Hatóanyag szállító rendszerek, célzott tumorterápia

Mező Gábor
A téma jelentősége

Halálozási okok:

1. Szív és érrendszeri
megbetegedések
COVID?
2. Daganatos
megbetegedések

65 év alattiak között
vezető halálok;
az összes beteg 40%-a
 Rákstatisztika az európai országok tekintetében

 A világon 2020-ban > 19 millió esetszám és 10 millió haláleset volt a rák betegséghez köthető.
 2040-re >24 millió esetszámmal számol a WHO.
 Új, hatékonyabb terápiás eljárásokra van szükség, a halálozási szám emelkedésének elkerülésére.
 Rákstatisztika az USA-ban
(fejlett országokban hasonló tendenciák)

CA A Cancer J Clinicians, Volume: 73, Issue: 1, Pages: 17-48 (2023)

 A tíz leggyakoribb daganatos megbetegedés és
leggyakoribb halált okozó rák típus

Nagy esetszám – elég jól gyógyítható: Nagy esetszám – rosszul gyógyítható:

emlőrák (~66%-os túlélés) tüdőrák (~16%-os túlélés)

Nagy esetszám – viszonylag jól gyógyítható: Kis esetszám – rosszul gyógyítható:

vastagbélrák (~47%-os túlélés) hasnyálmirigyrák (~5%-os túlélés)

 Mi a rák?
A megbetegedéseknek egy komplex csoportja, amelyre a következők jellemzők:

 kontrollálatlan sejtszaporodás
 a szomszédos sejtek megtámadása
 metasztázis: a test más részeire is átterjedhet
 megtámadhatja a test bármely részét
 bármely életkorban előfordul, de az életkor előrehaladtával a rizikó növekszik

Normál sejt Rák: a genetikai anyagban

történő abnormális változás okozza

A sejt még normálisnak tűnik, de

Első mutáció hajlamossá válik fokozott osztódásra

A sejt gyors osztódással

2. mutáció szaporodik, de még mindig
normálisnak tűnik

Sejt proliferáció egyre

3. mutáció gyorsabb,
strukturális változások
Rákos sejt
Kontrollálatlan
4.+ mutáció sejtszaporodás

jelentős morfológiai változások http://www.google.de/images

 A rák kialakulása - sejtszinten
abnormális rosszindulatú
normális abnormális sejt rákos,
sejt sejt sokszorozódása invazív sejt

Egészséges sejtek

nyirokhálózat

vérerek

elsődleges tumor

lokális invázió
angiogenezis:
tumornövekedéshez
saját érhálózat kell

nyirokhálózat

metasztázis:
Ráksejtek
a ráksejtek elvándorolnak
a test más tájaira a véráram
vagy a nyirokhálozaton keresztül
vérerek
 A rák terápiás kezelései

Sebészeti beavatkozás: Sugárkezelés (radioterápia):

Jól hozzáférhető, jól körülhatárolt tumorokra  szilárd tumorok
 leukémia esetén is
Nem alkalmas:
 hematológiai tumorokra (leukémia)
 metasztázisok kezelésére

Kemoterápia: O
N
N
O

OH O

cisplatin doxorubicin taxol kamptotecin 5-fluoruracil

 A tumorellenes szerek hatása

5-fluoruracil
gemcitabin

ciklofoszfamid
melfalán
klorambucil

antraciklinek:
doxorubicin
daunorubicin
epirubicin
 Néhány gyakran alkalmazott kombináció

Betegség Gyógyszerek Rövidítés

emlőrák ciklofoszfamid, metotrexát, 5-fluorouracil CMF

emlőrák doxorubicin, ciklofoszfamid AC

Hodgkin-kór musztin, vinkrisztin, prokarbazin, prednizolon MOPP

Hodgkin-kór doxorubicin, bleomicin, vinblasztin, dakarbazin ABVD

non-Hodgkin limfómák ciklofoszfamid, doxorubicin, vinkrisztin, prednizolon CHOP

ivarsejtes tumorok bleomicin, etopozid, ciszplatin BEP

gyomorrák epirubicin, ciszplatin, 5-fluorouracil ECF

gyomorrák epirubicin, ciszplatin, kapecitabin ECX

hólyagrák metotrexát, vinkrisztin, doxorubicin, ciszplatin MVAC

tüdőrák ciklofoszfamid, doxorubicin, vinkrisztin CAV

vastag- és végbélrák 5-fluorouracil, folinsav, oxaliplatin FOLFOX

 A kemoterápia mellékhatásai
Kemoterápiás szerek:
 a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (ráksejtek)
 de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is
és károsítják azokat
pl. csontvelő (vérképző szerv) sejtjei,
emésztőszervek
hajhagymákat tartalmazó tüsző

A kemoterápia legáltalánosabb mellékhatásai:

- mieloszuppresszió (vérsejtek képződésének csökkenése)
- immunszuppresszió (érzékenység fertőző betegségekre)
- mukozitisz (bél és emésztő rendszer gyulladása, hányás)
- alopecia (foltos hajhullás)

Egyedi toxikus hatások: kardiotoxicitás (doxorubicin), veseelégtelenség, ödémásodás,

májfunkció zavarai, terratogén (magzat károsító) hatás

Új gyógyszerek előállításának fő célja a szelektivitás növelése, ezáltal a mellékhatások csökkentés.

Célzott tumor kemoterápia szemben a hagyományos kemoterápiával

Hagyományos kemoterápia Célzott kemoterápia

 szelektivitás hiánya
 gyors kiürülés a szervezetből
 multidrog rezisztencia
 gyógyszer specifikus
mellékhatások
 fokozott szelektivitás
 csökkent nem kívánatos
toxicitás
 gyógyszer rezisztencia
elkerülése

MAGIC BULLET
 Egy kis kitérő az operák világába

Carl Maria von Weber

(1786-1826)
A bűvös vadász
Dalszöveg: Johann Friedrich Kind írta Johann August Apel és Franz Laun Kísértetkönyv című könyve alapján

Egy udvari másoderdészi cím és egy lány kezének biztos elnyeréséért, Max a sötét hatalmak erejét igénybe
véve mágikus golyókat öntet, hogy minden lövése célba találjon (hat golyó, de van egy hetedik).

Mi is ilyen mágikus golyót szeretnénk készíteni a rák ellen,

de nem a sötét hatalmak, hanem a tudomány segítségével.
 A mágikus golyó elmélete

Oldallánc elmélet

Paul Ehrlich (1854-1915)

 1908 Orvosi Nobel Díj : immunológiai kutatásokért

Oldallánc elmélet
 1909 Salvarsan felfedezése (szifilisz elleni gyógyszer)
 Kemoterápia elnevezés
Receptor elmélet
 Mágikus golyó (Magic bullet, Zauberkugel)

Oldallánc, ami csak a parazitákon található, de a megtámadott sejten vagy szerven nem

Hatóanyagok szelektív célbajuttatása ellenanyagok segítségével

 Célpont
A terápia fokozott szelektivitásának lehetősége
az egészséges sejtek és a tumorsejtek különbségén alapul
Néhány különbség az egészséges és tumorsejtek, szövetek között:

1. Sejtfelszíni (pl. tumorspecifikus vagy túltermelődött receptor)

Ismert : hormon receptorok

tumorsejt (pl. GnRH)
egészséges sejt
Nem ismert: fág-bemutatással
kiválasztott

2. Sejtbeni (pl. enzimek, egyéb fehérjék eltérő mennyiségben, minőségben)

katepszin B mátrix metallopeptidáz 9

(MMP9)

3. Lokalizálható „szilárd” tumorok (pl. újonnan kialakult vérerek)

Az érhálózat szerkezete: normális esetben és a tumorok környezetében

~ 80-150 nm méretű rések

A megfelelő méretű nanorészecskék a tumor környezetében ki tudnak lépni az erekből,

míg a normális érfalon keresztül nem jut ki, más egészsége szövetekben (szelektivitás).
A kismolekulák át tudnak jutni a normális érfalon is.
Doxil® (liposzómába csomagolt doxorubicin)

Az első, 1995-ben az FDA által engedélyezett nanodrog.

