KLONLANAN GENLERN YABANCI

KONAKTA ANLATIMI (REKOMBNANT PROTEN RETM)

(1) Klonlanan genin ilevsel analizinin yaplabilmesinde n koul

genin iine sokulduu yapabilmesi

(2) Klonlanan salanmas genin uygun

konakta

baarl

anlatm

bir

konakta

anlatmnn

genin protein rnnn saf ve bol miktarda elde

edilebilmesi

(Modern biyoteknolojinin hzl biimde ilerlemesi !!!)

Rekombinant protein elde edilmesi ok kolay deildir.

Bu amaca ynelik klonlama almalarnda tasarmlar gelitirilmesi gerekli !!!

yeni

Engelleyici faktrler:
Gelimi yapl organizmalarn genlerinin bakterilerde genellikle normal anlatm yapamamalar ( transkripsiyon, translasyon ve translasyon sonras

ilemlerde, proteinlerin gidilerindeki farkllk)

hcrede gerekli blmelere

Ekspresyon (Anlatm) Vektrleri

Farkl gruplara ait organizmalarda gen anlatmnn eitli aamalarndaki tanma sorunlarn ortadan kaldrmak ve

genin yabanc bir konakta baarl anlatm yapmasn salamak zere gelitirilmi olan vektr.

Ekspresyon (anlatm) vektr tad genin girdii blgede konak hcre tarafndan tannabilecek gen anlatm sinyalleri ierir.

Ekspresyon vektrnn en nemli bileeni: promotr.

Basit tipteki ekspresyon vektrleri sadece transkripsiyon sinyalleri (rnein, promotr) tarlar. Transkripsiyon tipleri: etkinliinin dzenlenmesinde promotr

Kuvvetli promotrler, transkripsiyon etkinlii yksek,

transkripsiyonun hzl yaplmasn salarlar. hcrede fazla miktarda retilmesi gereken proteinlere ait genler iin uygun.

Zayf promotrler, transkripsiyon etkinlikleri daha az.

hcrede rnlerine az miktarda gereksinim duyulan genler iin uygun.

Vektrdeki Promotrn levinin Dzenlenmesi Srekli anlatma olanak veren (konstittif) vektrler levi dzenlenebilen vektrler

ndksiyon (Tetikleme) veya Represyon (Basklama)

Tetikleyici ya da basklayc maddelerin ortama eklenmesiyle klonlanan genin anlatmnn dzenlenmesi.
Rekombinant ayarlanabilmesi proteinin retim miktarnn

(1) Rekombinant protein konakta zararl etki yapyorsa sentezinin hcrede toksik dzeyde birikimini engelleyecek ekilde kontrol edilmesi (2) Zararl etkisi olmasa da uzun sreli anlatm sonucu replikasyonu etkilenen plazmidin kltrden yok olmasnn engellenmesi

E.

sklkla kullanlan ekspresyon vektrleri lac. ifreleyen promotr. -galaktosidaz lacZ geninin

colide

trp. Triptofan sentezi gen kmesinin promotr. tac. trp/lac promotrleri melezi, kuvvetli promotr. PL promotr. DNAsndaki promotrlerden biri, ok kuvvetli. T7 promotr. T7 faj RNA polimerazna zg, kuvvetli.

Bileik (fusion) Protein

Vektrde konak hcreye uygun promotrle birlikte promotrn ait olduu genin balangcndaki belli uzunlukta bir dizinin de bulunmas klonlanan genin proteiniyle birlikte promotre ait

genin rnnn (N-ucundaki amino asitleri tayan) bir ksmnn meydana gelmesi. Translasyon iin doru oluturulmas nemli !!! okunma erevesinin

stenilen proteini elde etmek zere ounlukla bileik protein daha sonra in vitro kesilir.

Kaset Vektrler
Gen anlatmyla ilikili tm sinyalleri bir kaset biiminde tayan vektrler. [promotr + ribozoma balanma dizisi + terminatr] Klonlanacak gen kasetteki sinyal kmesinin ortasnda bulunan tek restriksiyon enzimi kesme yerine sokulur. Biyoteknolojik kullanmlarda anlatmlarda nemli. gerekli olan ok etkin

Bir yabanc genin E. colide anlatm yapmasn salamada kaset tipi ekspresyon (anlatm) vektrnn kullanm

Bileik protein sentez eden kaset vektrler

Kaset vektrde klonlama yeri ile ribozoma balanma dizisi arasnda konak hcreye ait bir genin bir parasnn bulunmas.
Yabanc genin, konaa ait gen parasndan sonra gelen restriksiyon yerine sokulmasyla, okunmann vektrdeki genin ilk kodonundan balayp yabanc gende devam ederek bir melez gen oluturulmas. Gen anlatmnn rn: yabanc protein + NH2 ucuna kaynam ksa bir peptit bileik (fusion) protein.

