Ｎｏｖ．２００７

２３（６）６２１～６２５

神经解剖学杂志
（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ

Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ）

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究①
李鹏飞王春芳８
（山西医科大学 医学实验中心分子生物学实验室，太原０３０００１）

摘要为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞（ＥＳＣＳＣｓ）的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况，本文从孕龄１３ ｄ的胚胎大 鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞，采用含表皮生长因子（ＥＧＦ）及碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的无血清限定性培养基培 养，并通过添加维甲酸（ＲＡ）、音猬因子（ＳＨＨ）和神经营养因子＿３（ＮＴ一３）等诱导因子，进行干细胞体外诱导，用免疫荧光细胞化 学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明：从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞，通过含ＥＧＦ和ｂＦＧＦ的限 定性培养基培养可获得干细胞球，通过添加ＲＡ、ＳＨＨ和ＮＴ－３等诱导因子后，可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示，胚胎 大鼠脊髓神经干细胞在添加ＥＧＦ与ｂＦＧＦ的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ＥＳＣＳＣｓ性状，在添加特殊因子的条件 下，并在体外ＥＳＣＳＣｓ可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。

关键词

神经干细胞分化音猬因子胆碱能神经元脊髓大鼠

ＴＨＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮＤ ＳＰＥＣＩＦＩＣ

Ｄ腰ＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩｏＮ矾Ｔｏ
ＳＴＥＭ

ＣＨｏＬＩＮＥＲＧｌＣ ＮＥＵＲｏＮＳ

ｏＦ ＥＭ［ＢＲＹｏＮＩＣ ＳＰＩＮＡＬ ＣｏＲＤ

ＣＥＬＬＳ ｏＦ ＲＡＴ

ＪⅣＷＺＲＤ

Ｌｉ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ

Ｐｅｎｇｆｅｉ，Ｗａｎｇ Ｃｈｕｎｆａｎｇ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ

Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｈａｎｘｉ ＭｅＳｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ

０３０００１）

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｔｏ

ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ
ｒａｔｓ

ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ（ＥＳＣＳＣｓ），ｔｈｅ ｎｅｕｒａｌ
ｃｏｎｔａｉｎｓ

ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ

ｆｒｏｍ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｏｆ １３ ｄ ｆｅｔａｌ

ｗｅｒｅ

ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ

ｉｎ

ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ ｌｉｍｉｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｉｃｈ

ｉｎｔｏ

ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ

ｉｍｍｕｎｏ－

（ＥＧＦ）ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ），ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ

ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｏｔｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｄｕｃｅｄ ｓｔｕｄｙ
ｃａｎ ｔｏ

ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ

ｎｅｕｒｏｎｓ

ｗａｓ

ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｓｔｅｍ

ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ

ｔｏ

ｒｅｔｉｎｏｉｃ

ａｃｉｄ（ＲＡ），ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ），ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ

ｉｎ

ｃｅｌｌｓ

ｃａｎ

ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ，ａｎｄ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｆｏｒｍｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ

ｌｉｍｉｔｅｄ
ｉｎ—

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ＥＧＦ ａｎｄ
ｉｎｔｏ

ｂＦＧＦ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｅｄ

ｉｎ

ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｅｔｏｒｓ ｓｕｃｈ

ａｓ

ＲＡ，ＳＨＨ，ＮＴ一３，ｔｈｅ

ｓｔｅｍ

ｃｅｉｌｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｉｎ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ
ｉｎｃｒｅａｓｅ

ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ

ｍａｉｎｔａｉｎ ｉｎｔｏ

ｓｕｇｇｅｓｔ

ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＧＦ

ｉｎ ｖｉｔｒｏ

ａｎｄ ｂＦＧＦ ｕｓｅｄ

ｍｏｓｔ

ｔｈｅ

ｐｒｅｓｅｎｔ

ｃａｎ

ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ

ｔｏ

ｔｈｅ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ ＥＳＣＳＣｓ

ｎｅｕｒｏｎｓ

ｆｏｒ

ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｅｒｉｏｄ，ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒ．

ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ，ＥＳＣＳＣｓ

ｂｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ

ｅｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ

ｉｎ ｖｉｔｒｏ

ａｆｔｅｒ

ｅｘｐｏｓｕｒｅ

ｉｎ

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ

ｎｅｕｒａｌ

ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｅ ｎｅｕｒｏｎｓ，ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ，ｒａｔ

目前对有神经分化潜能的细胞的研究主要集中 于以下三类细胞：来源于胚胎或成体神经组织的神 经前体细胞‘１Ｉ，非神经源性的前体细胞川和胚胎干 细胞‘３｜。神经干细胞是一群具有自我更新、自我增

殖和多向分化潜能的细胞，它的发现为人们深入研 究中枢神经系统的发育、分化以及探索治疗神经系 统疾病的新途径开辟了新的思路。在体外自然分化 的条件下神经干细胞具有多向分化潜能，可分化为

①国家自然科学基金（３０６７２１１４）、山西省自然科学基金（２００５１０９５）、山西省高校科技开发项目（２００３４０）、山西医科大学校长基金 （２００２０６１７）资助项目 ￥通讯作者电话：０３５１４１３５７２４ Ｅ—ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｃｈｕｎｆａｎｇｌ＠１６３．ｓｏｎ

万 　 方数据

６２２

神经解剖学杂志

第２３卷

第６期

２００７年１１月

神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。然而，神经

视细胞生长情况每隔３～５ ｄ换液一次。待两周后 神经干细胞球形成后进行以下操作。 长期培养 将其中的一批神经干细胞做长期 培养，如果一瓶内细胞数量过多则通过传代，即将形

干细胞如何分化为特定的神经元却还知之甚少。 目前，神经干细胞的研究已成为生命科学领域
的热点，建立一个可以无限增殖并保持稳定性状的 神经干细胞系可望用以替代体内损伤的神经元，来 修复神经系统疾病的损伤部位。但目前对神经干细 胞的研究多集中在中脑和皮层的神经干细胞上，对

成的干细胞球通过用滴管机械吹打法使其分散为单
细胞，分瓶培养。６个月后取出部分神经于细胞，通

过检测其ｎｅｓｔｉｎ表达和体外自然分化特性来观察神 经干细胞在此限定性培养基中长期培养时的性状稳
定性。长期培养的细胞自然分化的培养基为 ＤＭＥＭ／Ｆ１２和１０％的胎牛血清。 细胞分化 将２４
ｍｍ×２４

脊髓神经干细胞的研究为数不多。大鼠胚胎脊髓神
经干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ，ＥＳＣＳＣｓ）

是在脊髓的室管膜区分离出的神经干细胞，它具有 一般神经干细胞的特性，又具有脊髓的同源性特征。
因此，用其来移植治疗脊髓损伤是一种颇有前景的

ｍｉｌｌ盖玻片高温高
ｍｇ／

压消毒后放人６孔培养板孑Ｌ中，将浓度为０．１

治疗手段，但现阶段对脊髓来源的神经干细胞的研 究相对较少，尤其是在诱导其定向分化方面。
胆碱能神经元是神经系统中能分泌乙酰胆碱的 神经元的通称，运动神经元是胆碱能神经元的一种，

ｍｌ的多聚赖氨酸涂布于盖玻片上，３７℃恒温箱中孵 育２ ｈ，用Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ液冲洗２次后，在其上滴加上面 所得的神经干细胞悬液，３７０（２、５％ＣＯ，条件下静置

４

ｈ，待细胞贴壁后分组加入含有诱导因子的培养基
ｍｔ／孑Ｌ。每隔３ ｄ换液一次，倒置显微镜下观察 ｂＦＧＦ，在此

一些实验室已经证实在运动神经元的分化过程中需
要维甲酸（ＲＡ）和音猬因子（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ）