Alkalmazások:

• Petefészekrák
• AIDS-szel kapcsolatos Kaposi szarkóma
• Mieloma multiplex (vérképző szervi tumor)
 A 2-pirrolino-doxorubicin kifejlesztése és alkalmazása

[D-Lys6]-GnRH-I
Glp: piroglutaminsav

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Klinika-III fázisban elbukott
O OH O
O NH
OH
O O
OMe O OH O NH2
O
OH
Andrew V. Schally
1977 Orvosi Nobel Díj
Doxorubicin

O OH O O OH O
CH3 CH2-OH
OH OH

CH3O O OH O NH2 CH3O O OH O NH2 [D-Lys6]-GnRH-I

O O
OH OH 2-pirrolino-doxorubicin
CH3 CH3
Daunomicin Doxorubicin
 2-Pirrolino-daunomicin (PyDau) és liposzómás készítménye

 Új szintézis módszer a 2-pirrolino daunomicin előállítására:

nagy mennyiségben stabil, eltartható állapotban;

 A Doxil-készítményhez hasonlóan liposzómázható volt;

 Érdekes módon a PyDox liposzómába zárása nem adott

stabil liposzómás készítményt (hatóanyag szivárgásc;
R: H (PyDau); OH (PyDox)

A liposzómázott PyDau (LiPydau) jellemzése

elektronmikroszkópos és fényszórásos
technikával.
A 2-pirrolino-daunomicinin vitro citotoxicitása tumor sejt vonalakon

A PyDau ( ) 10-1000-szer nagyobb citotoxikus

hatást mutat (0,23-14,28 nM) a különböző tumorsejt
vonalakon (41 tumorsejt vonal típus), mint a
daunomicin ( ) és a doxorubicin ( ).

A PyDau multidrog rezisztens tumorsejteken (MDR)

is hatásosnak mutatkozott (HCT-15 (H),
NCI-ADR/RES (N), MES-SA/Dx5 (D).
A LiPyDau (LAX) in vivo tumornövekedés gátló hatása 4T1 egér tumor modellen
4T1 egér emlőtumor: gyorsan növekedő, invazív, erősen metasztatizáló tumorsejt.
Balb/c egerek

1 mg/ttkg
5 mg/ttkg

Biolumineszcencia detektálás
 A LiPyDau (LAX) in vivo tumornövekedés gátló hatása egér tumor modellen
B16 egér melanoma Lewis lung cancer (egér tüdő tumor)

Patient derived tumor model:

(tüdő tumoros beteg szövetéből
kialakított tumoros immun-
hiányos egér)
 A LiPyDau (LAX) kezelési koncentrációjának az optimalizálása
FEC (kombinált kezelés) Genetikailag kialakított TNBC egér modellen:
24 mg/kg Fluoruracil
4 mg/kg Epirubicin TNBC: triple negatív breast cancer (aggresszív,
120 mg/kg Ciklofoszfamide erősen metasztatizáló, rossz prognózisú emlő-
2x1 mg/ttkg LAX
tumor, nincs ösztrogén és progeszteron receptor
és nincs vagy kevés HER-2 )

100
Saline (n=4)
LAX 0.25 mg/kg (n=7)
80
DOX 5 mg/kg (n=4)

Percent survival
FEC (n=5)
60
LAX 0.5 mg/kg (n=4)

40 LAX 1 mg/kg (n=4)

1x1,5 mg/ttkg LAX 3x0.5 mg/ttkg LAX LAX 1.5 mg/kg (n=6)
LAX 3 × 0.5 mg/kg (n=5)
20

0
0 100 200 300 400 500 600 700
Days

3x0.5 mg/ttkg LAX (80%-os gyógyulás)

1x1,5 mg/ttkg LAX (50%-os gyógyulás)
 Célzott tumorterápia:
szelektív hatóanyag célba juttatás irányító molekulákkal

konjugált hatóanyag
konjugált hatóanyag szabad hatóanyag
receptor-közvetített összekötő
összekötő endocitózis irányító molekula
irányító molekula
receptor

hatás helye

vezikula

lizoszóma
szabad hatás helye
hatóanyag endoszóma

tumorsejt egészséges sejt

A tumorsejteken túlexpresszálódó potenciális target peptid receptorok:

GnRH, somatosztatin, neurotenzin, neuropeptid Y, szubsztansz-P, bombezin, kolecisztokinin, PACAP, RGD-integrinek,
APN (CD13), VEGFR, EGFR, HER-2, neuropilin-1, MMP-2, MMP-9, HSP90/70, stb.

Mező G, Manea M. (2010) Expert Opinion on Drug Delivery 7, 79-96

 Ellenanyag – hatóanyag konjugátumok
(Antibody Drug Conjugates; ADCs)
Adcetris (Seattle Genetics, Bothell, WA)
brentuximab vedotin

Katepszin B PABC
kapcsoló egység monometil-auristatin E (MMAE)
hasítható rész spacer

antimitotikus hatású
(tengeri kagylóból izolálták)

Ciszteinhez kapcsolva 1-2 hatóanyag az ellenanyagon

Alkalmazás: non-Hodgkin limfóma

 Ellenanyag – hatóanyag konjugátumok
(Antibody Drug Conjugates; ADCs)
Kadcyla (Genentech, South San Francisco, CA)

Mertansine (emtansine, tubulin inhibítor)

Trastuzumab
(HER2 receptor
ellenanyag)

DM1/Mab ~ 3,5

DM1

MCC: 4-(maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate

Ellenanyag vagy kismolekula - hatóanyag konjugátumok
(ADCs vs. SMDCs)

Előnyök Hátrányok

ADCs: nagy specifitás rossz permeabilitás

hosszú élettartam esetleges immunogenitás
hatékony internalizáció kevés hatóanyag
alacsony terápiás index
magas költségek

SMDCs: tumor szelektivitás kisebb mint az ADCs

magas hatóanyag tartalom gyors metabolizmus
nem immunogén és kiürülés
nagyobb szövet penetráció
olcsóbb
Célzott tumorterápiára alkalmas peptid-hatóanyag konjugátumok felépítése

cleavable linker non-cleavable linke

free drug release active metabolite release

drug linker homing peptide

A konjugátumok tumorellenes hatását befolyásoló tényezők

receptor-ligand sejten belüli

kötődés lizoszómális
erőssége, degradáció
internalizáció hatékonysága

konjugátumban lebontás
konjugátum során keletkező
található
hatóanyagok tumorellenes metabolitok
száma hatása szerkezete

hatóanyag metabolit
tumorellenes lokalizációja
hatása a sejtben
 Egy majdnem sikeres peptid-drog konjugátum

