Reactii serologice complexe

 RIA (Radio immunoassay)

 EIA (Enzyme immunoassay)
 Chemiluminiscenta
Proceduri automate
 Nefelometria

 Citometria de flux
RIA
 Tehnica cantitativa (radioactivitatea se masoara),
specifica (confirmare) ;
 Utilizeaza marcajul cu izotopi radioactivi

 RIA se face COMPETITIV pentru determinarea Ag

 RIA se face NECOMPETITIV pentru determinarea Ac
RIA COMPETITIV

 Se foloseste pentru determinarea Ag

 Identifica si masoara Ag

 Ag de determinat se pune in contact cu Ag

cunoscut si marcat radioactiv si cu Ac
corespondent impotriva Ag
RIA COMPETITIV

 Se formeaza doua tipuri de complexe imune:

1. Intre Ag de determinat si Ac

2. Intre Ag radioactiv si Ac
RIA COMPETITIV

 Intre cele doua antigene (Ag de determinat si Ag marcat

radioactiv) exista competitie pentru legarea Ac
 Radioactivitatea amestecului este invers proportionala cu
cantitatea Ag determinat
RIA COMPETITIV

 Se masoara radioactivitatea amestecului:

 Daca Ag de determinat nu exista, atunci radioactivitatea

amestecului va fi de 100%

 Pe masura ce creste cantitatea Ag de determinat, scade

cantitatea de Ag marcat radioactiv pana la 50%
RIA NECOMPETITIV

 Identifica Ac prin metoda Sandwich

 Ac de determinat se pune in contact cu Ag corespondent
 Se lasa sa se incubeze
 Se spala
 Se adauga ser antigamaglobulina umana marcat
radioactiv
RIA NECOMPETITIV

 Daca exista, Ac s-a fixat pe Ag

 Serul antigamaglobulina umana se va fixa apoi pe Ac
 Cu cat e mai mare radioactivitatea, cu atat creste cantitatea
de Ac fixat pe Ag corespondent
 Radioactivitatea este direct proportionala cu cantitatea
de Ac fixat
Exemplu- Determinarea Ac IgE specifici pt acarieni

 In serul pacientului vrem sa determinam daca are IgE specifici pt

acarieni
 Pe lama avem acarieni, peste punem serul pacientului
 Se lasa sa se incubeze
 Daca serul contine IgE specifici pentru acarieni, se leaga de acarienii de
pe lama
 Se spala
 Se adauga ser antigamaglobulina umana marcat radioactiv
 Se spala
 Daca radioactivitatea e de 0% inseamna ca nu exista Ac IgE specifici
pentru acarieni
RIA- dezavantaje majore

 necesita protectie speciala (utilizare de

substante radioactive)
 reactivii folositi sunt foarte instabili, au T ½
foarte scurt
RIA- dezavantaje majore

 Radioactivitatea inseamna instabilitate chimica

 Cand conjugam o substanta chimic instabila,
legatura covalenta nu dureaza mereu
 Tehnicile RIA au fost inlocuite cu tehnicile EIA
EIA
Tehnici cantitative, specifice (ex ELISA)
Se efectueaza identic cu tehnicile RIA, doar
ca marcajul se face cu o substanta
enzimatica
Necesita o etapa suplimentara in care se
adauga substratul enzimei
EIA
 Se obtine o reactie de culoare
 Citirease face la spectrofotometru pentru
observarea intensitatii culorii

 Se efectueaza competitiv pentru Ag (culoarea

scade direct proportional cu Ag) si necompetitiv
pentru Ac (culoarea creste direct proportional cu
Ac)
EIA
EIA- dezavantaje

 Tehnici foarte laborioase

 Necesita incubari si spalari successive
 Dureaza cel putin 72h

Tind sa fie inlocuite de tehnicile de

chemiluminiscenta
Chemiluminiscenta

 Tehnici cantitative, specifice

 Marcajul se face cu luciferina (substanta obtinuta
de la licurici)
 Emisia de lumina se face cu luminometrul
 Se efectueaza competitiv pentru Ag si necompetitiv
pentru Ac
Chemiluminiscenta
Chemiluminiscenta

Spre deosebire de RIA, nu necesita protectii

speciale si nici etapa suplimentara pentru
subtratul enzimei, spre deosebire de EIA, deci
e mai putin laborioasa
Proceduri automate- citirea reactiei e
facuta de un computer

1. Nefelometria

2. Citometria de flux
Nefelometria

Este o reactie de precipitare:

se poate face doar daca Ag si Ac

sunt solubile
Nefelometria
Determinarea Ag
 In eprubeta avem o cantitate cunoscuta de Ag
 Se adauga Ag de determinat
 La intalnirea Ag-Ac apare un precipitat mai dens
sau mai putin dens in functie de cantitatea de Ag
Nefelometria

 Catre eprubeta se trimite o raza laser care va fi deviata

sub un anume unghi, in functie de cantitatea de
precipitat formata
 Cu cat e mai mult precipitat format, cu atat va fi
deviata mai mult raza
 Unghiul de deviere e citit de un computer, care se
raporteaza la o scala si reda cantitatea de Ag
Citometrie de flux (flowcitometrie)

 Esteo metoda care numara si separa celule pe

baza a doua proprietati:
1. Pe baza diferentei de dimensiuni si granularitate
2. Pe baza determinantilor antigenici de suprafata
sau din citoplasma
Primul criteriu de separare

 Pe baza diferentei de dimensiuni si granularitate

o Celulele sunt puse sa curga printr-un tub foarte ingust,
astfel incat se insira una cate una
o Catre tubul de curgere este trimisa o raza laser care va fi
deviata sub un anumit unghi in functie de dimensiunile si
granularitatea celulei
Primul de criteriu de separare
Primul criteriu de separare
 Daca e o celula mica, raza va fi deviata mai putin

 Daca e o celula mai densa, cu mai multe granule, raza laser e deviata mai
mult

 Unghiul de deviere e citit de un computer, care numara cate celule cu

acelasi unghi de deviere au fost

Pe acest principiu se determina hemograma

Al doilea criteriu de separare

 Determinantii antigenici de pe suprafata celulei sau din

citoplasma

 Inainte sa treaca prin tubul de flowcitometrie, celulele sunt

puse la incubat cu Ac monoclonali impotriva
determinantilor antigenici marcati fluorescent
Al doilea criteriu de separare

 Pelanga raza laser, se mai trimite o a doua raza

UV
 Sortarease face pe baza fluorescentei, plus
unghiul de deviere
 Se pot folosi pana la 128 de fluorocromi o data
 Este o procedura de numarare si sortare
Al doilea criteriu de separare

 Computerul, dupa ce recunoaste celula, da o

sarcina electrica celulei de interes pe care dorim sa
o separam, iar pe restul le lasa neincarcate
 Lacapatul tubului de curgere, avem electrozi, iar
celula se duce catre electrodul corespondent