２．５

神经干细胞分化形态并记录。诱导培养基的基本成
分为ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％Ｂ２７和２０
ｎｇ／ｍｌ

的参与Ｈ，５。，且在体内运动神经元的发育过程中
ＳＨＨ起着重要的作用Ｈ Ｊ。因此，我们对这些因子能

基础上分别添加下列四种不同的诱导因子或其组
合：ＲＡ（５ ｔｘｍｏｌ／Ｌ），ＳＨＨ（２０ ｎｇ／ｍ１），ＳＨＨ（２０ ｎｇ／ｍ１）＋ＲＡ（５ ｌｘｍｏｌ／Ｌ），ＳＨＨ（２０ ｎｇ／ｍ１）＋ＮＴ一３ （２０ ｎｇ／ｍ１）。对照组仅为诱导培养基的基本成分。

否在体外诱导脊髓神经干细胞分化为胆碱能神经元 进行了初步的研究。
材料和方法

３．

细胞免疫荧光染色

待分化的细胞贴壁４ ｈ后，吸去培养孔中的培
１．

试剂

养液，加入含４％多聚甲醛的０．０１

ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ

ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｅｏ），Ｂ２７（Ｓｉｇｍａ），表皮生长因 子（ＥＧＦ，Ｒ＆Ｄ），碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ， Ｒ＆Ｄ），ＲＡ（Ｓｉｇｍａ），ＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ），ＮＴ一３（Ｒ＆Ｄ），胎 牛血清（四季青）；兔抗大鼠神经上皮干细胞蛋白

７．２）ｌ ｍｌ，室温下固定１５ ｍｉｎ。吸去多聚甲醛，用

０．０１ ｍｏＬ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）清洗３次，每孔加入２００
ｍｏｌ／Ｌ

ｍ１含１０％山羊血清的０．０２

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２），

室温下轻轻振摇３０ ｍｉｎ。吸去上述封闭液，加入１

（ｎｅｓｔｉｎ）抗体、兔抗大鼠胆碱乙酰转移酶（ＣｈＡＴ）抗 体、兔抗大鼠神经胶质酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体、兔抗 大鼠微管相关蛋白＿２（ＭＡＰ２）抗体均购自博士德公 司；ＦＩＴＣ标记的羊抗兔二抗和Ｃｙ３标记的羊抗兔二

抗购自华美公司，Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２购自Ｓｉｇｍａ。
２．

：２００稀释的兔抗大鼠ｎｅｓｔｉｎ抗体２００ ｍｌ后放人４℃ 冰箱过夜。次日晨吸去一抗，用０．０２

ｍｏＶＬ ＰＢＳ

（ｐＨ ７．２）清洗３次后，加入１：５０稀释的Ｃｙ３标记

的山羊抗兔二抗，避光、室温下轻轻振摇２ ｈ，用０．
０２ ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）清洗３次后，封片剂封片，

细胞培养

在激发光波长为５６８ ｎｍ、发射光波长为６１０ ｎｍ的 荧光显微镜下观察ｎｅｓｔｉｎ阳性神经球的情况。

孕１３ ｄ的ＳＤ大鼠颈椎脱臼致死，酒精浸泡消

毒后移人无菌操作箱，取出胎鼠，去头，用显微器械 取出脊髓组织，于解剖显微镜下剥去脊髓外膜，在预 冷的Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ液中用吸管缓慢吹打数次，使其分离 成单细胞，将细胞悬液移至离心管中，１５００ ｒ／ｍｉｎ离

心５ ｍｉｎ弃去上清液，用限定性培养液（内含
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％Ｂ２７、２０ ｎｇ／ｍｌ

待细胞诱导分化两周后，吸去培养孔中的培养
液，加入含４％多聚甲醛的０．０１
ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ

７．

２）１ ｍ１，室温下固定１５ ｍｉｎ。吸去多聚甲醛，用０．０ｌ

ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）清洗３次，每孔加入２００ ｍｌ含

ｍｏＶＬ

１０％山羊血清的０．０２

ＰＢＳ（ｐｔｆ ７．２），室温下

ＥＧＦ和２０

ｎｇ／ｍｌ ｂＦ—

轻轻振摇３０ ｍｉｎ。吸去上述封闭液，加入１：２００稀 释的兔抗大鼠ＣｈＡＴ抗体２００ ｍｌ后放人４。Ｃ冰箱过

ＧＦ）重悬细胞沉淀，３７。Ｃ、５％ＣＯ，条件下悬浮培养，

万 　 方数据

李鹏飞等：胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

６２３

夜。次目晨吸去一抗，用０．０２

ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）

随机挑选１５个视野进行计数和合计。结果以ＣｈＡＴ
阳性细胞数与由Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２标记的细胞核数（代

清洗３次后，加入ｌ：５０稀释的ＦＩＴＣ标记的山羊抗 兔三抗，避光、室温下轻轻振摇２ ｈ，用０．０２

Ｈｏｅｃｈｓｔ ｍｏｌ／Ｌ

表总细胞数）的比率表示。统计分析用ＳＰＳＳ软件
进行。

ＰＢＳ（ｐＨ ７．２）清洗３次后，加入浓度为５ ｍｇ／ｍｌ的 ３３３４２，避光，室温下轻摇３０ ｍｉｎ，对所有细

ｍｏｌ／Ｌ

胞的细胞核进行标记，之后用Ｏ．０２

ＰＢＳ（ｐＨ

７．２）清洗３次，封片剂封片，在激发光波长为４９５ ｎｍ、发射光波长为５２０ Ｄｉｎ的荧光显微镜下观察 ＣｈＡＴ阳性神经元的情况，在激发光波长为３４６

ｅｃｈｓｔ
Ｂｉｎ、

１．

脊髓神经干细胞的增殖

原代培养的神经干细胞呈圆形，悬浮生长，在限 定性培养基中培养一周后，其他的非神经干细胞逐 渐死亡，一些神经干细胞聚集形成悬浮的细胞团块。

培养１４ ｄ后，出现由单个神经干细胞增殖而成的神

发射光波长为４６０ ｎｍ的荧光显微镜下观察被Ｈｏ— ３３３４２标记的细胞核的情况，并计数。 此外，长期培养的细胞在体外自然分化两周后， 分为两组，分别用兔抗大鼠的ＭＡＰ２一抗（１：２００）， Ｃｙ３标记的羊抗兔二抗（１：５０），和兔抗大鼠的 ＧＦＡＰ一抗（１：２００），ＦＩＴＣ标记的羊抗兔二抗（１： ５０）来检测神经干细胞的分化。操作过程同上。

４．

经于细胞球（Ｆｉｇ．１Ａ），免疫荧光染色显示神经球中 的细胞为ｎｅｓｔｉｎ阳性（Ｆｉｇ．１Ｂ）。在限定性培养基中 此神经干细胞可不断增殖，传代１２次（每１４ ｄ传代 一次），免疫荧光检测显示在自然分化前ｎｅｓｔｉｎ表达 为阳性，自然分化两周后，ＭＡＰ２阳性和ＧＦＡＰ阳性

的细胞均有生成。

细胞计数的评估与统计学处理

为了计数表达特定抗原细胞的数目，每个样本

Ｆｉｇ．１ Ａ： Ｂ： Ｃ：
Ｄ： Ｅ：

ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅＨ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｔｙｐｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ Ａ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ａｄｈｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ４ ｈ ｓｈｏｗｅｄ ｉｍｍｕｎｏｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ＣｈＡＴ ＣｈＡＴ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｇｅｎ锄ｔｅｄ