[D-Lys6]-GnRH-I

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
O OH O
O NH
OH
O O
OMe O OH O NH2
O
OH
Zoptarelin - doxorubicin
Andrew V. Schally
Doxorubicin
1977 Orvosi Nobel Díj

 [D-Lys6]-GnRH-I egy GnRH-I agonista analog

 Észter-kötéssel kapcsolják (glutársavon keresztül) a doxorubicinhez
 Klinikai Fázis III-ban emlő, petefészek és méh daganatokra (elbukott)
 Észter-kötés gyors lebomlása humán szérumban (t1/2 ~ 2 óra)
karboxil-észterázok hatására (egér kísérletekben észteráz gátlók)
 Gonadotropin-releasing hormon (GnRH, LHRH)

GnRH-I (human): Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

 a hipotalamuszban termelődő dekapeptid neurohormon
 a reprodukciót kontrolálja a hipofízisben történő luteinizáló hormon (LH) és
folliculus stimuláló hormon (FSH) szekréciójának szabályozása útján.
A GnRH agonisták és antagonisták alkalmazása tumor terápiában

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Agonista: Triptorelin
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

X
Antagonista: Cetrorelix
Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 X

Nal: 2-naftillalanin X
Cpa: p-klórofenilalanin
Nem természetes aminosvak
Pal: 2-piridilalanin
Cit: citrulin
A B
X
GnRH agonista GnRH antagonisat

Serum hormone level

Serum hormone level

Szérum hormon szintet

a kasztrációs szint alá csökkenteni
(kémiai kasztráció)
10 20 day 4 8 12 24 hour
 A GnRH analógok direkt és indirekt hatása tumorokon

A tumor terápiában alkalmazott GnRH agonista és antagonista peptidek

indirekt hatás direkt hatás

a szex szteroid termelődés gátlása antiproliferatív hatás
(hormon függő tumorok) tumoron lévő GnRH receptorok közvetítésével

GnRH receptorok
 számos ráksejten detektálták: emlő, prosztata, ovárium, vastagbél,vese, agy, stb.
 az egészséges szöveteken elhanyagolható
 a reproduktív szervek szöveteiben jelen vannak, de kisebb mennyiségben

Schally, A.V. at. al. (1971) Science. 173, 1036

Nagy, A., Schally, A.V. (2005) Biol. Reproduction. 73, 851
GnRH receptor és szignál útvonalak a tumorsejtekben

GnRH-I GnRH-II

GnRH-R RPTK
Gai
P GRB2
SOS
PTP
p38 JNK
RAS
PI3K
RAF
AP-1 c-Jun P
AKT MAPKK P
EGFR

MAPK P
Cell proliferation
c-fos TCF P
A GnRH receptorokon keresztüli specifikus célbajuttatás

GnRH receptorok ráksejteken:

> 50% emlő tumor
~ 100% melanoma
> 70% petefészek tumor
> 90% prosztata tumor
> 75% méhnyak/méhnyálkahártya tumor
> 80% vese tumor
> 40% agy tumor
> 90% non-Hodgkin limfoma

tartalmaz GnRH receptorokat

GPCR: G-protein kapcsolt receptor (7TM)

GnRH receptorok megtalálhatók az egészséges sejteken, különösen a reproduktív

szervek szöveteiben, de lényegesen kisebb mennyiségben.

Ezért a GnRH receptorok jó célpontok a tumorterápiában.

 Hatékony Doxorubicin-[D-Lys6]-GnRH-I biokonjugátumok

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
O O
O OH O
O OH O
O
O
OH O O
OH
O O OH O O O OH O
CH3
CH3
O
O
CH3 NH 2 N
CH 3
OH
OH

AN-152: [D-Lys6]-GnRH(Dox-14-O-glutarate) (AN-207)

Klinika Fázis-III
(ovárium, endometrium és emlő tumorokra)

t1/2 = 19.49 ± 0.74 perc (egér szérum) és 126.06 ± 3.03 perc (human szérum); 0.3 mg/mL konc.
t1/2 = 69.63 ± 4.44 perc (egér szérum) diizopropil fluorofoszfát (DFP) karboxilészteráz (CE) gátló jelenlétében.

MTD (maximum tolerálható dózis): 200 nmol 2x 400 nmol (CE jelenlétében)

Nagy A. et al. (2000) PNAS 97, 829

Az antraciklinek bomlása tömegspektrometriás mérés során

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
O OH O
O NH
OH
O O
OMe O OH O NH2
O
OH

O-N acilvándorlás detektálható

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
O OH O
O NH
OH
OH <EHWSY-D-Lys-LRPG-NH2
O O
OMe O OH O NH2-CO-(CH2)3-CO-NH
O
OH
inaktív anyag
ugyanazzal a tömeggel
Pethő L, et al. Molecules 24, 2981 (2019)
 Lamprey GnRH-III

GnRH-III: nagy tengeri ingolából (Petromyzon marinus) izolált1

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

 nagy affinitással kötődik mind a GnRH-I and GnRH-II receptorokhoz; 2

 nincs szignifikáns LH and FSH felszabadító hatása emlősökben; 3

 direkt antiproliferativ hatása van emlő, prosztata és ovárium tumorset vonalakon; 4

 szelektív tumorellenes hatás;

 a 8Lys oldallánca módosítható a hatás elvesztése nélkül; 4-6
 a természetes GnRH származékok (izoforma) között a leghatékonyabb tumorellenes hatású.

1. Sower S.A. et al. Endocrinology (1993) 86, 1125

2. Miller R.P. TRENDS in Endocr. Metabol. (2003) 14, 35
3. Kovács M. et al. J. Neuroendocrinol. (2002) 14, 647
4. Mező I. et al. J. Med. Chem. (1997) 40, 3353
5. Pályi I. et al. Drugs of the Future (2001) 26, 51
6. Herédy-Szabó K. et al. Peptides (2005) 26, 419
 Antraciklinek mint tumorellenes hatóanyagok

oxim, hidrazon oxim, hidrazon észter

O OH O OH
O OH O

aglikon rész OH
OH (tetracikline
gyűrű rendszer)

CH3O O OH O NH2 amid CH3O O OH O NH2 amid

O O
OH OH
daunozamin
(a-glikozidos kötés) CH3 CH3

Daunorubicin/daunomicin (Dau) Doxorubicin/adriamicin (Dox)

Antitumor hatás: Toxikus mellékhatások:

- DNS interkaláció (C-G bázispár közé) - kardiotoxicitás (Dau < Dox)
- topoizomeráz II blokkolása - nefrotoxicitás (vesekárosodás)
- szabadgyök képződés - toxicitás a gyorsan osztódó sejteken
(lipid peroxidáció befolyásolása) (bőr, bélhám, csontvelő)
- immunszuppresszió, etc.
 GnRH-III antraciklin konjugátumok
<EHWSHDWKPG-NH2 Savlabilis kötés
lizoszóma pH < 5 <EHWSHDWKPG-NH2
N-O-CH2-CO-GFLG-
O OH N-NH-CO-CH2-CH2-CO-
X O OH
X
OH lizoszomális enzimekkel
hasítható OH

CH3O O OH O NH2
CH3O O OH O NH2
O
OH O
OH
CH3
CH3
oxim-kötés hidrazon-kötés
X = H (Dau) or OH (Dox) X = H (Dau) or OH (Dox) Szabad hatóanyag szabadul fel!

