Artigo

Determinao de Metalotionenas e Fitoquelatinas utilizando a tcnica de HPLC-ICP-MS

Melendez, L. B.; Ktter, V. T.;* Montes-Bayn, M.; Sella S. M.; Silva-Filho, E. V.
Rev. Virtual Quim., 2012, 4 (6), 612-622. Data de publicao na Web: 30 de outubro de 2012

http://www.uff.br/rvq Determination of Metallothioneins and Phytochelatins using HPLC-ICPMS

Abstract: Metallothioneins and phytochelatins are peptides and proteins associated with metals present in all biological systems. Generally, in the presence of certain metal concentration, they are produced naturally by the body. There are several applications including their use as indicators of environmental pollution and to fight disease. For the determination of metallothioneins and phytochelatins is necessary to use a very detailed chemical analysis procedure that involves the extraction of these complexes, followed by a methodology of separation or purification of compounds extracted and finally by the detection of both the organic compound (the protein) and the metal associated with it. Different strategies should be used whether the subject of the analysis is the apo-form of the biomolecule or the metallic complex. In the second case, special care has to be taken for preserving the metal-biomolecule association along the sample preparation procedure. UV-VIS absorbance, fluorescence or mass spectrometry are often used for detection of the biomolecules. In the case of metallic complexes, high performance liquid chromatography (HPLC - High Resolution Liquid Chromatography) is the most used technique for separation, associated to mass spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-MS - Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry), an elemental technique, that allows the detection of metallic ions. Some aspects of this technique and its application are described in this paper. Keywords: Metallothioneins; phytochelatins; HPLC-ICP-MS.

Resumo
Metalotionenas e fitoquelatinas so protenas e peptdeos associados a metais presentes em todos os sistemas biolgicos. Geralmente, na presena de certa concentrao de metais, elas so produzidas naturalmente pelo organismo. Existem diversas aplicaes destes compostos, incluindo sua utilizao como indicadores de poluio ambiental, combate a doenas, etc. Para a identificao de metalotionenas e fitoquelatinas necessrio utilizar um procedimento bem detalhado de anlise qumica, que envolve a extrao destes complexos, seguido da separao ou purificao dos compostos extrados, e por fim, deteco. Dependendo dos objetivos a serem alcanados, se a identificao da apo-forma da biomolcula ou do complexo metlico, diferentes estratgias devem ser usadas. No segundo caso, deve-se ter cuidado especial na preservao da ligao metal-biomolcula durante os procedimentos de preparao das amostras. Com relao ao sistema de deteco, a absorbncia UV-VIS, fluorescncia ou espectrometria de massas so os mais comumente utilizados. No caso de complexos metlicos, a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) tcnica mais utilizada para a separao, acoplada a espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), tcnica de deteco de ons metlicos. Este artigo descreve, em linhas gerais, esta tcnica e suas aplicaes. Palavras-chave: Metalotionenas; fitoquelatinas; HPLC-ICP-MS.

* Universidade Federal Fluminense, Departamento de Geoqumica, Rua Outeiro de So Joo Batista s/n, Instituto de Qumica, 5 andar, CEP 24020-141, Niteri-RJ, Brasil. viniciuskutter@yahoo.com.br

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Volume 4, Nmero 6 Revista Virtual de Qumica ISSN 1984-6835

Novembro-Dezembro 2012

Determinao de Metalotionenas e Fitoquelatinas utilizando a tcnica de HPLC-ICP-MS

Luana B. Melendez,a Vinicius T. Ktter,b,* Maria Montes-Bayn,c Silvia Maria Sella,a Emmanoel V. Silva-Filhob
a

Universidade Federal Fluminense, Departamento de Qumica Analtica, Rua Outeiro de So Joo Batista s/n, Instituto de Qumica, CEP 24020-150, Niteri-RJ, Brasil. Universidade Federal Fluminense, Departamento de Geoqumica, Rua Outeiro de So Joo Batista s/n, Instituto de Qumica, 5 andar, CEP 24020-150, Niteri-RJ, Brasil.
c

Universidade de Oviedo, Departamento e Fsica e Qumica Analtica, Oviedo, Espanha.

