S l i d e 1

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

1959. god. - Rosalki i Wilkinson prvi opisali porast nivoa LDH u urinu bubrenih bol otvoren put metodama i utvrivanju do tad nepoznatih enzima u mokrai vanih za dijagnozu i praenje bolesti bubrega

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

enzimi koji se odreuju u laboratorijskoj praksi: oksidoreduktaze (LDH, MDH, G-6-PDH) transferaze (gama- GT, AST, ALT) hidrolaze (alkalna fosfataza, kisela fosfataza, beta-D-glukuronidaza, N-acetilbeta-D-glukozaminidaza, proteaza) liaze (aldolaza, hialuronidaza)

S l i d e 2

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

o enzimi u mokracii obolelih
o specificni znak o ukazuje na ostecenje odredjenih strukture celije

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

za kvantitativno odreivanje enzima u urinu neophodno je odrediti
period za koji se urin sakuplja vreme uzorkovanja kada je jutarnji urin u pitanju najpogodniji period za prikupljanje urina izmeu 6 i 9 h ujutru poklapa se sa ekskrecionim pikom za veinu enzima manje praktino od uobiajenog jednokratnog sakupljanja jutarnjeg urina

o kvantitativno odredjivanje enzima u urinu problem

S l i d e 3

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

enzimi u urinu bubrenih bolesnika - jutarnji urin uzima se bez konzervansa i centrifugira da se odvoji sediment za due uvanje neophodno je obezbediti temperaturu od +4C i dodati natrijum-azid za neka odreivanja pripremljeni uzorak urina moe se zalediti i uvati na -20C vremenski definisani uzorci za merenje aktivnosti iskazuje se u jedinicama po vremenu sakupljanja

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

na aktivnost enzima utie pH urina enzimi stabilni u neutralnom pH mogu biti inhibirani u kiseloj sredini gel-filtracija za ienje uzorka urina od interferirajuih supstanci, dobija kvalitetan uzorak za analiziranje problem tumaenja dobijenih vrednosti pitanje referentnih vrednosti za mnoge enzime nisu standardizovane metode uzorkovanja, anliziranja, primena kontrolnog materijala

S l i d e 4

S l i d e 5

S l i d e 6

S l i d e 7

ODREDJ ODREDJ IVANJ IVANJ E ENZIMA

analiziranje urina uopte, pogotovu enzima u urinu, prati niz tehnikih problema Osnovni
standardizacija naina prikupljanja i konzervisanja uzorka priprema uzorka za analizu nain odreivanja aktivnosti enzima

ISPITIVANJ E FUNKCIJ E TUBULA

preko 50 enzima u mokrai ljudi mali broj se koristiti za dg. oteenja bubrega proteini male molekulske teine su naeni u mokrai zdravih osoba u veoma malim konc. slobodno prolaze kroz GBM, ukljuujui i enzime sa MT manjom od 70000 Daltona reapsorbuju ih elije proksimalnih tubula normalno u mokrai male koliine ovih enzima

Dodatni
prisustvo razliitih inhibitora i aktivatora enzima u samom uzorku za mnoge od ovih supstanci nije poznata hemijska priroda, pa uklanjanje iz uzorka predstavlja problem prisustvo neorganskog fosfata i urinarnih pigmenata kompetitivno inhibira fosfataze dva peptida niske relativne molekulske mase inhibiraju LDH

S l i d e 8

Izlu zluivanje ivanje proteina male MT

pojaavaju : visoka koncentracija u plazmi smanjena reapsorpcija u tubulima - uzroci:
Morfoloki
promene u epitelu tubula, atrofija ili oteenje, slaba degradacija u elijama kompeticija sa drugim supstancama za srodna mesta endocitoze na luminalnoj membrani el proksimalnih tubula inhibitori (reapsorpciju lizozima inhibiu lizin i citohrom C)

Imunoglobulin G (IGg ) (IGg)

pokazateq neselektivne glom. proteinurije elektri~ ki neutralan jedan od znakova o{ te} ewa propustqivosti GBM koja zavisi od naelektrisawa u bolesti bubrega u DM tip 2 prvo se gubi charge selectivity pa size selectivity

Funkcionalni

S l i d e 9

1 mikroglobulin (protein (protein HC, 1-M)

lan nove porodice lipokalina tana fizioloka funkcija jo nepoznata
moe sluiti za transport nekih supstanci nepoznate prirode razliitog energetskog potencijala ini se da je udruen sa humoralnim i celularnim imunim odgovorom

