You are on page 1of 32

NAZLI A.

ERC YES 200620102007 IIÖ



Moleküler mark rlar genom üzerindeki herhangi bir bölgeyi i aretleyip belirlemede kullan lan yöntemlerdir.
MOLEKÜLER MARKIRLARIN MORFOLOJ K MARKIRLARDAN FARKI  

    

ve ara t r c lar ndan kaynaklanabilecek hatalar n azl . 2) YÜKSEK ORANDA POL MORF K: Bir genomda bulunan toplam baz say s kadar polimorfiklik saptanabilir. 3) ÇOKLUK: Çok say da moleküler mark r olmas na kar n morfolojik mark r say s azd r. 4) KO-DOM NANTLIK: Bir lotusta mümkün olabilecek genotip belirlenebilir. 5) GEN X GEN NTERAKS YONU: Epistatik ve pleotropik de ildir. 6) HIZLILIK VE EKONOMiKLiK 7) ÜNiVERSALLIK

1) KAL TAT F VE KANT TAT F BA IMSIZLIK: Çevre, geli me dönemi

Moleküler 

aretleyiciler

RESTRiKSiYON ENZiM VE HiBRiDiZASYON TABANLI  Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP)  Minisatellit (Minisatellite)  Nokta Hibridizasyonu (Dot Blot)

Ço alt lm Polimorfik DNA Dizileri (Cleavage Amplified Polymorphic Sequence.POLiMERAZ ZiNCiR REAKSiYONU VE RESTRiKSiYON ENZiM TABANLI Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Restriction Fragment Length PolymorphismPCR. RFLP-PCR)  Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism. CAPS)  Terminal Restriksiyon Uzunluk Polimorfizmi (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)  Ço alt lm Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)  . PCR-RFLP) veya Bölünerek.

AP-PCR) Rastlant sal Ço alt lm DNA Polimorfizmi (Random Amplified Polimorphism DNA (RAPD) Ço alt lan DNA Parmakizi (DNA Amplification Fingerprinting. DAF) Mikrosatellitler veya Basit Tekrarl Diziler Polimorfizmi (Microsatelites (Simple Sequence RepeatsPolymorphism. SSRP) .POL MERAZ Z NC R REAKS YONU TABANLI     Primere Tabi Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimorfizmi (Arbitrary Primed PCR.

     Ço alt lan Sekans Polimorfizmi (Sequence Related Amplified Polymorphism. SCAR) Basit Sekans Tekrarlar Aras Polimorfizmi (Inter simple sequence repeats. ASAPs) Ligaz Zincir Reaksiyonu (LCR) . DALP) Allele Ba l Özgün Primerler (Allele-specific Associated Primers. ISSR) Do rudan Ço alt lan Uzunluk Polimorfizmi (Direct Amplification of Length Polymorphism. SRAP Belirli Dizileri Ço alt lan Bölgeler (Sequence Characterised Amplified Region.

DNA D Z VE ENZ M TABANLI Klevaz K s m Uzunluk Polimorfizmi (Cleavase Fragment length polymorphism. SSCP) Do rudan Dizi Analizi (Direct Sequencing) Genler Aras Bölgeler (Internal Transcribed Spacers. CFLP)  Kimyasal Mismaç Kesimi (Chemical cleavage of mismatches (CCM))  DNA D Z TABANLI       Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism. HA) Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi (Single stranded conformational polymorphism. RAMPO) . ITS) Rastlant sal Ço alt lm Mikrosatellit Polimorfizmi (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphisms. SNP) Heterodupleks Analizi (Heteroduplex analysis.

restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'n n sadece spesifik baz dizilerini tan makta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir. viral epidemileri belirlemede kullan lmaktad r.  RFLP analizi viral su lardaki mutasyonlar saptamada.RFLP analizi Restriction parça uzunlu u polimorfizmi Restriksiyon endonükleaz enzimlerinin kullan ld bu yöntemde. Restriksiyon endonükleazlar.  .

ve bunlar bir RE ile kesilirler.  Polimorfik bölge olup olmad na bak l r (EtBr ile i aretlendikten sonra.RFLP n n a amalar Biyolojik materyalden genomik DNA izole edilir. gözle ay rt edilemiyorsa veya do rulamak için Southern Blot tan sonra) sonra)  .  Kesilmi DNA lar elektroforeze tabi tutulurlar.