O OH O
<EHWSHDWKPG-NH2 X

O OH O O-CO-(CH2)3-CO-
OH

OH észterázokkal <EHWSHDWKPG-NH2
hasítható CH3O O OH O NH-CO-(CH2)3-CO-Y-

CH3O O OH O NH2 O
OH
O CH3
OH
amid-kötés
észter-kötés CH3
X = H (Dau) or OH (Dox); Y = Ø or GFLG
Szabad hatóanyag szabadul fel!

Mező, G., Manea, M. et al. (2008) Curr. Med. Chem. 15, 2366
 A szabad hatóanyag felszabadulása PABC linkert
tartalmazó konjugátumból

PABC spacer:
p-aminobenziloxikarbonil
Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
Ac-Cys
O O
H
S
N
Phe-Lys- N
O NH OH
O
O Katepszin B O OH
hasító hely O
O

HO OH
Phe-Lys CH2
O O
Val-Ala
Val-Cit + CO2 OMe

NH

Szabad hatóanyag szabadul fel!

Schlage, P. et al. J. Control. Release 156, 170–178 (2011)
A daunomicin és GnRH-III konjugátumainak in vitro citosztatikus
hatása MCF-7 (emlő) és HT-29 (vastagbél) tumorsejteken

Konjugátum Citosztázis (MCF-7) Citosztázis (HT-29)

IC50 (µM) IC50 (µM)

Daunomicin 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,2

Hidrazon Dau-GnRH-III 0,5 ± 0,2 2,4 ± 0,5

Dau-PABC-GnRH-III 0,4 ± 0,0 1,7 ± 0,2

Oxim Dau-GnRH-III 7,8 ± 2,1 17,9 ± 4,0

Oxim Dau-GFLG-GnRH-III 3,9 ± 1,2 22,5 ± 1,7

Amid Dau-GnRH-III > 100 > 100

In vitro citosztatikus hatás (IC50 érték) meghatározása MTT teszttel.

MTT = 3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid
GFLG: -Gly-Phe-Leu-Gly- (Katepszin B által hasítható spacer) GnRH-R mennyiség:
MCF-7 > HT-29
Mező, G. et al. Curr. Med. Chem., 15, 2366-2379 (2008)
Szabó, I et al. Bioconjug. Chem., 20, 656-665 (2009) humán emlő illetve humán vastagbél
Orbán, E. et al. Amino Acids, 41, 469-483 (2010)
adenokarcinoma
Schlage, P. et al. J. Control. Release 156, 170-178 (2011)
 MTT teszt

csak élő sejtben

-
(színtelen) (lila szín)
citosztázis
citosztázis [%]
[%] == 100
100**(1-A
(1-Aminta /A kontroll))
minta/Akontroll

λm = 540 nm; λ ref = 620 nm

A540-A620

IC50 érték
(inhibíciós koncentráció):
az a koncentráció
(kezelő anyag),
ahol a sejtek 50%-a
elpusztult)
 In vivo vizsgálatokra kiválasztott oxim-kötést tartalmazó
daunomicin-GnRH-III konjugátumok
Oxim-kötés:

R R
pH 5-7
C=O + H2N-OH C=N-OH
-H2O
R’ R’
R’ = H (aldehid) hidroxilamin oxim
R’ = alkil, aril (keton)

<EHWSHDWKPG-NH2 <EHWSHDWKPG-NH2
N-O-CH2-CO- N-O-CH2-CO-GFLG-
O OH O OH
H H

OH OH

CH3O O OH O NH2 CH3O O OH O NH2

O O
OH OH
CH3 CH3

GnRH-III(Dau=Aoa) GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)

Aoa: aminooxiacetil (NH2-O-CH2-CO- ); védett aminooxiecetsav kapcsolása a peptidhez

 A konjugátumok lebomlása Katepszin B hatására

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
H-Lys-OH
N-O-CH2-CO-
O OH N-O-CH2-CO-
H O OH
H
OH
OH

CH3O O OH O NH2
CH3O O OH O NH2
O
OH O
OH
CH3
CH3

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2
N-O-CH2-CO-Gly-Phe-Leu-Gly-
O OH N-O-CH2-CO-Gly-OH
H O OH
H
OH
OH

CH3O O OH O NH2 CH3O O OH O NH2

O
OH O
OH
CH3
CH3

A metabolitok is képesek kötődni a DNS-hez (aminosav függő módon)

Orbán, E. et al. Amino Acids, 41, 469-483 (2010)
 A Dau és a Dau-GnRH-III biokonjugátum toxicitása
egészséges BDF-1 nőstény egereken

25

24

23
Egerek testtömege (g)

22

kontroll
21
GnRH-III(Dau=Aoa), 30 mg/kg (Dau tartalom)
20 GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG), 30 mg/kg (Dau tartalom)
Daunorubicin, 2 mg/kg
19 Daunorubicin, 10 mg/kg
kezelési napok
18

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Napok

Manea, M. et al. (2012) Anti-Cancer Drugs, 23(1):90-97

 A Dau-GnRH-III biokonjugátum in vivo antitumor hatása
HT-29 human vastagbél tumort hordozó SCID nőstény egereken
szubkután (bőr alá) beültetett tumor
3.0
kontroll

2.5 GnRH-III(Dau=Aoa)
GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)
100%
kezelés
2.0
Tumor térfogat (cm3)

1.5

55,7% (P = 0.0041)

1.0
42,4% (P = 0.0012)

0.5

0.0
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tumor beültetést követő napok száma

Egerek kezelése a biokonjugátummal i.p. (15 mg Dau tartalom/kg) i.p.: intraperitoneális

Egerek kezelése i.p. 5 mg Dau/kg 14. napra valamennyi elpusztult (hashártyán belüli tér)
Egerek kezelése i.p. 2 mg Dau/kg 19. napra valamennyi elpusztult Manea, M. et al. (2012) Anti-Cancer Drugs, 23(1):90-97
 A tumornövekedés gátlása (szubkután beültetett tumor)

35. nap

Kontroll GnRH-III(Dau=Aoa) GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)

3,0

2,5
Tumor tömeg (g)

2,0

1,5

1,0
100%
59%
0,5 50%

0,0
Kontroll GnRH-III(Dau=Aoa) GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)
 A Dau-GnRH-III biokonjugátum in vivo antitumor hatása
HT-29 human vastagbél tumort hordozó SCID nőstény egereken
(AN-152)
35. napon
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
3.0 Dox-OOC-(CH2)3-CO

2.5
1.1 ± 0.4 (HT-29); 0.2 ± 0.1 (MCF-7)

Tumor térfogat: 41% inhibíció a kezeletlen kontrollhoz képest

2.0 Tumor tömeg: 24% inhibíció a kezeletlen kontrollhoz képest
Tumor tömeg (g)

Szepeshazi K., et al. Int. J. Oncol. (2007), 30, 1485.

1.5

100%
1.0

59%
0.5 50%

0.0
kontroll GnRH-III(Dau=Aoa) GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)

Manea, M. et al. (2012) Anti-Cancer Drugs, 23(1):90-97

A vérerek száma kezelt és kezeletlen tumorszövetekben

Kontroll GnRH-III(Dau=Aoa-GFLG)

26,3±6,7 12,3±6,5
vérerek száma
Szabad hatóanyagok és GnRH konjugátumaik kardiotoxicitása

Doxorubicin és daunorubicin
kardiotoxikus µM-os koncentrációban;

Metotrexát nem;

Észter-kötéssel kapcsolt Dox-konjugátum

kisebb mértékben, de toxikus;

Oxim-kötéssel kapcsolt Dau/Dox

nem toxikus.