1 mikroglobulin (protein (protein HC, 1-M)

stabilan protein u urinu male MT odrazava akutni i hronicni poremecaj proksimalnih tubula visoka koncentracija u mokraci je nadjena u
slucajevima intersticijskog nefritisa, hronicne bubrezne bolesti ostecenja tubula lekovima glomerulskim bolestima refluksnoj nefropatiji asfiksiji na rodjenju insulin zavisnom dijabetes melitusu

sinteza u elijama jetre vezuje se sa imunoglobulinom A iz seruma samo slobodan oblik se filtruje kroz glomerule reapsorbuje u elijama proksimalnih tubula

S l i d e 1 0

S l i d e 1 1

S l i d e 1 2

S l i d e 1 3

Retinol binding protein, RBP

molekulska masa 21.000 daltona biosinteza se odvija u jetri polu`ivot iznosi pola dana u plazmi transportuje vitamin A sredwa koncentracija u plazmi RBP 0,0372 g/l katabolizam se odvija u celijama proksimalnih tubula koristi se za otkrivanje ostecenja funkcije proksimalnih tubula

Retinol binding protein, RBP

kiselost urina manje utice na razgradwu RBP nego na beta 2-M RBP stabilan pokazateq reapsorpcije u tubulima nedostatak je
prerenalna promenqivost promenqivost tokom dana kod dece preko 10 godina, zavisi od uzrasta i puberteta

S l i d e 1 4

Beta 22-mikroglobulin ( 2-M)

polipeptid od 100 aminokiselina molekulske teine 11.800 daltona izolovan pre 40 godina laki lanac molekula klase I glavnog HLA sistema nalazi se na svim elijama koje imaju jedro transport tekih lanaca izmeu endoplazmatskog retikuluma i elijske membrane i na taj nain stabilizuje teke lance dnevno se stvara oko 200 mg ovog polipeptida sinteza beta 2-M je poveana u nekim bolestima imunolokog porekla

Beta 22-mikroglobulin (2-M)

in vitro dokazano da citokini (interferon i , IL 2) poveavaju sintezu normalna koncentracija u plazmi 1-2 mg/l eliminie se glomerulskom filtracijom 100-200 mg/24h u proksimalnim tubulima se reapsorbuje i razgrauje normalno u urinu manje od 400 ng nestabilan je u kiseloj sredini urina , to umanjuje njegovu vrednost kao znaka oteenja. poveana vrednost 2-M i RBP je visoko specifina za tubulsko oteenje koncentracija se poveava do 20 puta u terminalnom stadijumu bubrene insuficijencije

S l i d e 1 5

N-acetil- -D-glukozaminidaza (-NAG)

u lizozomima epitelnih elija proksimalnih tubula u malim koliinama u mokrai zdravih ljudi - posledica visoke metabolike aktivnosti elija u kojima se nalazi konc. u mokrai zdravih ljudi varira zavisno od uzrasta odrasli - normalna vrednost do 0,56 U/mmol kreatinina poveano prisustvo NAG-a u mokrai ukazuje na rani tubulski poremeaj i strukturno oteenje epitelnih elija posledica bubrene bolesti ili nefrotoksinog oteenja (dejstva lekova, izraene proteinurije, dijabetesa, trudnoe)

N-acetil- -D-glukozaminidaza (-NAG

lana pozitivnost je retka aktivnost NAG-a je visoka tokom trajanja bolesti ili toksinog insulta odreivanje NAG-a u mokrai zajedno sa drugim testovima moe se upotrebiti za utvrivanje aktivnosti bolesti i prognozu primena eseja izoenzima beta-NAG-a poveava dijagnostike mogunosti ovoga testa upotreba test traka, kao jednostavniji metod, moe koristiti izvan laboratorije

S l i d e 1 6

S l i d e 1 7

S l i d e 1 8

S l i d e 1 9

Gama glutamil transferaza ( GT)

poreklom sa povrine membrane etkastog ruba epitelnih elija lumena proksimalnog tubula koncentracije u mokrai zdravih ljudi zavisi od uzrasta i pola kod odraslih
0,80-4,01 U/mmol kreatinina za ene 1,02-3,35 U/mmol kreatinina za mukarce

Gama glutamil transferaza ( GT)

pokazuje ostecenje celija proksimalnih tubula bubrega specifican, osetljiv dijagnosticka vrednost GT-a potvrdjena u
glomerulskim bolestima Toksicnom ostecenju bubrega (lekovi, teski metali)

u dijabetesnoj bolesti
vrednosti GT-a u mokraci i kod dijabeticara koji nisu imali znake poremecaja bubrezne funkcije, cak ni mikroalbuminuriju izlucivawe enzima visoko korelira sa duzinom trajanja glikemije, stepenom ostecenja bubrezne funkcije i nivoom hemoglobina A1c

S l i d e 2 0

Alkalna fosfataza (AF)

hidrolizuje estre fosforne kiseline u alkalnoj sredini duboko unutar celijske membrane epitelnih } elija proksimalnih bubreznih tubula koncentracija u mokraci kod znacajnijih strukturnih ostecenja koncentracije u mokraci zdravih ljudi zavise od uzrasta i pola kod odraslih iznose 0,03-0,32 U/mmol kreatinina za zene 0,03-0,23 U/mmol kreatinina za muskarce