ｍ４她ｕｎｌ咖ｔａｉ丑ｉｎｇ
ｎｅｓｔｉｎ．

ＥＧＦ ａｎｄ ｂＦＧＦ ｆｏｒ １４ ｄａｙｓ．

Ｂａｒ＝２５斗ｍ

Ｂａｒ＝５０ ＩＩｍ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｉＩｎｊＩａｒ ｔｏ曲ａｌ ｃｅｌｌ．Ｂａｒ＝５０ Ｉ衄

ｎｅｕｒｏｎｓ ｎｅｕｒｏｎｓ

ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ

ｉｎ

ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ

ｏｆ ＳＨＨ ａｎｄ ＲＡ．Ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ ｏｆ ＳＨＨ ａｎｄ ＮＴ一３．Ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ

ｗｅｒｅ

ｔｈｅ

ｗｅｒｅ

ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．Ｂａｒ＝５０ Ｂａｒ＝２５ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２．

ｌａ．ｍ Ｉ．Ｌｍ

万 　 方数据

神经解剖学杂志

第２３卷

第６期

２００７年１１月

２．

脊髓神经干细胞的分化

兀分化。

当神经干细胞球置于铺有多聚赖氨酸的盖玻片 上时，神经球很快贴壁。随后细胞逐渐从球中迁移
出，形成一个花团状的单细胞簇。球状的细胞开始

神经干细胞和早期的神经系统前体细胞在体外
的增殖需要促有丝分裂素如ＥＧＦ和ｂＦＧＦｌ９—１２１。我

们自胚胎脊髓分离得到干细胞，在含有ＤＭＥＭ／
Ｆ１２、Ｂ２７（２％ｖ／ｖ）、ｂＦＧＦ（２０ ｎｇ／ｍ１）和ＥＧＦ（２０

生出突起，１４ ｄ后这些细胞形成网状结构（Ｆｉｇ．
１

Ｃ）。

ｎｇ／ｍ１）的限定性培养基中培养后，因为培养液中的 免疫荧光染色显示，在ＳＨＨ和ＲＡ的共同诱导 ＥＧＦ和ｂＦＧＦ仅对神经干细胞有促进分裂和增殖作

用，故而神经干细胞球大量形成，而其它细胞因为无

下，许多细胞表现为ＣｈＡＴ阳性（约占总细胞数的 ２ｌ％），这些细胞多分布在花团状细胞簇的周围

法生长而死亡。通过长期培养我们发现脊髓神经干
细胞的特性可在此培养基中保持不变长达半年以

（Ｆｉｇ．１Ｄ，Ｆｉｇ．２）；在ＳＨＨ和ＮＴ．３的共同诱导下可
以观测到与此相似的结果（ＣｈＡＴ阳性的细胞数约 占总细胞数的２０％；Ｆｉｇ．１Ｅ，Ｆｉｇ．２）；但是在ＲＡ或

上。所以本实验中所用的限定性培养基可以促进脊 髓神经干细胞在体外的增殖，并可在体外长期维持 其稳定的性状，所获得的脊髓神经干细胞可以为神 经干细胞的研究提供一个稳定的来源。 有研究表明，体内运动神经元分化是由脊索分 泌的ＳＨＨ所调控的¨３｜，并且ＳＨＨ在运动神经元的 分化中是必需的０１４］。Ａｖｅｒｂｕｃｈ—Ｈｅｌｌｅｒ等¨纠则证实 ＮＴ－３可以促进鸟类运动神经元的分化，而Ｖｉｃａｒｉｏ— Ａｂｅｊｏｎ等¨刮却发现ＮＴ一３可以诱导大鼠的海马源性 干细胞分化为谷氨酸能神经元。胆碱能神经元的特
征是表达胆碱乙酰转移酶（ＣｈＡＴ），所以我们用