HUVEC (human umbilical vein endothelial cells)

és HCM (primary human cardiac myocytes)
sejteken mérve.
Daunorubicin-GnRH-III biokonjugátumok rövidszénláncú zsírsavakkal

Glp-His-Trp-Lys(X)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2
Lizoszomális lebomlás:
H-Lys(Dau=Aoa)-OH legkisebb metabolit Enzim stabilitás Citosztázis (IC50)
kimotripszin; 6 óra MCF-7 HT-29
acetil 44% 3,1±1,7 7,4 ±2,6

propionil 55% 3,6±0,7 17,2±2,9

izo-butiril10% 2,2±0,0 2,0±0,6

kimagasló
sejtfelvétel
butiril 64% 0,7±0,2 2,2±0,6

krotonil 50% 1,6±0,2 13,6±4,2

izo-valeril 66% 2,5±0,5 16,4±4,5

hexanoil 70% 1,5±0,4 20,1±4,2

mirisztoil n.a. 6,8±2,9 37,4±1,0

Manea, M. et al. (2011) Bioconjug Chem 22, 1320-1329 Hegedüs, R. et al. (2012) Eur J Med Chem 56,155-165
 Áramlási citometria
sejt aggregátumok
meds.queensu.ca lézer

3.

fluorescens
jelzett sejtek halott sejtek
2.

1.
egyedi sejt detektálás törmelék élő sejtek

Mérhető paraméterek:
1. FSC (forward scatter)  a sejtek mérete
2. SSC (side scatter)  a sejtek granuláltsága
3. Fluoreszcencia intenzitás:
a sejtben, vagy sejtfelszinen lévő fluoreszcens
jelzett peptid mennyiségével arányos

A sejtek mérés előtti tripszinezése a sejtfelszíni

receptorokhoz kötött, de a sejtbe be nem jutott
peptideket eltávolítja.
Így csak a sejtbe jutás vizsgálható.
A rövid zsírsavakkal módosított Dau-GnRH-III konjugátumok sejtbe jutása
<EHWK(X)HDWK(Dau=Aoa)PG-NH2 93.3
100 85.1 94.5

Dau+ élő sejtek (%)

87.7
80 67.8
41.3
60
MCF-7
40
27.2
22.3 20.1 14.9
20 4.8 7.2
0.1 0.05 2.0 0.3 0.3 0.1
0
4 koncentráció (μM) 20

96.9 98.5 90.1

100
Dau+ élő sejtek (%)

80

60
25.3 HT-29
39.1
40 27.5
15.8 19.3
20 12.9 5.4 1.9
5.3
0.1 0.1 0.05 0.1 0.05 0.3
0
4 koncentráció (μM) 20

X=Ac X=nBu X=Hex

X=Pr X=CA X=Myr
X=iBu X=iVA [D-Lys6(Dau=Aoa)]-GnRH-I
A GnRH-III(4Lys(Bu),8Lys(Dau=Aoa)) konjugátum sejtbejutásának
vizsgálata és gátlása
K2: Glp-His-Trp-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

Triptorelin: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (szuper agonista)

Konfokális mikroszkópos vizsgálat Sejtfelvétel gátlása

1 perc 5 perc 10 perc 30 perc áramlási citometria

K2 sejtfelvétele [%]
5 perc

K2 konjugátum lizoszóma festés kolokalizáció

+ DAPI sejtmagfestés
Schuster, S., et al, Beilstein J. Org. Chem. 14, 756-771 (2018)
 Az in vivo kezelések hatása a tumor operálhatóságára

Részben nem operálható tumor tumor Tökéletesen operálható tumortumor

Daunorubicin GnRH-III(4Lys(nBu), 8Lys(Dau=Aoa))

 Dau-GnRH-III konjugátumok antitumor hatása
ortotopikus (bélre vart) HT-29 vastagbél modellen
Tumorok tömege a terminálás napján (50. nap) Máj tömegek a terminálás napján (50. nap)

1,6
1,6
1,4
1,4
Primer tumor tömeg (g)

1,2
1,2

Máj tömegek (g)

1,0
P=0,0350 1,0
0,8
0,8
100 %
0,6
0,6 102,2 % 105,0 %
100 % 92,9 % 89,1 %
0,4
70,3 % 0,4
60,6 %
0,2 0,2
0,0 0,0
Kontroll Dau Lys(Ac) Lys(Bu) Kontroll Dau Lys(Ac) Lys(Bu)

Daunomicin: heti egy alkalommal (7x1 mg/ttkg)

Konjugátumok: heti két alkalommal (5x15 mg Dau-tartalom/ttkg, 8x 7,5 mg/ttkg)

Proliferációs index: konjugátumok (15%-kal csökken), Dau (nincs változás)

Vaszkularizáció: konjugátumok (30-40%-kal csökken), Dau (12%-kal nő)

Metasztázis gátlás: nincs Kapuvári, B., et al. Invest New Drugs 34, 416-423 (2016)
 A régi és az új vezérmolekula sejtbejutásának és
receptorkötődésének vizsgálata
MCF-7 emlő tumorsejteken
Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2

99.8
99.3

97.8
K2
100 P19-His

(%) %)

70.5
80

sejtek
uptake
jutás (Dau+
60

34.6
Sejbecellular
K2 40

20

4.5
5.0
0.35
0
2.50 10.00 40.00 160.00
cpeptides [µM]

I-triptorelin leszorítási kísérlet

125

konjugátum humán humán

hipofízis prosztata
tumorszövet

K2 3,59±2,17 3,43±2,01
P19-H P19-H 3,53±0,96 2,79±1,24

az értékek nM-ban kifejezve

Schuster S., et al. Pharmeteutics 10, 223 (Art No.) (2018)
 A konjugátumok hatása különböző tumor sejt típusokon
Tumor típus (sejtvonal) Dau K2 K/2 / Dau P19-H P19-H/ Dau K2 / P19-H
(IC50; nM) (IC50; μM) (IC50; μM)