Bu tip kaset vektrler rekombinant protein retiminde nemli !!!!

Bileik protein sisteminin avantajlar:

Okunma erevesinin translasyon. bandaki dizi yardmyla etkin

Balangtaki peptidin yabanc proteinin konak hcredeki ykmn engellemesi. Ek parann sinyal peptit oluturup proteinin hcrede uygun blmeye gitmesini salamas. Proteinin hcre dna salglanabilmesi (salglanma, rekombinant proteinlerin

kltrden saflatrlmasn kolaylatrd iin istenilen bir zellik !!! )

Ek parann proteinin saflatrlmasna yardm. afinite kromatografisi

ile

Bileik protein sistemine ilikin sorunlar:

Vektrdeki ek gen parasna ait amino asit dizisinin klonlanm genin ifreledii proteinin zelliklerini deitirebilmesi ve aktivitesinin tamamen yok olmasna yol aabilmesi. Sorunun giderilmesi: Bileik proteinin, iki bileeninin zel kimyasal/enzim uygulamasyla ayrlmas. (rn. metioninlerde kesen siyanojen bromid, argininde kesen trombin kullanm)

E. colide Rekombinant Protein retimindeki Sorunlar

Yabanc genin dizisinden kaynaklanan sorunlar.
(1) Gende intronlarn kullanlmas). varl ( genin cDNAsnn

(2) Genin okunma erevesi ierisinde transkripsiyonun erken tamamlanmasna neden olacak dizilerin bulunmas ( in vitro mutagenezle tamamlanma iaretinin deitirilmesi). (3) Gendeki kodon seiminin bakterideki translasyon iin uygun olmamas ( in vitro mutagenezle tercih edilen kodonlarn oluturulmas).

 Konaktan (E. coli) kaynaklanan sorunlar (1) Rekombinant proteinin doru ekilde ilenememesi (zellikle glikozillenmenin olmamas) ( en nemli kstlayc sorun !!!). (2) Rekombinant proteinin doeu ekilde katlanamamas (zellikle slfit balarnn oluamamas) inclusion cisimleri oluumu ( fazla miktarda aperon proteinleri sentezleyen E. coli kullanm). (3) Rekombinant proteinin ykm ( proteazlar kusurlu E. coli mutantlar kullanm).

Yabanc proteinlerin salglanmas. Biyoteknolojik uygulamalar iin nemli !!!!

Sitoplazmik deitirilmesi. bir proteinin salglanacak biimde

Ekspresyon vektr tasarmnda salg proteinlerinin tmndeki ortak baz zelliklerin dikkate alnmas gerekir : N-ularnda polar amino asit dizisi; bu dizide pozitif ykl bir amino asidin 10-15 hidrofobik amino asitlik bir ekirdek tarafndan izlenmesi. C- ucundaki baz zel diziler. Ayrca, proteinin baz yapsal zellikleri.

Rekombinant Proteinlerin Konak Hcrelerdeki Kararll Klonlanm genlerin yabanc konaktaki rnleri olduka kararsz.
Rekombinant proteinlerin hcre ii yerleimleri kararllk zerinde etkilidir (rnein, fare proinsulininin E. colideki yar mr sitoplazmadayken ~2 dakika, periplazmada sre 10 kat uzuyor.)

Kararszl stratejiler:

giderme

amacyla

gelitirilen

baz

Bileik protein oluturulmas ve daha sonra ek proteinin (rn. siyanojen bromidle) kesilmesi. Yntemin dezavantaj doal bir proteinin her zaman meydana gelmemesi. Konak hcre olarak, hcre ii proteazlar indirgenmi olan baz mutantlarn kullanlmas vb.

karyotik Hcrelerden Rekombinant Protein retimi

Bakterilerde (rn.E. colide) klonlanm yabanc genlerden fazla miktarda rekombinant protein elde edilmesine ilikin eitli sorunlarn varl. karyotlar iin uygun vektrlerin gelitirilmesi lk almalar, mayalar gibi basit karyotlara ynelik.

lk ve en yaygn ekilde kullanlan S. cerevisiae.