* viniciuskutter@yahoo.com.br

Recebido em 25 de outubro de 2011. Aceito para publicao em 23 de setembro de 2012

1. Introduo 2. Anlise de MTs e PCs por HPLC-ICP-MS 3. Perspectivas da investigao de MTs e PCs no ambiente marinho 4. Concluses

1. Introduo
As metalotionenas e fitoquelatinas esto presentes em todos os organismos vivos, sendo induzidas as suas snteses, devido exposio a metais. Em 1957 foi publicado o primeiro trabalho ainda na forma de resumo relatando metais (Cdmio encontrado em tecido de equino), associado a protenas.1 J em 1960 foi publicado o primeiro trabalho completo descrevendo protenas contendo Cd e, no qual o termo metalotionenas (MT) foi sugerido para descrever estas protenas com capacidade para ligar-se a metais.2 Desde ento muitos foram os avanos nesta rea de pesquisa e protenas associadas a metais vm sendo encontradas em diversos organismos. A capacidade de peptdeos de ligar-se a metais 613

foi descrita pela primeira vez em 1981. Nesse caso, foi determinado o Cd associado a peptdeos em amostras de plantas e estes peptdeos foram denominados de 3 fitoquelatinas. As metalotionenas (MTs) constituem uma superfamlia de metaloprotenas ricas em cistena e metalopeptdeos com baixo peso molecular. Elas so responsveis pela regulao intracelular, suprindo a demanda biolgica de elementos essenciais como zinco e cobre, e protegendo as clulas de efeitos deletrios por exposio a elevadas quantidades desses elementos e de metais no essenciais como cdmio, mercrio, etc.4 As MTs se ligam a 7 equivalentes de ons metlicos divalentes, com grande afinidade, atravs da formao de clusters (domnios) metal-sulfidrila,5 de acordo como Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622|

Melendez, L. B. et al. representado na figura 1. As metalotionenas so encontradas em todos os filos animais, algumas plantas, fungos e cianobactrias. A superfamlia de metalotionenas subdividida em 15 grupos (Tabela 1). As fitoquelatinas (PCs) so pequenos peptdeos (2 a 10 kDA) ricos em cistena, que, normalmente, contm somente trs aminocidos: acido glutmico, cistena e glicina (Figura 2). Contudo, outros aminocidos podem excepcionalmente estar presentes. A estrutura geral das fitoquelatinas : (-glutamil-cistena)n glicina (n = 2-11), assim como as variantes com unidades repetidas de -glutamil-cisteinila, as quais so formadas em algumas plantas e leveduras (fungos).7 As fitoquelatinas so encontradas em algas, plantas, fungos e alguns nematdeos.

Figura 1. Stios para ligao com metais presentes na metalotionena. Os crculos denotam ons metlicos divalentes (ex. Zn2+, Cd2+, Mn2+, Cu2+)5

Figura 2. Frmula estrutural da unidade bsica das fitoquelatinas Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622| 614

Melendez, L. B. et al.

Tabela 1. Classificao das metalotionenas4,6 Famlia Subdivises m1: mamferos MT-1 m2: mamferos MT-2 m3: mamferos MT-3 m4: mamferos MT-4 m: mamferos MT a1: aves MT-1 mo1: mexilho MT-1 mo2: mexilho MT-2 c: crustceos MT c1: crustceos MT-1 e1: equinoderma MT tipo 1 d1: diptera MT tipo 1 n1: nematoda MT tipo 1 ci: ciliata MT f1: fungi-I f2: fungi-II f3 f4: fungi-IV f5: fungi-V f6: fungi-VI pr: procariota p1: planta MT tipo 1 p2: planta MT tipo 2 p3: planta MT tipo 3 p21: planta MT tipo 2x1 pec: planta EC MT-like protena a2: aves MT-2 a: aves MT r: rpteis MT t: telesteos MT s: Tubares MT b: batrquios (sapos e rs) MT mog: gastrpode MT mo: outros moluscos MT c2: crustceos MT-2 e2: equinoderma MT tipo 2 d2: diptera MT type 2 n2: nematoda MT tipo 2 Sequncia Padro

Famlia 1: vertebrados

K-x(1,2)-C-C-x-C-C-P-x(2)-C

Famlia 2: Moluscos Famlia 3: crustceos Famlia 4: Equinodermos Famlia 5: Dptera Famlia 6: Nematoda Famlia 7: Ciliados Famlia 8: Fungi I Famlia 9: Fungi II Famlia 10: Fungi III Famlia 11: Fungi IV Famlia 12: Fungi V Famlia 13: Fungi VI Famlia 14: Procariota Famlia 15: Plantas Famlia 99: Fitoquelatinas e outros no proteinceos MT-como polipeptdeos