Petefészek (A2780) 10,4 ± 1,5 1,4 ± 1,1 132,0 2,1 ± 0,5 197,2 0,67
Melanoma (egér B16) 25,9 ± 8,0 3,2 ± 0,9 123,4 1,0 ± 0,2 39,0 3,20
Tüdő (H1975) 20,9 ± 2,7 4,1 ± 0,1 196,0 2,3 ± 0,7 109,2 1,41
Fej-nyaki (PE/CA PJ41) 45,6 ± 33,6 4,7 ± 0,8 104,0 1,7 ± 0,5 36,7 2,77
Prosztata (DU145) 16,3 ± 4,6 5,3 ± 0,5 325,3 2,0 ± 0,2 125,9 2,65
Petefészek (OVCAR-8) 185,6 ± 99,8 5,6 ± 0,8 30,4 9,4 ± 0,8 50,9 0,60
Emlő (MDA-MB-231) 54,6 ± 7,4 5,8 ± 0,8 106,8 1,9 ± 0,2 34,2 3,05
Prosztata (PC-3) 117,5 ± 8,6 6,3 ± 0,3 193,6 2,3 ± 0,6 71,8 2,74
Emlő (egér 4T1) 56,0 ± 14,7 6,3 ± 0,9 112,3 1,8 ± 0,1 31,3 3,50
Máj (HepG2) 22.9 ± 1,4 6,8 ± 0,3 296,2 2,2 ± 0,7 96,6 3,09
Fej-nyaki (PE/CA PJ15) 50,5 ± 38,7 7,4 ± 0,8 145,7 2,8 ± 0,6 56,3 2,64
Melanoma (A2058) 35,0 ± 14,9 8,4 ± 0,3 239,3 2,6 ± 0,5 73,3 3,23
Glioma (U87MG) 126,4 ± 53,7 9,0 ± 0,8 71,4 2,3 ± 0,1 18,2 3,91
Tüdő (A549) 69,3 ± 23,5 9,6 ± 0,6 138,8 4,3 ± 0,4 61,6 2,23
Tüdő (H1650) 50,3 ± 13,4 10,5 ± 1,1 208,5 4,0 ± 0,8 78,6 2,63
Vastagbél (egér C26) 117,5 ± 8,6 10,6 ± 0,2 89,8 2,6 ± 0,7 22,3 4,08
Melanoma (WM983b) 49,8 ± 22,9 12,6 ± 1,5 254,0 2,5 ± 0,6 51,0 5,04
Melanoma (M1/9) 27,5 ± 9,1 13,5 ± 1,1 491,5 2,9 ± 0,6 105,6 4,66
Vastagbél (HT-29) 52,6 ± 3,6 15,5 ± 1,7 294,5 7,3 ± 0,3 138,8 2,12
Melanoma (M24) 118,8 ± 25,0 16,1 ± 0,1 135,9 3,4 ± 0,7 28,9 4,74
Emlő (MCF-7) 63,8 ± 21,0 16,5 ± 1,3 257,7 3,9 ± 0,8 61,5 4,23
Petefészek (OVCAR-3) 404,0 ± 9,4 46,0 ± 1,3 113,8 8,2 ± 0,5 20,2 5,61
Hasnyálmirigy (PANC-1) 525,9 ± 24,7 > 100 >200 56,4 ± 4,5 107,3 >2
Fibroblaszt (MRC-5) 287,6 ± 35,1 41,9 ± 3,8 145,7 19,7 ± 1,2 68,4 2,13
A Dau-GnRH-III származékok sejtbe jutásának időfüggése

Time-dependent cellular uptake of GnRH-III

conjugates ([4Lys(Bu), 8Lys(Dau=Aoa)]-GnRH-
III and [2ΔHis, 3D-Tic, 4Lys(Bu) 8Lys(Dau=Aoa)]-
GnRH-III on MCF-7 breast cancer cells (A). Co-
localization of [4Lys(Bu), Lys(Dau=Aoa)]-
8

GnRH-III (40 µM) with lysosomes (CytoPainter

Lysosomal Staining Kit) after 5 min incubation
(B). In the early stages of the cellular uptake
the Dau signal is co-localized with the
lysosomal staining (scale bars represent 10
µm).
Új hatékonyabb GnRH-III – daunomicin konjugátum tumor ellenes hatása
ortotopikus (bélre vart) HT-29 vastagbél modellen
K2 (1): Glp-His-Trp-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

P19-H (2): Glp-D-Tic-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH2

Daunomicin kezelés 3x1mg/ttkg (piros nyilak);

terminálás a tumor beültetést követő 23. napon

Konjugátumokkal való kezelés 7x10 mg Dau tartalom/ttkg (fekete nyilak);

terminálás a tumor beültetést követő 30. napon (a kontroll állatok súlyvesztése miatt)

Dau maximum tolerálható dózisban is toxikusabb, mint a 10-szeres hatóanyag mennyiséget

tartalmazó konjugátum, míg a tumor növekedést gátló hatásuk közel azonos.
Irányító molekula kiválasztása fág-bemutatásos eljárással és a
kiválasztott peptidszekvencia optimalizálása
Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása
fág-bemutatás technikával
Szekvencia
2-3 szelekciós lépés után
VHLGYAT
Fág könyvtár
kiválasztott peptid
Ismétlés
2-3-szor

Vastagbél Dau=Aoa-VHLGYAT-NH2
tumorsejt
Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2
Mosás E. coli-ban való
kifejeztetés
Kötődés Dau=Aoa-GFLG-VHLGYAT-NH2
Dau: daunomicin
Nem Kötődött Eluálás Aoa: aminooxiacetil
kötődött fágok
fágok
GFLG, LRRY:
Katepszin B enzim
által hasítható szekvenciák

1011 fág klón felhasználásával, 50 kiválasztott, amelyek

kevés és csak dipeptid szakasz homológiát mutattak
Zhang Y., et al. (2007) J. Biomol. Screen. 12, 429-435
Hatékonyabb konjugátum kiválasztása Ala-szken segítségével

V H L G Y A T
A H L G Y A T
V A L G Y A T
Dau=Aoa-LRRY- V H A G Y A T -NH2
V H L A Y A T
V H L G A A T
V H L G Y A A

Citosztázis (IC50 (mM))

Kód Konjugátum (24 órás kezelés
+ 48 óra)
KK06/2 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2 50,5 ± 5,5
KK11 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH2 60,9 ± 3,1
KK12 Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH2 > 100
KK13 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2 14,0 ± 1,5
KK14 Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH2 > 100
KK15 Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH2 26,8 ± 0,4
KK16 Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH2 > 100
Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel
és fluoreszcens mikroszkóppal
HT-29 20 mM HT-29 20 mM
3 óra kezelés 3 óra kezelés
7000 100 100 mM
100 mM
6000
80
fluoreszcencia int. 5000

Dau+ sejtek [%]

4000 60

3000 40
2000
20
1000
0 0
G T/A Y/A G/A L/A H/A V/A G
KK06/2 T/A
KK11 Y/A KK13
KK12 G/A KK14
L/A H/A
KK15 V/A
KK16

Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2

c=20 M; 30 perc c=20 M; 30 perc

Hatékonyabb konjugátum kiválasztása Ala-szken majd
pozíciós szkennelés segítségével
V H L G Y A T 50,5 ± 5,5 IC50 értékek
A H L G Y A T >100 24 + 48 óra
kezelés
V A L G Y A T 26,8 ± 0,4 MTT teszt
V H A G Y A T >100
Dau=Aoa-LRRY- V H L A Y A T -NH2 14,0 ± 1,5
V H L G A A T >100
V H L G Y A A 60,9 ± 3,1

V H L A Y A T 27,9  6,4
V H L K Y A T 50,3  3,0
V H L E Y A T 29,5  6,2
V H L L Y A T 7,5  3,5
Dau=Aoa-LRRY- V H L F Y A T -NH2 6,6  2,9
V H L S Y A T 24,8  7,4
V H L T Y A T 21,7  6,5
V H L N Y A T 28,0  19,4
V H L P Y A T >50
 In vitro sejtbejutási vizsgálatok áramlási citométerrel

9000

Fluoreszcencia int.
8000
7000
Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH2 6000
Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2 5000
4000
Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH2
3000
Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH2 2000
1000
0
6.25 12.5 25 50 100

100 c / M
90
80
Dau+ sejtek [%]

70
60
50
40
30
20
10
0
6.25 12.5 25 50 100
c / M
Tumour type (cell lines) Dau Conjugate 3 Conj. 3 / Dau Conjugate 13 Conj. 13 / Dau Conj. 3/ Conj. 13
(IC50; μM) (IC50; μM) (IC50; μM)

