MECHANISMS FOR CRYOPROTECTION AND CRYOSTABILIZATION 5.6.

1 Solute Exclusion from Protein Surfaces Biochemists have long known that certain substances, such as sucrose and glycerol, when present at high concentration (>0.5 M), stabilize the activity of enzymes in solution and during freeze-thawing. Natural production of glucose by the liver is thought partially responsible for freeze tolerance in certain sub-Arctic frog species38 and other species. Based on the results of freeze-thaw experiments on labile enzymes and myofibrillar proteins, and a review of the literature on protein freezing, it has been determined that cryopreservation can be explained by the same general mechanism that Timasheff, Arakawa, and others have defined for solute-induced protein stabilization in nonfrozen, aqueous solution. Extensive studies on a variety of co-solvents that lower the solubility of globular proteins or stabilize them (e.g., glycerol, sugars, amino acids, and salts) have shown that these cosolvents are preferentially excluded from the domain of the protein; that is, in their presence, the protein is preferentially hydrated. Such exclusion is thermodynamically unfavorable because it increases the chemical potential (activity) of both the protein and the co-solvent. In the protein unfolding (denaturation) equilibrium, the effect of the solvent is defined by the relative affinities (exclusion or binding) of the solvent for the protein in its two end states, native (N) and denatured (D). The effect of the stabilizer on the equilibrium constant of the reaction, K, is a function of the stabilizer (S) and can be expressed in terms of the equilibrium constant by the Wyman linkage where vs is the difference in the number of co-solvent molecules bound by the denatured and native molecules, m is the chemicalpotential (partial molar free energy), and G is the Gibbs free energy. Because G = RT lnK, K being the equilibrium constant for the reaction, and = RT lnas, where as is the thermodynamic activity coefficient for additive S, then Hence, if an additive is a stabilizer, the reaction is shifted to the left and from Equation 5.3 vs would be negative. This means there must be less binding of the stabilizer to the denatured state. Because the surface of contact between protein and solvent constitutes an interface, there must be in this surface an interfacial (surface) tension. Low molecular weight carbohydrate cryoprotective additives such as sucrose and sorbitol perturb the cohesive force of water and hence its surface tension. The excess or deficiency of the additive in the surface layer can be calculated by Gibbs adsorption isotherm: d= d where is surface tension and is the adsorption (excess concentration) of co-solvent at the surface. Thus, if a substance increases the surface tension of water, its excess in the surface layer will be negative, that is, preferentially excluded from the interface. Timasheff and Arakawa compared the ratio of the preferential interactions measured experimentally by dialysis equilibrium to that calculated from the surface tension effect for a range of proteins and stabilizers, and concluded that this mechanism appears to give rise to the observed preferential exclusion of sugars, amino acids, and structure-stabilizing salts. Stabilization by increased surface tension of the medium appears to be the dominant factor leading to the thermal stability of proteins, particularly globular proteins. In addition, as observed earlier, the preferential hydration of proteins in the presence of sugars is due to the ability of the sugar to increase the surface tension of water. Increased surface tension of water in the presence of polyols and sugars has been attributed to stronger or more extensive hydrogen bonding between solute hydroxyl groups and water molecules, as suggested from various spectroscopic and thermodynamic studies. An alternative explanation is that stabilization is due to specific effects of these solutes on the hydration forces at the protein surface. Solutes could affect hydration forces if they were either adsorbed onto the proteinwater interface, in which case they would produce an interface with an altered capacity to polarize water and an altered surface mobility, or excluded from the interface and thus create a barrier between macromolecules. A primary factor contributing to the instability of proteins at subambient temperatures is the decreasing strength of intramolecular hydrophobic interactions, which stabilize the native protein structure, with decreasing temperature. Because hydrophobic interactions are a thermodynamic response to the structuring of water by apolar groups on the protein surface, agents that affect water structure can affect protein stability. While the protein intramolecular hydrophobic interactions are weakened by lowering the temperature, there is a counteracting effect of increasing solute concentration and thus increasing solute surface tension resulting from the freezing of pure water into ice. A more in-depth discussion of the solute exclusion theory is given in MacDonald and Lanier.