C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-Cx-C-K P-[GD]-P-C-C-x(3,4)-C-x-C P-D-x-K-C-V-C-C-x(5)-C-x-C-x(4)-CC-x(4)-C-C-x(4,6)-C-C C-G-x(2)-C-x-C-x(2)-Q-x(5)-C-x-Cx(2)-D-C-x-C K-C-C-x(3)-C-C C-G-C-S-x(4)-C-x-C-x(3,4)-C-x-C-Sx-C C-X-K-C-x-C-x(2)-C-K-C K-C-A-C-x(2)-C-L-C [YFH]-x(5,25)-C-[SKD]-C-[GA][SDPAT]-x(0,1)-C-x-[CYF]

No definido

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Melendez, L. B. et al. A produo de fitoquelatinas e metalotionenas ocorre com a finalidade de proteger o organismo da ao dos metais txicos no essenciais, como Cd e As, ou metais essenciais em excesso, que se tornam txicos, como Zn e Cu. O estudo das metalotionenas e das fitoquelatinas de grande importncia, tanto no ponto de vista ambiental, para avaliao da qualidade de ambientes terrestres e aquticos, tendo em vista que a acumulao de metais pela biota pode ser usada como indicador de poluio ambiental, como no ponto de vista tecnolgico, j que algumas plantas e algas so organismos resistentes que hiper-acumulam metais e podem ser usadas com a finalidade de remediao de reas contaminadas por metais, como solos e guas. Alm disso, na rea mdica, a produo de metalotionenas pelo organismo uma ferramenta para o desenvolvimento de tratamento de doenas usando metais como componentes de frmacos. Uma das vantagens do uso de metalotionenas e das fitoquelatinas como indicadores o fato de a produo destas ser um indicador precoce de exposio a metais, respondendo bem antes que seja possvel mensurar um efeito fisiolgico no organismo como alterao na taxa de crescimento ou diminuio da capacidade reprodutiva8 (Figura 3).

Figura 3. Relao entre relevncia ecolgica, escala de tempo de resposta e o estudo em diferentes nveis de organizao biolgica aps exposio a um fator estressante (Modificado da referncia 9). As metalotionenas encontram-se no nvel das protenas

Na rea ambiental, uma das grandes aplicaes da determinao de fitoquelatinas a seleo de espcies capazes de hiperacumular metais para utilizao no processo de fitorremediao, que possibilita a descontaminao de ambientes pela soro de metais pelas plantas. Este processo pode ser caracterizado como limpo, com a vantagem adicional de alterar muito pouco as propriedades biolgicas e a estrutura fsica dos solos. As estratgias de fitorremediao podem oferecer procedimentos adequados para descontaminao de solos, gua e ar tanto para elementos-trao quanto para Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622|

substncias orgnicas. Na rea mdica, alm da detoxificao de metais, as metalotionenas esto relacionadas ao combate aos radicais livres. Os radicais livres so molculas que tem um nmero mpar de eltrons em sua ltima camada, o que os torna bastante reativos. Esses radicais reagem com protenas, gorduras ou mesmo o DNA para abstrao de um eltron. Cada molcula que perde um eltron precisa furtar o eltron de alguma outra molcula. Esse processo evolui em progresso e chamado de cascata oxidativa. 616

Melendez, L. B. et al.

J a carga total de radicais livres chamada de estresse oxidativo. As substncias que fornecem o eltron que est faltando, devolvendo a situao normalidade so os antioxidantes. O estresse oxidativo regulado por uma combinao de fatores

hereditrios, do ambiente e do estilo de vida. Os radicais livres causam leses tanto nas clulas como nos genes. Muitos consideram que o acmulo dessas leses ao longo da vida favorece a manifestao de doenas relacionadas ao envelhecimento (Figura 4).