Dü ük maliyeti. AmpFLP analizi yüksek oranda otomatikle tirilebilir. De i ken say l biti ik tekrar (VNTR) polimorfizmlerine dayal (VNTR) aleller ay rdedilir. haz rlanma ve çal t rma kolayl gibi nedenlerden dolay AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yayg n olarak kullan l r . Bu yöntemle ki isel DNA örnekleri kar la t r larak filogenetik a açlar yarat labilir. çok yüksek say l tekrarlar jelin tepesinde s k abilirler ve birbirlerinden ay rdedilmeleri zor olabilir. Analiz jelde yap ld için.Ço alt lm  AFLP parça uzunlu u polimorfizmi   Bu teknik RFLP'den daha h zl çal r ve DNA örneklerini ço altmak için PCR kullan r. . Bantlar gümü boyamas ile görülür. bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayr t r l r.

Bir çe it "in vitro "in klonlama" olarak da tan mlanan . (65°  Elongasyon(uzama). zincirin uzamas ve çift iplikçikli DNA n n sentezi (72°C) a amalar n n belirli say da tekrar na (72° dayan r.  .DNA alan.PCR Polimeraz Zincirleme Tepkimesi . Bu üç ad m bir PCR döngüsünü olu turur. DNA n n iki zincirinin yüksek s ile birbirinden ayr lmas (95°C) (95°  Annealing (yap ma).DNA içerisinde yer . PCR Reaksiyonu  Denatürasyon.dizisi bilinen iki segment aras ndaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak ço altmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.  Metod basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun kosullarda ço alt lmas esas na dayan r. sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya ba lanmas (65°C).

son derece polimorfik bölgelere bak l r (en yayg n olarak tekrar eden 4 bazl bölgelere bak l r ama 3. bu DNA bölgeleri birbirlerine akraba olmayan ki ilerin ay rdedilmesinde kullan labilir.  Akraba olmayan ki ilerde bu tekrar eden birimlerden farkl say larda oldu u için.STR analizi K sa biti ik tekrarlar Günümüzde kullan lan DNA profillemesi PCR ve k sa biti ik tekrarlara ( ng. Bu amaç için kullan lan iki elektroforez yöntemi vard r. 5 ve ba ka say da baz tekrarlar da kullan l r). Elde edilen DNA parçalar sonra elektroforez ile ayr t r l r ve tespit edilir. kapiler elektroforez ve jel elektroforezi  . Bu yöntemde k sa tekrar eden DNA dizilerine sahip. short tandem repeats veya STR) dayal d r. Bu STR lokuslar (konumlar ) dizi-spesifik primerler dizikullan larak PCR ile ço alt l r.

PCR s ras nda kullan lan primerlere ba lanm flüresan etiketler sayesinde kapiler tüpte ayr t r lan DNA parçalar n hangi tepkimenin ürünü oldu u anla labilir. ilerler. içi bir polimerlerle dolu elektroforezde. . Bu sayede birden çok DNA parças n n PCR ile ço alt lmas ve beraber elektroforez edilmesi mümkün olur. buna multipleksleme denir. küçük parçalar büyük olanlardan daha h zl olmak üzere. ince cam tübün (kapiler veya k lcal tübün) içine DNA parçalar bir elektrik alan n n etkisiyle (elektrokinetik olarak) enjekte edilir.   Kapiler elektroforezde. Sonra. gene bir elektrik alan n n etkisiyle DNA parçalar bu tüp içinde.

  Farkl büyüklükte ve i aretlenmi DNA standartlar n n her bir örne e dahil edilmesi ile parçalar n büyüklükleri belirlenir. Bu yöntem pahal olmakla beraber yüksek kapasiteli makinalar kullan larak örnek ba na daha dü ük bir masrafa ula mak ve ço u adli laboratuvardaki i yükünü azaltmak mümkündür. bu büyüklük bilinen tüm alelleri listeleyen bir tablo ile kar la t r larak polimorfik tekrar say s bulunur. Jel elktroforezi kapiler elektroforeze (KE) benzer bir prensibe göre çal r ama DNA parçalar n ayr t rmak için kapiler tüp yerine iki cam tabaka aras nda olu turulmu bir poliakrilamit jel kullan l r  .

ucu AATT 3.bazlar yla bitirilir.de i ik bazlardan olu ur ve CCGG bazlar yla uzat l r.  Di er primer ise yine benzer eklide olup 3.-) (5.  . Ko-dominantl k ve tekrarlanabilme özeli i.. Komorfolojik karakterlerle ili kilerinin fazlal g avantajlar aras nda yer al rken özel primer iste i ise bir dezavantajd r  SRAP iki özel primer kullan r (bir brimer çifti) bu primerlerin 13 ile 15 nt uzunlugundaki sol taraf (5.SRAP SEKANS L SK L ÇO ALTILAN POL MORF ZM 17 ile 20 nt aras nda kullan lan özel primerlerle genomda kodlama yapan DNA parçalar n çogaltamaya dayal bir metottur.

ucuna eklenen 3.nükleotidleri gösterir Çok say da lokus ayn anda izlenebilmektedir. ISSR primerine örnek: 5.ISSR BASIT SEKANS TEKRARLAR ARASI POLIMORFIZIM       Bu teknikte genellikle tek bir primer kullan l r. 5.-ACACACACACACACACCTCBurada CCTC ard k tekrar n 3.. .-ACACACACACACACACCTC-3. Primer uzunlu u 16-20 nt olup duruma göre 16primerin uçlar ndan biri 2-4 baz uzat l r. Primerin 2bu uzant lar içerisindeki k sm nda tekrarl bazlar bulunur.