The validity of the solute exclusion principle in surimi was illustrated in studies41,42 that investigated the cryoprotective properties of sodium lactate. Overall, both freeze-thaw and heat denaturation studies showed that sodium lactate was a more effective stabilizer than sucrose. However, in each case, above a certain concentration, lactate actually destabilized the actomyosin. Figure 5.11 shows the results of freeze-thaw experiments on the denaturation of tilapia actomyosin1 A loss of Ca2+ATPase activity showed the extent of denaturation during freeze-thawing. The cryoprotective effect increased to a maximum at about 6% (w/v) sodium lactate concentration with 80% of the activity recovered. In contrast, for sucrose, the level of cryoprotection increased monotonically with sugar concentration. On a percent basis, sodium lactate appeared to be about four times more effective than sucrose because 25% sucrose would be needed to give an equivalent degree of cryoprotection to the optimum for sodium lactate. It was concluded that sodium lactate, like sucrose, stabilizedthe actomyosin by the mechanism of increasing solution surface tension. Surface tension measurements showed that the concentrations of sodium lactate, which corresponded to stabilization and destabilization of heated actomyosin, closely correlated with concentrations where surface tension either increased or decreased, respectively. The decrease in surface tension was ascribed to dimer formation at higher concentrations, creating an amphiphilic molecule.In comparison, the surface tension of sucrose solutions increased with increasing concentration. This correlates with previous studies that established a monotonic relationship between protein stabilization and sucrose concentration. The surface tensions of sucrose solutions were also lower than the corresponding sodium lactate solutions up to 20% sodium lactate. Sodium lactate is a particularly useful example of an additive stabilizing by the preferential exclusion mechanism, because higher concentrations of sodium lactate actually destabilized actomyosin, and the transition from stabilizationto destabilization was associated with either an increase or decrease in solution surface tension with sodium lactate concentration. 5.6.2 Ligand Binding An exception to the general destabilization of proteins by cosolvents that bind to the protein is the case when oligomeric proteins are stabilized by binding with specific ligands. For example, the nucleotides ATP, ADP, and IMP exerted a protective effect on fish actomyosin stored at 20oC while the nucleotide catabolites, inosine and hypoxanthine, destabilized these proteins.56 Myosin is a hexamer that consists of two identical heavy chains and two pairs of essential and regulatory light chains with a specific nucleotide binding site. Binding ATP induces a conformational change in the myosin structure, which leads to increased stability of the protein. The importance of the specificity of the ligandprotein interaction is shown by the contrary findings of Carpenter and colleagues,5861 who reported that low concentrations of Zn2+ ions acted synergistically with sugars to stabilize the tetrameric ATPase, phosphofructokinase, during freeze-thawing and freeze-drying, whereas MacDonald et al. demonstrated that even at very low levels, Zn2+ destabilized fish actomyosin during freeze-thawing. 5.6.3 Antioxidants Polyphosphates at 0.2 to 0.3% are commonly added as synergists to the cryoprotective effect of carbohydrate additives in the manufacture of surimi. Phosphates may serve to chelate calcium ions that can induce protein aggregation. As antioxidants of lipids, they may also protect proteins from denaturation induced by hydrolysis or autooxidation of phospholipids. Other antioxidants may also serve a useful function in protecting unsaturated lipids and proteins during frozen storage. Erickson68 has recently reviewed a wide range of antioxidants and their application to frozen foods, including seafoods. 5.6.4 Freezing-Point Depression Ice formation concentrates reactants, particularly salts and hydrogen ions (pH depression), which thermodynamically destabilize proteins.The volume of ice formed increases with decreasing temperature below the freezing point. Thus, by depressing the freezing point with low molecular weight solutes, the deleterious effects of freeze concentration on proteins at any sub-freezing storage temperature (above the operative glass transition temperature; see below) should be lessened. The presence of any solute will lower the freezing point of water in a colligative fashion. Ideally, its performance is related to its concentration according to Raoults law, in which the mole fraction of solute is equal to the proportional reduction of solution vapor pressure compared to the pure solvent. Figure 5.12 illustrates the freezing point depression effected by a number of food-grade carbohydrates as a function of concentration. The freezing point of water is defined as the temperature at which the vapor pressure of the solid phase (ice) is equal to the vapor pressure of the liquid phase.Thus, on an equal mass basis, lower molecular weight solutes will have the