Melanoma (mice B16) 0.0089 ± 0.0053 15.2 ± 3.0 1711.3 3.0 ± 0.5 335.4 5.07
Prostate (DU145) 0.0245 ± 0.0053 6.1 ± 2.2 249.7 3.5 ± 0.5 142.3 1.74
Lung (H6509) 0.0475 ± 0.0016 4.4 ± 1.2 92.6 2.9 ± 0.6 60.1 1.52
Lung (H1975) 0.0133 ± 0.0047 19.3 ± 0.1 1458.7 3.7 ± 0.8 279.9 5.22
Melanoma (A2058) 0.0332 ± 0.0004 10.5 ± 5.8 316.8 3.5 ± 1.3 104.5 3.00
3 konjugátum:
Head & neck (PE/CA PJ41) 0.0258 ± 0.0054 9.4 ± 3.5 363.9 4.3 ± 0.1 165.7 2.19
(parent)
Head & neck (PE/CA PJ15) 0.0264 ± 0.0050 20.2 ± 4.6 759.3 7.4 ± 3.4 277.3 2.73
Liver (HepG2) 0.0213 ± 0.0009 22.4± 4.4 1052.6 4.7 ± 0.5 220.2 4.77 13 konjugátum:
Melanoma (M24) 0.0936 ± 0.0258 15.4 ± 3.7 164.3 5.8 ± 0.9 61.7 2.66
(G/F cserélt)
Breast (MDA-MB-231) 0.0529 ± 0.0103 6.3 ± 2.5 118.8 4.6 ± 0.8 86.6 1.37
Melanoma (WM983b) 0.0442 ± 0.0192 7.1 ± 2.5 159.8 5.1 ± 0.4 114.6 1.39
Glioma (U87MG) 0.0279 ± 0.0035 14.2 ± 3.5 510.3 6.6 ± 0.2 236.9 2.15
Lung (A549) 0.0681 ± 0.0227 25.9 ± 2.3 380.1 5.9 ± 1.5 86.1 4.39
Colon (HT116) 0.1271 ± 0.0219 33.6 ± 4.4 264.1 7.2 ± 0.3 57.0 4.67
Prostate (PC-3)) 0.0260 ± 0.0071 20.5 ± 0.3 787.5 5.9 ± 1.6 226.7 3.48
Colon (mice C26) 0.1260 ± 0.0468 15.8 ± 2.5 125.7 8.3 ± 1.0 66.0 1.90
Colon (HT-29) 0.2029 ± 0.0010 30.1 ± 0.3 148.3 11.6 ± 0.1 57.1 2.60
Colonl (WIDR) 0.2401 ± 0.0363 34.1 ± 3.2 141.8 15.1 ± 2.9 62.8 2.26
Ovarian (OVCAR-3) 0.4729 ± 0.0636 13.8 ± 0.5 29.3 11.3 ± 2.6 24.0 1.22
Breast (MCF-7) 0.2860 ± 0.0247 22.2 ± 9.2 77.6 11.1 ± 3.8 38.8 2.00
Breast (mice 4T1) 0.0408 ± 0.0068 34.2 ± 0.4 837.4 11.6 ± 3.6 284.6 2.95
Colon (HT-25) 0.1564 ± 0.0721 33.2 ± 3.5 212.4 15.4 ± 2.8 98.5 2.16
Pancrease (PANC-1) 0.4667 ± 0.0366 31.7 ± 4.5 68.0 26.9 ± 8.1 57.7 1.18
Fibroblast (MRC-5) 0.2547 ± 0.0006 39.3 ± 24.6 154.2 52.1 ± 1.7 204.6 0.75
 In vivo tumornövekedés gátlás és májtoxicitás vizsgálata
SCID egerek i.p. kezelése (kezdés 10 nappal az ortotopikus tumor beültetés után:
Dau kezelés 1 mg/kg hetente 1-szer; konjugátummal kezelés 10 mg/kg első hét 3-szor,
második hét 2-szer.

0,3

1,0
96,5 %
Tumor tömege / g

85,4 %
0,2

Máj tömege / g
68,5 %

38,7 % 0,5
0,1
17,8 %
11,9 %

0,0 0,0
Kontrol Dau (1) (3) Kontrol Dau (1) (3)
N=7 N=7 N=6 N=8 N=7 N=7 N=6 N=8

1) 3: Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH2
3) 13: Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH2

N: kísérleti állatok száma

 Affinitás kromatográfia receptor meghatározáshoz
Ligandum: H-LRRYVHLFYAT-NH2 (spec-1), H-LRRYVHLGYAT-NH2 (spec-2)

A gyantához kötött peptidet több fehérje is felismeri, de a legjobb

affinitással egy Heat shock protein 70 (Hsp70) kötődik, amely egy,
a tumorsejtek felszínén megjelenő fehérje, tehát jó irányító molekula.
Hsp70 fehérjét felismerő további peptidek (irodalmi adatok):
VHLTPVEK (Hsb; Hemoglobin B lánc); ASHLGLAR (A6R)

Fourie AM, et al. J Biol Chem 269: 3470-3478 (1994)

 Vér-agy gáton átjutni képes Angiopep-2 - daunomicin
konjugátumok antitumor hatásának fokozása a szerkezet
módosításával
 Rákos megbetegedések száma és halálozási arányok az USA-ban (2022)

Esetszám: 14280 / 10530 Mortalitás: (81,4% / 75,7%)

új esetek (0-85+ év kor) mortalitás (0-85+ év kor) DE!!! mortalitás (39 év alatt)

5,6-4,2/100000 fő
10. legnagyobb

Új esetek mintegy 3 %-a

Siegel R. Et al. CA: Canc. J Clin. 2023, 73, 17-48.

https://gco.iarc.fr/overtime/en/dataviz/bars?sexes=1_2&cancers=23&types=1&mode=cancer&key=crude_rate&age_end=5&years=2012&populations=84000
 Transzport a vér-agy gáton keresztül
A vér-agy gát (BBB) a perifériás keringést és az agyi extracelluláris folyadékot elszeparáló
szemipermeábilis rendszer:
Célzott terápiára alkalmas konjugátumok

Shatzmiller S., Lapidot I., Zats G., SM J. Neurol. Disord. Stroke; 2016; 2, 1012.
 Agytumorok

~ 80% központi idegrendszeri glia sejtekből: glioblastoma

agyiáttétek más szervből kiinduló primer tumorokból

magas letalitás – medián halálozási idő 14 hónap

Kezelési nehézségek:
• nem tökéletes a rosszindulatú
daganatok, műtéti eltávolítás;
• hipoxiás környezet nem kedvez
a sugár- és kemoterápiának;
• kemoterápiás szerek többsége
nem jut át a vér-agy gáton;
• kemoterápia toxikus mellékhatásai
https://www.brainsforthecure.org/patient-navigator/understanding-diagnosis/prognosis/.
SKX / Science Photo Library
 Angiopep-2

19 aminosavból álló peptid:

H–TFFYGGSRGKRNNFKTEEY–OH
Konjugátum LRP1
az LRP1 (alacsony sűrűségű lipoprotein
receptor-kapcsolt fehérje 1) ligandja;
LRP1
BBB-n receptor mediált transzcitózissal, míg
a tumorsejtbe receptor mediált endocitózissal
jut be;

három konjugációs hely a peptidben:

A vér-agy gát Agyi tumorsejt
N-terminális, 10Lys és 15Lys oldalláncok. endotélsejtjei

Demeule M. et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2008; 324, 1064–1072.