 Örnegin ikili tekrar ATATATATATATATATATAT eklindedir.SSR BASIT SEKANS TEKRARLARI POLIMORFIZIM Basit tekrarli DNA dizileri genelde bir ile 6 nükleotit uzunlugunda bazlarin ardisik olarak bulunmasi olayidir.  Herhangi bir DNA'nin basit tekrarli olarak isimlendirilebilmesi için önce belirli bir motifin yukaridaki örnekte motif AT'dir ve bu motifin belirli bir sayida bulunmasi gerekir.  Genelde ikili bir motifte motif sayisinin en az 8 olmasi bu sekansa basit tekrarli sekan olarak adlandirilmasini saglar  . Burada ard k olarak tekrar eden bazlar AT' dir ve bu örnekte AT 10 kez tekrarlanmaktad r.

Nedeni ise polimorfizm orani oldukça fazla olmasi yaninda tekrarlanabilirligi (farkli kisilerin farkli labaratuarlarda yapimis oldugu deneylerden ayni sonuç almalari) oldukça fazla olan bir yöntemdir. Ancak bu markir sisteminin uygulanabilmesi için çalisilan organizmaya ait primerlerin yani SSR primerlerinin önceden bilimesi gerekmektedir . Bir PCR metodu olmasi kolay uygulanabimesini saglar.    Bu teknik günümüzde oldukça fazla kullanilan bir tekniktir.

 .  Bunlar: (1) genomik DNA kütüphanelerinin SSR oligonükleotidleri ile hibridizasyonu yoluyla gözlenmesi  (2) DNA veri bankalar nda SSR´ler n ara t r lmas  (3) akraba bitki türlerinde geli tirilmi olan SSR-spesifik primerlerin kullan m d r.SSR primerlerinin üretiminde genel olarak üç farkl yakla m tercih edilmektedir.

Mikrosatellitlerin en büyük dezavantaj yeni markör geli tirilmesinin güçlü üdür.  .  Yeni markörlerin geli tirilmesi için genomik DNA klonlar n n tekrarlanan oligonükleotid içeren problarla melezlenme yoluyla bulunmas . nükleotid dizili lerinin belirlenmesi ve yanyana tekrarlanan yap lar n ba lang ç ve biti yerlerinden özel ba lat c DNA lar geli tirilmesi gerekmektedir.  Bu da oldukça fazla i gücü gerektiren pahal bir i lemdir.

SCAR D Z LER BEL R ÇO ALTILAN BÖLGELER Bu mark r sistemi genellikle RAPD veya AFLP metotlar yla ço alt lm tek bir amplikonun primer uzunlu unu yakla k ikiye katlayarak yeniden ço alt lmas na dayan r.  K saca tek fragmentini temsil eden lokus önce jel üzerinden al n r.  . orijinal primerle tekrar ço alt l r ve ço alt lan DNA parças n n sekans yap l r.  Yeni primerler eski primer sekanslar n ve ek olarak yeni DNA dizileri içerir.

 Dezavantaj : DNA sekanslamas na ihtiyaç duyar. Yüksek kalite ve miktarda DNA.  Avantajlar : PCR metodu oldugundan. kotekrarlanma özelligi art r lmaktad r.Bu metodla RAPD veya AFLP teknikleri dominant özellikten ko-dominant özellige.  .ya ihtiyaç yoktur. Tekrarlanabilme kapasitesi oldukça yüksektir. SCAR primerlere genelde 18-24 oligo 18uzunlugundad r.

SSCP Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi   Ayn büyüklükteki DNA parçalar n ay rmakta kullan lan bir metottur. Bu tekni in temelini jel üzerinde elektroforez olan bir DNA n n hareketi DNA n n büyüklü ü ve bu DNA y olu turan sekanslar n içeri ine ve bu içerikten dolay DNA parçac n n kendi üzerine ba lanma veya de i ik ekiller almas na dayan r. Bu metotta tek sarmall DNA n n non-denatürasyon poliakrilamid jel nonelektroforezindeki hareketi izlenir. .

zotop.larda uygun sonuçlar verebilmektedir.  Bu teknik uygun büyüklükteki PCR amplikonlar na uygulan r ve PJE yöntemiyle ayr t r l r.  .Bu teknik 100 ile 400 nükleotid uzunlu undaki DNA. EB veya gümü nitrat yöntemiyle görüntülenebilir.