Figura 4. Fatores que favorecem a formao de radicais livres

Essas diversas aplicaes das MTs e PCs requerem estudos aprofundados a respeito da produo dessas substncias pelos diversos organismos vivos. Atualmente na qumica analtica, inmeras metodologias so empregadas na investigao de MTs e PCs. Dentre as tcnicas mais usadas esto a eletroforese, a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas com plasma indutivamente acoplado (HPLC-ICPMS) e a espectrometria de massas com ionizao por eletrospray (ESI-MS). Nos ltimos anos, a tcnica de cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrmetro de massas com plasma indutivamente acoplado (HPLC-ICP-MS) vem se popularizando por possuir inmeras vantagens. A tcnica de HPLC oferece melhor separao de protenas e peptdeos e pode ser acoplada facilmente com o ICP, com grandes vantagens em relao eletroforese. 617

J o ICP-MS oferece altssima sensibilidade na determinao de metais, possibilitando detectar quantidades muito baixas, na faixa de ppb (g.kg-1). O uso de HPLC com detector UV, para visualizar a separao das protenas ou peptdeos, uma valiosa ferramenta para estudo de MTs e PCs quando acoplada a um equipamento de ICP-MS, permitindo detectar os metais associados s protenas e peptdeos.

2. Anlise de MTs e PCs por HPLCICP-MS

O primeiro passo na investigao de metais associados MTs e PCs a determinao da concentrao total do metal por ICP-MS, aps digesto cida da amostra. Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622|

Melendez, L. B. et al. A segunda etapa a extrao de protenas e polipeptdeos contendo metais. Nesse processo, inmeras so as metodologias empregadas, sendo as mais usualmente utilizadas a extrao com soluo tampo (Tris-HCl em diferentes pHs), tambm podendo ser utilizada a extrao trmica. Aps a extrao iniciado o estudo de protenas presentes no extrato, usando cromatografia (Figura 5). Geralmente, se utiliza cromatografia de excluso por tamanho (SEC) para uma separao inicial. A cromatografia de excluso por tamanho capaz de separar as protenas e peptdeos contidos no extrato por faixa de tamanho que so detectados por UV-VIS. Os comprimentos de onda mais utilizados para as fitoquelatinas so 254 ou 280 nm, enquanto que para metalotionenas so mais comumente empregados 220 e 254 nm. Em alguns casos, comprimentos de onda na faixa do visvel podem ser utilizados, como por exemplo, para metalotionena associada ao vandio em uma espcie de Ascdia, onde se usa 756nm.10

Figura 5. Fluxograma de procedimento usado para extrao e investigaes iniciais

Nesta etapa, a SEC-UV acoplada ao ICPMS para verificao da correspondncia entre os picos de protena obtidos no UV e os picos de ons metlicos (Figura 6). As fraes de polipeptdeos e protenas separadas por SEC so recolhidas para uma segunda fase de separao, utilizando uma

coluna que separe melhor os polipeptdeos ou protenas, podendo ser uma coluna de troca inica, fase normal ou fase reversa. A escolha do tipo de coluna adequado para a segunda etapa da separao ir depender da estabilidade do complexo metal-biomolcula a ser estudado.11

Figura 6. Esquema acoplado HPLC-ICPMS Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622| 618

Melendez, L. B. et al.

Uma aplicao da tcnica foi realizada em um estudo de espcies de plantas hiperacumuladoras de arsnio12. Neste estudo, uma coluna Superdex Peptide foi utilizada para separao dos peptdeos e foi possvel observar a associao de

fitoquelatinas a arsnio, como mostrado na Figura 7, no cromatograma obtido para a espcie de planta Pityrogramma calomelanos, considerada hiperacumuladora de As.

0.10

(a)

0.08
Absorbance

0.06

0.04

0.02

0.00 0 10 20 30 time / min 40

7.500 (b) 3

Intensity / cps

5.000

4 2.500 1

0.000 0 10 20 30 40

time / min

Figura 7. Cromatograma de fitoquelatinas associadas a arsnio em P. calomelanos. (a): Peptdeos monitorados por detector UV. (b): arsnio monitorado por ICP-MS12