greater molarity and therefore the greater effect on freezing point depression. Interactions between solute and water molecules that affect the vapor pressure of the water may cause deviations from ideal behavior.The most general cause for non-ideality in solutions of macromolecules arises from the size and shape, as expressed by their molecular excluded volume.This excluded volume, which accounts for the volume occupied by the solute, is therefore not available to other molecules in the solution, and can be unexpectedly large for asymmetric rods or random coils. 5.6.5 Cryostabilization by High Molecular Weight Additives Carpenter and Crowe theorized that certain high molecular weight polymers (e.g., polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, and dextran) are good cryoprotectants because they are stearically excluded from the protein surface by their size. However, an additional mechanism has been postulated by other workers to explain the cryoprotective effects of many high molecular weight polyols and glucose polymers (starch hydrolysis products),a mechanism that takes into account the dramatic increase in viscosity that occurs as these polymers are freeze concentrated and form glasses. With continued lowering of the temperature below the freezing point, the rates of diffusion-limited deteriorative reactions decrease steadily as ice freezes out and solution viscosity increases, which lowers the diffusivity of the dissolved reactants (i.e., molecular mobility).Solutes that most interact with water to affect solution viscosity and water mobility would have the greater effect in reducing reaction rates at any subfreezing temperature. Solution viscosity reaches a maximum at the glass transition temperature (Tg) of a solution. Figure 5.13 illustrates the glass transition temperature of a simple solution as a function of solute concentration. At higher concentrations of solute, the Tg occurs at temperatures above freezing. Thus, the mixture cools to form a candy glass directly from the liquid state. At solute concentrations below the point Cg, when the temperature falls below the freezing curve, the solution will exist either as a viscous supersaturated solution in the liquid state or, more commonly, as a mixture of ice crystals and supersaturated solution. Under these conditions, the system is termed a rubber, exhibiting a high viscosity due to the presence of ice crystals and/or strong intermolecular solute interactions/entanglements. The rubber state is characterized by a departure from Arrhenius kinetics of chemical and enzymatic reactions, following instead Williams-Landel-Ferry kinetics. The rate of freezing and the constancy of storage temperature will influence ice crystal sizes and numbers, and likewise the solute concentration. Thus, Tg can be altered by time factors not shown in the two-dimensional phase diagram in Figure 5.13.

As the glass transition temperature is approached, reactions become diffusion limited due to immobilization of the water within a solute structure.The glassy state is attained when solutesolute interactions supersede solute water attractions and occurs at the Tg for the given solute and concentration. Viscosities near 10 Pa.s are characteristic. The structure is amorphous, like that of liquid, with no crystallinity other than that of the enmeshed ice crystals. If complete vitrification (glass formation) is achieved, no further ice formation will accompany decreases in temperature.According to the cryostabilization theory of Levine and Slade, deteriorative processes cease in the practical timeframe once the glass state is achieved. Mobility or diffusion in a glassy system is claimed to be virtually nonexistent. However, Fennema77 argues that no food system is so simple that a single Tg can be ascribed because microenvironments within the food will have successively lower Tg values. For this reason, he asserts the concept of a glass transition zone of temperature, below which ultimate stability is achieved due to water immobilization. The requirement in cryostabilization for use of polymers exhibiting relatively large molecular weights arises from their ability to form glasses at higher freeze temperatures. This is due to their propensity to entangle as well as form hydrogen and other bonds, imparting a greater viscosity at any given concentration. The glass transition of a carbohydrate is weakly dependent on structure, with a much stronger dependence on molecular weight. Levine and Slade have published tables and graphs that indicate a generally direct relationship between molecular weight (or, inversely, dextrose equivalent, DE, for starch hydrolysis products) and Tg. Roos and Karel85 and Roos86 also found a relationship between increasing Tgand increasing molecular weight for a series of glucose polymers, although they found that the effective molecular weight was a better predictor of a polymers ability to change Tgthan the molecular weight average. Branching of the molecule will affect the solution properties of polymers, such that a strictly direct relationship between MW (molecular weight) and Tgwill hold only for a homologous series. It is possible to increase the overall glass transition temperature (or zone) of a food, and therefore theoretically improve the foods stability, by adding polymers that form glasses at high temperatures. The