 Alkalmazott konjugátumok

3 hatóanyag észter-kötéssel Konjugálás:

Drog-CO-(CH2)n-CO-OSu

U87 MG
Glioblasztóma
(IC50)
ANG1005 (Klinikai fázis) ANG1007 ANG1009
n = 2 (Succ) n = 2 (Succ) n = 3 (Glut)
ANG1005: 5,1 nM
paclitaxel doxorubicin dimetilglicin etopozid
PTX: 6,4 nM

ANG1007: 6 nM ANG1009: 330 nM

Hasonló in vivo gátlás (s.c.):
PTX 20 mg/kg (i.p.) 5 napig
ANG1005 40 mg/kg 5 napig,
majd 3 naponta 2x 50 mg/kg.
Dox: 18 nM DMGE: 145 nM
Túlélés: kezeletlen kontrol átlag 16 nap
Régina A., et al, Br. J. Pharmacol. 2008, 155, 185-197
ANG1005 kezelt (3 naponta 50 mg/kg) átlag 19 nap Ché, C. et al., J. Med. Chem., 2010; 53, 2814-2824.
A konjugátumok tumorellenes hatását befolyásoló tényezők
 Célkitűzés
• Vizsgálni, hogy a különböző konjugálási helyek szubsztitúciója miként befolyásolja az
Angiopep-2 konjugátumok tumorellenes hatását.

• Egy, két illetve három hatóanyag (daunomicin) molekulát tartalmazó konjugátumok

szintézise és vizsgálata.

• Nem hasítható oxim-kötés alkalmazása miatt lizoszómális degradációs vizsgálatok.

• Szerkezet – hatás összefüggések megállapítása.

Daunorubicin (Daunomicin) Doxorubicin (Adriamicin)
Kemoszelektive ligáció:
oxim- vagy hidrazon-kötés észter-kötés

O OH O H O OH
O OH

OH OH
amid-kötés

CH3O O OH O NH2 CH3O O OH O NH2

O O
OH OH
CH3 CH3
 Tervezett Dau − Angiopep-2 konjugátumok
1 hatóanyag:

2 hatóanyag:

3 hatóanyag:

Dau konjugálás:
kemoszelektív ligáció, oxim-kötés
 A Dau − Angiopep-2 konjugátumok szintézise
Cél: legkevesebb lépéssel előállítani valamennyi konjugátumot
H2N–TFFYGGSRGKRNNFKTEEY–COOH
Szintézis: Wang-gyanta (SPPS)
Fmoc/tBu stratégia

Fmoc hasítás (2% DBU-2% piperidin DMF)

Aoa: aminooxiacetil-
(bevitel: Boc-Aoa-OH
+ PyBOP + K-Oxyma + DIEA

Mtt: 4-metiltritil-
(hasítás: 1% TFA/DCM)
Dde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociklohex-1-
ilidén)etil- (hasítás: 2% hidrazin/DMF)
nem hasítható szelektíven Fmoc mellett)

0,2 M NH4OAc puffer

(pH = 5,0), 20°C, 16 óra
 In vitro citosztázis és sejtfelvétel vizsgálat
1 óra inkubálás U87-MG sejteken 24 óra kezelés + 48 óra inkubálás
100
30,2 ± 6,4 µM
2

80 10,9 ± 2,8 µM
3

4 24,0 ± 5,9 µM
Dau+ sejt / %

60

5 32,3 ± 8,1 µM
40
6 21,6 ± 5,4 µM

20 7 7,8 ± 6,3 µM

8
0 23,6 ± 6,3 µM
10 50
c / µM 10
Lys(Dau=Aoa) segíti
15
Lys(Dau=Aoa) gátolja a sejtbejutást;
Konjugáció: N-terminális: 10
Lys: 15
Lys: pozíció fontosabb, mint a hatóanyag száma.
 A konjugátumok lizoszómális lebomlása

Kód Szerkezet Legkisebb metabolit (Dau=Aoa-Thr-OH (3)

vagy H-Lys(Dau=Aoa)-OH (2,4)
1 óra 6 óra 72 óra

2 megjelenik főtermék csak ez

3 megjelenik főtermék csak ez

4 nincs megjelenik nem főtermék

H-GK(Dau=Aoa)R-OH
és
A lassú degradáció és a legkisebb, aktív metabolit megjelenésének hiánya H-GK(Dau=Aoa)-OH
lehet az oka a 4-es konjugátum kisebb tumorellenes hatásnak.
Felszabadulás hatékonyságának fokozása?
 Új konjugátumok Katepszin B labilis spacer beépítésével
Citosztázis: Sejtbejutás:

Konjugátum Kód IC50 (μM)

1 óra inkubálás U87 sejteken
(4) 24,0 ± 5,9

(9) 16,9 ± 5,6 100

80

Dau+ sejt / %
60 4
7
(10) >50 40 9
20 10
11
(11) 20,2 ± 3,0 0
10 50
c / µM

A sejtbejutást a GFLG spacer segíti,

(7) 7,8 ± 6,3
míg a VA és a VAGG spacerek rontják.
 Az enzim-labilis spacert tartalmazó daunomicin-Angiopep-2 konjugátumok
lizoszomális degradációja során azonosított hasítási pontok
9 10
9 11

Lassú degradáció; az Ala és a Lys oldallánc Dau=Aoa-Val-Ala-OH

a Dau=Aoa-Gly-Phe-OH
6 óra után detektálható;
Még 24 óra elteltével is a
H-GK(Dau=Aoa-GFLG)R-OH
a fő metabolit;
a Dau=Aoa-Gly-OH csak
nagyon lassan képződik;
Ez lehet az oka, hogy a jó sejtbe-
jutás ellenére csak kis mértékben
javult a hatás.
között nincs hasadás; 1 óra után detektálható;
72 óra után a fő metabolit Dau=Aoa-Val-OH
H-GK(Dau=Aoa-VA)R-OH; 6 óra után detektálható;
Dau=Aoa-Val-OH és az alacsony citosztatikus hatás
H-Lys(Dau=Aoa-Val-Ala)-OH a gyenge sejtbejutással
elhanyagolható mértékben; magyarázható elsősorban.
rossz sejtbejutás és
lassú metabolizáció,
gyenge hatás.
 A 10Lys oldalláncának módosítása a Dau-Angiopep-2 konjugátum
tumorellenes hatásának növelése érdekében
Dau=Aoa–TFFYGGSRGKRNNFKTEEY–COOH (LPO196)

Dau=Aoa–TFFYGGSRGK(Bu)RNNFKTEEY–COOH (DL79)

Sejtfelvételi vizsgálatok: Sejtvonal: U87 glioblasztoma

Dau-Angiopep-2 vs. Dau-Angiopep-2(Bu)
1.5 óra kezelés

Internalization of Angiopep conjugates DL79

LPO196
Internalization of Angiopep conjugates DL79
LPO196 In vitro citosztatikus hatás:
1500
(IC50: µM)
100

Fluorescence intensity (PE channel) LPO 196: 1.42

Dau-positive live cells (%)

75
1000

50
DL79: 0.68
500

25 24 óra kezelés +
48 óra további
0 0 Inkubálás
25 5 5 10 20
2,
MTT-teszt
25 5 5 10 20
1, 1, 2,

Concentration (M) Concentration (M)