Rekombinant protein rn olduka yksek miktarda. Tpta ve besin olarak kullanlan proteinlerin retimi iin gvenilir organizma. Genetik ve biyokimyasal zellikleri ok iyi biliniyor.
Ancak, Hayvansal proteinlerin glikozillenmesi (hipergikozillenme) Etkin bir protein salglama sistemi yok. kusurlu

Pichia pastoris
Rekombinant protein rn ok yksek (toplam hcre proteininin %30u).
Glikozilleme zellii hayvan hcrelerine ok benzer.

Rekombinant proteinlerin bazen saflatrlamadan ykm.

Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Kluveromyces lactis Aspergillus nidulans

Trichoderma resei
Glikozilleme zellii iyi. Salglama yetenekleri var.

Basit yapl karyotlara ait ekspresyon vektrlerinde sklkla kullanlan baz promotrler
Saccharomyces cerevisiae
GAL. Galaktoz epimeraz geninin promotr. PHO5. dzenlenir. Fosfat dzeyiyle

CUP1. Bakrla tetiklenir.

Pichia pastoris
AOX. Alkol oksidaz promotr.

Aspergillus nidulans
Glukoamilaz promtr

Trichoderma resei
Sellobioz promotr.

Gelimi karyotlarda (bitki ve hayvanlar) uygun ekspresyon

vektrlerinin tasarmnda, son yllarda, hcre kltrlerindeki hzl gelimeler etkili.

Gelimi karyotlarda gen klonlamas yaplan genin rnnn zelliklerini deitirmeye (rnein artrmaya) ynelik abalar baskn. Ekspresyon vektrlerinde bulunan promotrler klonlanacak genin kendi promotrnden genelde daha kuvvetli.

Hayvan Hcrelerinin Kullanlmas

Rekombinant

Protein

retiminde

Karmak ve glikozillenmi yapl hayvansal proteinlerin aktif ekilde sentez edilebilmeleri iin en uygun konak hayvan hcreleri. Devaml oalan byk lekte hcre kltrleri gerekli oalma hz ve maksimum hcre younluu ok yksek deil rekombinant protein rnn snrl. Klonlanm genin ve ekspresyon vektrnn kullanm (genin normal promotrnden ok daha kuvvetli olan promotrn kullanm) rn miktarnn artrlmas. En uygun promotrler SV40, cytomegalovirus (CMV), Rous sarcoma virus (RS) vb.den.

Rekombinant protein retiminde en pahal yol yol !!!

(Virus bulamasna kar kontrollu saflatrma gerekli)

Bcek Hcrelerinde Rekombinant Protein retimi Hayvansal protein retiminde alternatif konak.

Ekspresyon sistemleri:
Baculovirus genomundaki polihedrin geninin yerine klonlanacak genin geirilmesi rekombinant protein rn >%50 total protein. Ancak, glikozillenme kusurlu.

Autographa

multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) memeli hcrelerine de bular fakat genomu replikasyon geirmez; ancak klonlanm genin anlatm iin yeterli sre kararl kalr; ayrca glikozillenme baarl.

californica

Transgenik Hayvanlarda Rekombinant Protein retimi Dllenmi yumurtaya mikroinjeksiyon yoluyla klonlanacak genin sokulmas Farelerde baarl. Dier memelilerde nukleus aktarm daha etkin: Genin mikroinjeksiyonla somatik hcreye sokulmas; Hcrenin nukleusunun, nukleusu yok edilmi, bir oosite aktarlmas; Ooositin sokulduu ana organizmada transgenik hayvan eklinde gelimesi. Uzun ve pahal bir yntem. Ancak, rekombinant gende ve rnnde dller boyunca sreklilik.

Transgenik Bitkilerde Rekombinant Protein retimi Bitkiler rekombinant protein retimi iin byk olanaklar salar: Bitki ve hayvanlarda translasyon sonras deiimler ok benzer birok hayvan proteininin bitkilerde retimi baarl. Bitki hcre kltrlerinin kurulmas teknolojisi iyi gelimi. Bitkilerin tarlalarda bol miktarda retimi mmkn. Rekombinant teknoloji. proteinlerin retiminde ucuz ve dk

rnein, bir genin tohumun balca proteinlerinden birine ait gene zg promotrden sonra vektre sokulmasyla, zel olarak tohumda anlatm yapmas bol miktarda proteinin kolaylkla eldesi ve saflatrlmas.