.RAPD Raslant sal Ço alt lm  DNA Farkl l Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunlu undaki primer (ba lat c ) tek sarlmall DNA lar kullan larak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekle tirilir.  Yayg n olarak di er PCR uygulamalar n n aksine iki de il tek bir primer kullan l r.  Reaksiyon artlar n n spesifik olmamas rastgele ço alt ma izin verir.

 Dolay s yla kullan lan ba lat c n n DNA üzerinde birbirine yak n iki bölgeye yap abildi i genom bölgelerinin amplifikasyonu yap l r.  Üretimi yap lan DNA parçalar (amplikon) agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutuldu unda baz parçalar n baz genotiplerde üretilip baz lar nda üretilmedi i gözlenir  .Ancak bu ba lat c her iki yöndeki DNA üretimi için de kullan l r.

Tekrarlanabilirligi zay f 2. Basit ve h zl 3. Dominant mark r 3. Polimorfizim oran di er baz mark rlardan az . Az genomik DNA 7.den daha fazla polimorfik 2. Primer ba na fazla mark r üretebilir 8. Üniversal primerler kullan r RAPD Dezavantajlar 1. Radyoizotoplar kullanmaz 5. Mutasyona bagl amlifikasyon 6.RAPD Avantajlar 1. Mark rlar çevre arlar ndan ve geli me dönemlerinden etkilenmez 4. RFLP.

 Her lokusta çok say da alel olmas VNTR lar n ay r m gücünü art rmakta.  .VNTR(Minisatellitler) VNTR larde tekrar eden dizi 9 80 bç aras nda olabilmektedir. ancak alel boyutlar büyük oldu undan çok iyi korunamam örneklerde amplifikasyon sorunlar ya anabilmektedir. Bundan dolay kullan m alan s n rl kalm t r.

5orta evet kolay orta yüksek orta orta SSRs 0.Tah l ürününün en yayg n kullan lan marker sistemleri ile Kar la t rmas          Özellik RFLPs DNA(mikrogram ) 10 DNA KAL TES yüksek PCR TABANLI yok KULLANIM KOLAYLI I kolay de il OTOMASYON dü ük TEKRARLANAB L RL K yüksek GEL T RME MAL YET dü ük ANAL Z BA INA MAL YET yüksek RAPDs 0.05 orta evet kolay yüksek yüksek yüksek dü ük ISSR 0.1 0.02 yüksek evet kolay orta güvenilmez dü ük dü ük AFLPs 0.5-0.05 yüksek evet kolay yüksek yüksek yüksek dü ük .

T. ve G. C. Dideoksinükleotit Yöntemi  Günümüzde Sanger metodunun prensipleri kullan larak sekanslama i lemleri gerçekle tirilmektedir.lerinin belirlenmesidir. .DNA SEKANSLAMA  DNA parças n n veya herhangi bir genomun tüm nükleik asit dizisinin yani A.  Maxam & Gilbert. Kimyasal sekanslama  Sanger.

ddATP. ddCTP. ddGTP)  Teknik birbirlerine komplimentar olan tek sarmall  DNA lar n uygun ortamlarda birbirleriyle baz çifti prensibine göre ba lanmalar prensibine dayan r.  . dTTP dGTP.Sanger Yöntemi çin: 1) Kal p DNA kopyalar (DNA Sekans Belirlenecek olan) 2) Uygun bir primer kopyalar 3) DNA polimeraz 4) Normal deoksinükleotitler (dATP. dCTP) 5) Dideoksinükleotitler ( zotop veya Floresan eteiketli ddTTP.

org/wiki/DNA_profillemesi http://www.pdf http://web.vtunnel.tr/~iozerol/rdurmaz/UygMolMikr/149.org/Bio1Behnan.org/wiki/Polimeraz_zincir_tepkimesi http://www.wikipedia.pdf http://www.pdf http://tr.php/1010110A/bb8cfd09a195d37da6 046b345ba286ff1e154a5b9e249d7e0247b8b76edd23041ab94bd42f3 323e757969782556ecfeb69f4f41d3ee8e4e015650 .akdeniz.pdf http://www.edu.inonu.fao.abgeder.com/index.        http://www1.wikipedia.org/biotech/docs/Korzun.abgeder.edu.pdf http://tr.tr/ziraat/tr/dersler/genetikmuh_07.org/Bio1Gonul.