Alkalna fosfataza (AF)

koristi se za utvrivanje oteenja tubula u DM stepen korelacije sa drugim parametrima znaajno manji od drugih enzima ( GT-a i NAG-a) ote teenja pojedinih delova tubula se mogu precizno utvrditi upotrebom monoklonskih antitela za odreivanje izoenzima AF u mokrai poveane vrednosti u mokrai crevnih izoenzima AF (hIAP) ukazuje na oteenje segmenta S3 tubula, odreivanje tkivnih nespecifinih izoenzima (TNAP) ukazuje na oteenje segmenata S1 i S2 tubula

S l i d e 2 1

Leucin aminopeptidaza (LAP) alanin aminopeptidaza (AAP)

enzimi membrane epitelnih elija proksimalnih tubula vre hidrolizu aminokiselina poviena koncentracija u mokrai ukazuje na oteenje proksimalnih tubula vrednosti LAP-a u glomerulonefritisu i dijabetesnoj nefropatiji znaajno koreliraju sa proteinurijom

Leucin aminopeptidaza (LAP) i alanin aminopeptidaza (AAP

odnos LAP-a i kreatinina moe posluiti kao osetljiv znak za utvrivanje poetne nefropatije mogue je da postoji korelacija izmeu LAP aktivnosti u urinu i dijabetesne retinopatije, koja obino prethodi klinikoj nefropatiji. kod 44% bolesnika sa tip II diabetes mellitusom naen je poremeen odnos LAP-a i kreatinina u fazi bolesti bez proteinurije

S l i d e 2 2

S l i d e 2 3

S l i d e 2 4

S l i d e 2 5

Transferin

Transferin
U mokrai, u lumenu tubula, utie na aktivaciju kiseonikih radikala koji aktiviraju nuklearni faktor kB (NF-kB) i reguliu gensku ekspresivnost razliitih citokina katalitikom disocijacijom iz taransferina u mokrai se oslobaa gvoe koje oteuje elije tubula peroksidacijom i stvaranjem hidroksilnih jona kao i albumin, poveava gensku ekspresivnost monocitnog hemotaktikog proteina (MCP) tubula koji podstie monocitnu/makrofagnu infiltraciju intersticijuma oslobaanje citokina uveava zapaljensku reakciju u intersticijumu, stimulie proliferaciju fibroblasta i sintezu matriksa van elija i dovodi do fibroze intersticijuma

protein molekulske mase 77.000 daltona biosinteza se odvija u jetri polu`ivot 8-9 dana u plazmi vezuje gvo`|e i transportuje ga do kostane srzi povecane trudnoca vrednosti transferina u serumu smanjene enteropatije sa gubitkom proteina terapija estrogenima nefropatiji, akutni hepatitis hronicne infekcije uremija akutna katabolicka stanja

S l i d e 2 6

Faktori rasta
znaaj u nekoliko podruja dijabetesne bubrene bolesti dokazi za vezu izmeu promena u bubregu i razliitih faktora rasta:
hormona rasta (GH), insulinu slinog faktora rasta (IGF), transformiueg faktora rasta beta (TGF-beta), epidermalnog faktora rasta (EGF), tumor nekroznog faktora rasta alfa (TNF-alfa), fibroblastnog faktora rasta (FGFs) trombocitnog faktora rasta (PDGF)

Faktori rasta
TGF- jedinstvena sposobnost da utie na elije mezangijuma i epitela glomerula, njihovo stvaranje ekstraelijskog matriksa i poveanje sinteze proteina ekstraelijskog matriksa (proteoglikan, fibronektin, tip IV kolagena, laminin) novije studije ukazale na moguu ulogu TGF- sistema u patogenezi dijabetesne nefropatije in vitro konc. eera nivo mRNA za TGF- u kulturi mezangijskih elija i elija proksimalnih tubula

S l i d e 2 7

Faktori rasta
in vitro poviena koncentracija eera stimulie gensku ekspresivnost i bioaktivnost TGF-beta, hipertrofiju elija i kolagensku transkripciju u proksimalnim tubulima pozitivna korelacija izmeu TGF-, fibronektina i inhibitora -1 aktivatora plazminogena u glomerulima i tubulointersticijumu Na osnovu in vitro podataka i in vivo rezultata, smatra se da kompleks faktora rasta uticajem na poveano stvaranje ekstracelularnih proteina matriksa i uticajem na hipertrofiju elija moe biti odgovoran za rane i kasne bubrene promene u eksperimentalnom dijabetesu

Faktori rasta

S l i d e 2 8

S l i d e 2 9

S l i d e 3 0