪ , NaOH‬كبريتات النحاس‪ ,‬وصوديوم بوتاسيوتارتاريت‪ .‬لون هذا الكاشف‬
‫أزرق يتحول إلى بنفسجي في وجود البروتينات‪ ,‬وإلى زهري أو بنفسجي‬
‫ارجواني في وجود سالسل البيبتيد القصيره‪.‬‬
 ‫• يتفاعل الكاشف مع البيبتيدات والبروتينات ليعطي لون بنفسجي‬
‫أوأرجواني من معقد بيبتيدات النحاس المتكون‪.‬‬

‫• يمكن الكشف عن المعقد اللوني كميا باستخدام جهاز السبيكتروفوتوميتر‬

‫في منطقة موجات الضوء البصريه (المنطقه البصريه (‪Visible‬‬
‫‪ .) )region‬يتناسب اللون المتكون طرديامع عدد الروابط البيبتيديه‬
‫الموجوده في البروتين‪.‬‬
 ‫• في هذه التجربه سوف يتم الكشف عن بروتين الكازين في الحليب‬
‫بواسطة اختبار البايوريت و من خالل المنحنى القياسي لمحلول بروتين‬
‫الكازين القياسي‪.‬‬
 ‫أ‪ -‬تقدير البروتين (الكازين)‪:‬‬

‫طريقة العمل‪:‬‬
‫‪ -1‬حضري ‪ 8‬انابيب و سميها كالتالي‪:‬‬
‫‪ A (blank) ، B‬و )‪. H (sample‬‬ ‫‪F (standard)، G‬‬

‫‪ -2‬اتبعي الجدول التالي ‪:‬‬

 ‫‪Stock casein‬‬
‫تركيز الكازين‬ ‫‪Diluted milk‬‬ ‫ماء مقطر‬
‫‪solution‬‬ ‫األنبوبة‬
‫)جرام \ دسل(‬ ‫)مل(‬ ‫)مل(‬
‫)مل(‬

‫‪0‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪A‬‬

‫‪0.16‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪B‬‬

‫‪0.32‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1.5‬‬ ‫‪C‬‬

‫‪0.48‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪1.5‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪D‬‬

‫‪0.64‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫‪E‬‬

‫‪0.80‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪F‬‬

‫?‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪G‬‬

‫?‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪H‬‬

 ‫‪ -3‬رجي االنابيب حمام مائي ‪ ْ37‬م (‪ 5‬دقائق)‪.‬‬
‫رجي‬ ‫‪ -4‬اضيفي لكل االنابيب ‪ 5‬مل من (‪)Biuret reagent‬‬
‫حمام مائي ‪ ْ37‬م (‪ 20‬دقيقة) ‪.‬‬ ‫االنابيب باستخدام ‪vortex‬‬
‫‪ -5‬قيسي االمتصاص بواسطة ‪ spectrophotometer‬عند طول‬
‫موجي ‪. nm 540‬‬
‫‪ -6‬ارسمي ‪ standard curve‬لالمتصاص مقابل التركيز باستخدام نتائج‬
‫االنابيب ‪. B F‬‬
‫‪ -7‬من ‪ standard curve‬قدري تركيز الكازين في المحلول ‪ G‬و‪.H‬‬
 ‫النتائج‪:‬‬
‫األمتصاص عند‬ ‫تركيز الكازين‬ ‫تركيز الكازين‬
‫األنبوبة‬
‫‪540 nm‬‬ ‫)جرام \ لتر(‬ ‫)جرام \ دسل(‬
‫‪1.6‬‬ ‫‪0.16‬‬ ‫‪B‬‬
‫‪3.2‬‬ ‫‪0.32‬‬ ‫‪C‬‬
‫‪4.8‬‬ ‫‪0.48‬‬ ‫‪D‬‬
‫‪6.4‬‬ ‫‪0.64‬‬ ‫‪E‬‬
‫‪8‬‬ ‫‪0.80‬‬ ‫‪F‬‬
‫?‬ ‫?‬ ‫‪G‬‬
‫?‬ ‫?‬ ‫‪H‬‬
 ‫حيث أننا سنقوم بحساب متوسط التركيز لكل عينه ( ‪)`G1,1` & H2,2‬‬
‫التركيز من الرسم‬
‫متوسط التركيز‬ ‫)جرام \ لتر(‬ ‫األمتصاص‬ ‫األنبوبة‬

‫‪G‬‬

‫‪H‬‬

‫تركيز ‪ stock casien solution= 0.8‬جرام \ دسل = ‪ 8‬جرام \ لتر‬

‫الحسابات‪:‬‬
‫تركيز الكازين في الحليب الغير مخفف (جرام \ لتر) = تركيز الكازين من الرسم‬
‫(جرام \ لتر) × ‪10‬‬

‫• التركيز الطبيعي للكازين في الحليب ( ‪ 40 – 28‬جرام \ لتر)‬