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Melendez, L. B. et al. Uma dificuldade que vem sendo encontrada nesta linha de pesquisa a falta de materiais de referncias certificados para fitoquelatinas e metalotionenas. Por esta razo, tcnicas complementares de identificao de molculas orgnicas so utilizadas para garantir a identificao das espcies separadas por cromatografia. Apesar da farta disponibilidade de dados moleculares sobre a biossntese de PCs em plantas submetidas a estresse por Cd e Cu, pouco se sabe sobre as formas moleculares dos complexos formados entre metais e peptdeos nas plantas hiperacumuladoras. Os primeiros espectros de massas eletrospray (ESI-MS) de complexos metal-PCs foram obtidos em 1997. No entanto, somente em 1999 foi publicado o primeiro espectro de massas.13 A dificuldade com relao estabilidade do complexo metal-biomolcula, frequentemente muito lbil, um ponto crtico da tcnica. orgnicos sintticos, mobilizao antropognica de sedimento, e nutrientes) de origem continental que tem perseverana no ambiente e/ou geram efeitos adversos ao ambiente marinho. Nesse trabalho, Windom relata que entre as sete maiores categorias de contaminantes, os metais so o principal grupo, uma vez que suas emisses so pouco tratadas em escala global. Nesse contexto, a utilizao de ferramentas que permitam identificar precocemente a exposio da biota marinha a metais de suma importncia para o monitoramento e gerenciamento de reas costeiras. Tendo em vista, o fato da induo da sntese de metalotionenas em muitas espcies marinhas devido a contaminao por metais (Ag, Cd, Cu, Hg), tem liderado a proposta de uso desta superfamlia como um potencial biomarcador para exposio aos metais em organismos biomonitores aquticos,16,17 sendo que fatores naturais e fisiolgicos tem que ser considerados.18 O monitoramento das concentraes de MTs e PCs em organismos marinhos pode ser uma ferramenta eficaz em apontar precocemente os dados antrpicos ao sistema marinho, e possibilitar a tomada de deciso de gerenciamento mais adequada da rea contaminada ou espcie afetada, antes que ocorra um dano maior a todo o ecossistema. So poucos os estudos de MTs e PCs em organismos marinhos em comparao a grande diversidade de espcies existentes. Em recente trabalho publicado por Devez19 et al., no qual estes autores revisam os trabalhos de PCs em algas, foram encontrados apenas 34 trabalhos relatando a produo de PCs em algas marinhas e estuarinas, sendo que grande parte destes estudos tratam de ensaios de laboratrio. Na literatura so mencionados apenas 17 trabalhos descrevendo a ocorrncia de PCs em comunidades naturais, em esturios e reas costeiras do Oceano Atlntico Norte, Oceano Pacfico Equatorial, Oceano Pacifico Subrtico e para o Mar Egeu no Mediterrneo. 620

3. Perspectivas da investigao de MTs e PCs no ambiente marinho

Com o avano da industrializao no ltimo sculo, as emisses de substncias txicas vm tendo uma elevao tremenda e significativa, sendo uma grande preocupao nos dias de hoje o controle da emisso de poluentes e a remediao de reas contaminadas. Inmeras so as atividades humanas que afetam a qualidade ambiental de reas costeiras13 (lixo, descarga de efluentes, disposio de sedimentos dragados, explorao de petrleo, etc). Alm disso, mais de 3 bilhes de pessoas vivem a at 200 Km da costa, ou seja metade da populao mundial.14 Dentre a imensa variedade de substncias qumicas lanadas pelo homem no ambiente, destacam-se os metais. Windom15 descreve as 7 maiores categorias de contaminantes (lixo, efluente de esgoto, petrleo, metais, compostos Rev. Virtual Quim. |Vol 4| |No. 6| |612-622|

Melendez, L. B. et al.

Esta deficincia de dados de MT e PCs em organismos marinhos em campo dificultam o estabelecimento de valores naturais background de MTs e PCs, e a utilizao desta ferramenta em rotina no biomonitoramento de reas costeiras. Entretanto, alguns autores mostraram a aplicabilidade da investigao da concentrao de PCs e MTs para biomonitoramento, como exemplo no fitoplncton20 e em mexilho,21 em reas porturias e costeiras.

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4. Concluses
O estudo de fitoquelatinas e metalotionenas em organismos vivos de extrema importncia em diversas linhas de pesquisas, seja em estudos de biomonitoramento, de fitorremediao ou na rea da medicina. Por esta razo, tcnicas analticas esto sendo desenvolvidas e aplicadas para o estudo dessas espcies. A tcnica analtica de HPLC-UV-ICP-MS a que mais vm sendo empregada em pesquisas nesta rea, por ser uma ferramenta que possibilita o estudo do metal e da biomolcula. No entanto, tcnicas ainda mais avanadas j esto sendo aplicadas.

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Agradecimentos
A CAPES (PDEE- BEX- 455209-1 Vinicius T. Kutter), a FAPERJ (Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, PROC. 101.814/2009; E-26/102.814/2008) ) e ao Instituto Nacional de Cincia e Tecnologia (INCT-TMCOcean 573-601/2008-9).

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