ＳＨＨ的单一诱导作用下，仅能观察到少量ＣｈＡＴ阳
性的细胞（Ｆｉｇ．２）；对照组中未发现ＣｈＡＴ阳性的细

胞（Ｆｉｇ．２）。通过酽分析显示，ＳＨＨ和ＲＡ共诱导 组与ＳＨＨ和ＮＴ．３共诱导组的ＣｈＡＴ阳性细胞数无 显著差异，而二者分别与ＳＨＨ诱导组和ＲＡ诱导组

之间有显著性差异。

２５．００％ ２０．００％ １５．００％ １０，００％ ５．００％ ０．００％ ＳＨＨ＋ＲＡ ＳＨＨ＋ＮＴ一３ ＳＨＨ ＲＡ Ｃｏｎｔｒｏ

ＣｈＡＴ抗体来检测胆碱能神经元。体外分化１４

时，在对照组中未发现ＣｈＡＴ阳性细胞，用ＲＡ或

ＳＨＨ诱导后只出现少数ＣｈＡＴ阳性细胞，而在ＳＨＨ 与ＲＡ或ＳＨＨ与ＮＴ．３共诱导组中却出现大量的
ＣｈＡＴ阳性神经元。由此可见，通过特定因子的添

加和合适的配伍可以使神经干细胞在体外向胆碱能 神经元分化。此结果为胆碱能神经元损伤的细胞修 复带来希望，并为进一步探讨神经干细胞分化调控 机制，以及神经元缺失的替代修复作用奠定了实验

基础。

Ｆｉｇ．２

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ＣｈＡＴ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ．＃．Ｐ＜０．０５ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＳＨＨ ｏｒ ＲＡ
ｇｒｏｕｐ・

致谢在实验过程中得到复旦大学上海医学院解剖组胚
教研室汪洋老师的悉心指导和无私帮助，在此深表感激。

神经干细胞的发现为人们深入研究中枢神经系 统的发育、分化以及探索治疗神经系统疾病开辟了 新的思路。近来的研究却发现将脊髓神经干细胞重 新移植入成体的脊髓内时仅能分化为神经胶质细 胞拍Ｊ。但同样的细胞在体外自然分化和移植人海 马或齿状回时可分化为神经元ｏ ７，８｜。因此，具有多 种分化潜能的神经干细胞在移植入成体脊髓后无法 分化为神经元的原因可能为缺乏合适的分化微环 境。为了能让移植后的神经干细胞产生大量的神经 元，以恢复损伤的神经系统，我们可在移植前先给予 神经干细胞一定的诱导，使其移植后向特定的神经
［１］Ｌｕｎｄｂｅｒｇ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ—Ｓｅｒｒａｎｏ Ａ，Ｃａｔｔａｎｅｏ
ｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｔａｔｉｏｎ
ｔｏ

（收稿２００７—０３—０５）

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万 　 方数据

李鹏飞等：胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

６２５

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ｓｔｅｍ

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ｎｅｒｖｏｕｓ

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ｃｅｎｔｒａｌ
ｃｕｒｓｏｒ

ｓｙｓｔｅｍ

ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ

ｎｅｒｖｏｕｓ

ｓｙｓｔｅｍ

［４］ＤｅＬａｐｅｙｆｅｒｅ Ｏ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＣＥ．Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｓｕｒ－

ｖｉｖａｌ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ，１９９７；７：６４２ ６５０

ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００７；２５：３４０—３５３

［１ １］Ｌｏｕｉｓ ＳＡ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＢＡ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏ．

ｓｐｈｅｒｅｓ ｆｒｏｍ
ｍｕｒｉｎｅ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄａｙ １４ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ

ｓｙｓｔｅｍ

ｔｉｓ—

［５］Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ Ｈ，Ｌｉｅｂｅｒａｍ
ｏｆ

Ｉ，Ｐｏｒｔｅｒ

ＪＡ

ｅｔ

ａ１．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

ｓｕｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００５；２９０：２６５—２８０

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｎｌ

ｃｅｌｌｓ

ｉｎｔｏ ｍｏｔｏｒ

ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ，２００２；１ １０：３８５

［１２］Ｗａｎｇ ＴＦ，Ｊｉｎｇ ＡＨ，Ｌｕｏ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｉｎｔｏ

ＸＹ

ｅｔ

ａ１．Ｎｅｕｒａｌ

ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ

—３９７

ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，２００６；１７：

［６］Ｃａｏ ＱＬ，Ｚｈａｎｇ ＹＰ，Ｈｏｗａｒｄ

ｇｒａｆｔｅｄ ｅｄ
ｔｏ ａ

ＲＭ

ｅｔ

ａ１．Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ
ｒａｔ

ｓｔｅｍ

ｃｅｌｌｓ

ｅｎ－

１４３３—１４３６

ｉｎｔｏ

ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ

ｏｒ

ｌｅｓｉｏｎｅｄ ａｄｕｌｔ

ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ

ａｒｅ

ｒｅｓｔｒｉｃｔ—

［１３］Ｔａｎａｂｅ Ｙ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎ

ｈａｌ ｃｏｒｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６；２７４：１１１５—１１２３

ｉｎ

ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ

ｓｐｉ—

ｇｌｉａｌ ｌｉｎｅａｇｅ．Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００１；１６７：４８—５８

ｅｔ

［７］Ｆｒｉｃｋｅｒ ＲＡ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＭＫ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｃ

ｔｉｏｎ

ａ１．Ｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉｇｒａ－
ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ

［１４］Ｅｒｉｃｓｏｎ Ｊ，Ｍｏｒｔｏｎ Ｓ，Ｋａｗａｋａｍｉ Ａ

ｅｔ

ａ１．Ｔｗｏ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｅｒｉｏｄｓ ｏｆ

ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｉｎ

ｏｆ
ｒａｔ

ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ

ｃｅｌｌｓ

Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ

ｎｅｕｒｏｎ

ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９９０—６００５

ｔｈｅ ａｄｕｌｔ

ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９９；９：

ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｃｅｌｌ，１９９６；８７：６６１—６７３
Ｌ，Ｐｒｕｇｉｎｉｎ

［１５］Ａｖｅｒｂｕｅｈ—Ｈｅｌｌｅｒ
ｅｔ

Ｍ，Ｋａｈａｎｅ Ｎ
ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ

ｅｔ

ａ１．Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３

［８］Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ ＬＳ，Ｈｏｍｅｒ ＰＪ，Ｒａｙ Ｊ

ｃｅｌｌｓ
ｇｅｎｅｒａｔｅ
ｎｅｕｒｏｎｓ

ａ１．Ａｄｕｌｔ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ

ｉｎ

ｓｔｅｍ ｇＹ－

ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ

ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ

ｆｒｏｍ

ａｖｉａｎ ｎｅｕｒａｌ ｔｕｂｅ

ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ

ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｄｅｎｔａｔｅ

ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４；９１：３２４７—３２５１

Ｐ
ｅｔ

ｍｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０００；２０：８７２７—８７３５

［１６］Ｖｉｃａｒｉｏ—Ａｂｅｊｏｎ Ｃ，Ｃｏｎｉｎ Ｃ，Ｔｓｏｕｌｆａｓ

ｅｔ

ａ１．Ｈｉｐｐｏｅａｍｐａｌ
ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｅｕｒ

ｓｔｅｍ Ｎｅｕ—

［９］Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ＣＮ，ｔｅｒ
ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｌｏｎｇ

Ｂｏｒｇ

ＭＧ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＲＪ ｔｅｒｍ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ

ａ１．Ａ

ｎｅｗ

ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ

ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ

ｉｎｔｏ

ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ

ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ

ｒｏｓｅｉ，２０００：１２：６７７—６８８

万 　 方数据