simplest equation that has been used to estimate the Tgis the Gordon and Taylor equation: where Tg1 and Tg2 are the glass transition values (in K) of components 1 (water) and 2 (solute) of the sample, respectively; w1 and w2 are the weight fractions of components 1 and 2 of the sample, respectively; and k is an empirical constant. Although Roos and Karel found the Gordon and Taylor equation (which was originally developed for binary polymer systems) useful for predicting the Tgin amorphous carbohydrates, care should be taken when using it to estimate the Tgof complex foods. Further and more complex models are discussed in Roos. Thus far, only maltodextrins and some other sugar polymers such as polydextrose have been investigated for their cryoprotective properties as agents for raising Tgin foods. Table 5.1 illustrates the Tgvalues of selected maltodextrins as compared with sucrose. Carvajal et al. investigated the role of maltodextrins in the cryoprotection of surimi. They found that, with increasing molecular weight, the ability of the maltodextrin to cryoprotect surimi during freezing/thawing diminished greatly, but its ability to cryoprotect during isothermal storage at 20C remained high. This was taken as evidence that maltodextrins do primarily cryoprotect by raising the Tg, although the lower molecular weight maltodextrins may also cryoprotect to some extent by a solute exclusion mechanism. Apart from the deleterious changes associated with phase changes as muscle or minces are frozen and thawed, such as enzymatic processes, it is possible that cold destabilization of myofibrillar proteins16 could be a factor in the instability of fish proteins. Some of the principal mechanisms for myosin denaturation, aggregation, and the subsequent loss of functionality or quality may not be diffusion controlled and hence may not be greatly affected by glass formation. Likewise, very small molecules such as oxygen may be able to diffuse within the glass formed at or below the Tg of the system, such that oxidation of lipids and proteins may go unhindered. Thus, total reliance on the restriction of molecular mobility by high molecular weight components to achieve cryoprotection may be inadvisable. For these and other practical reasons, developing cryoprotectant cocktails that are designed specifically for each food and its processing/storage environment is suggested. 5.6.6 Vitrification A vitrified biological system is one in which no (or practically no) ice is present and all the fluid is immobilized in a glass. Aspects of this state apparently contribute to the ability of certain insects to survive freezing and freeze resistance in plants.91 Research on this topic is seriously being pursued in cryobiology with the purpose of eventually being able to successfully freeze, without loss of viability, entire human organs. To attain such a physical state in a biological system will likely require a combined approach of adding glass-forming cryoprotectants to raise Tg, high pressure during freezing and/or thawing to lower the freezing/melting point (see later discussion) and raise Tg, and extremely fast freezing rates. Successful vitrification of small cells and embryos has been obtained in the laboratory but there are equal problems of thawing the specimen without massive recrystallization and damage to the organism. For example, Kresin et al.determined that even if cooling rates high enough to avoid substantial crystallization are achieved, the critical warming rates needed to avoid devitrification and ice recrystallization are 2 to 3 orders of magnitude higher. For practical reasons, it is unlikely that total vitrification (i.e., without ice formation) will be a feasible approach to food preservation, particularly surimi.)

MEKANISME UNTUK CRYOPROTECTION DAN CRYOSTABILIZATION

5.6.1 Larutan Eksklusi Pada Permukaan Protein Ahli biokimia telah lama mengetahui bahwa zat tertentu, seperti sukrosa dan gliserol, pada konsentrasi tinggi (> 0,5 M), dapat menstabilkan aktivitas enzim dalam larutan dan selama proses pelelehan. Produksi alami glukosa oleh hati dianggap ikut bertanggung jawab pada pembekuan beberapa spesiessub-Arktik katak tertentu dan spesies lainnya. Berdasarkan hasil percobaab freeze-thawing terhadap enzim yang labil dan protein myofibrillar, dan kajian literatur tentang pembekuan protein, telah ditentukan bahwa kriopreservasi dapat dijelaskan oleh mekanisme umum yang sama bahwa Timasheff, Arakawa, dan lain-lain telah menetapkan stabilisasi protein yang larut dalam larutan yang tidak dibekukan. Penelitian lebih lanjut pada berbagai co-pelarut menjelaskan bahwa kelarutan protein globular lebih rendah atau menstabilkan mereka (misalnya, gliserol, gula, asam amino, dan garam) telah menunjukkan bahwa pelarut tsb belum termasuk dari protein domain, yang kehadirannya protein ini dihidrasi. Pengecualian tersebut secara termodinamika tidak menguntungkan karena meningkatkan potensi kimia (aktivitas) dari kedua protein dan co-pelarut. Dalam keseimbangan pemecahan ikatan protein (denaturasi), efek dari pelarut ditentukan oleh afinitas relatif (pengecualian atau mengikat) dari pelarut untuk kedua protein, asli (N) dan terdenaturasi (D). Pengaruh stabilizer pada konstanta kesetimbangan reaksi, K, merupakan fungsi dari stabilizer (S) dan dapat dinyatakan dalam konstanta kesetimbangan oleh linkage Wyman dimana vs adalah perbedaan jumlah ikatan molekul co-pelarut terdenaturasi dan asli, m potensial kimia (energi bebas molar parsial) dan delta G adalah energi bebas Gibbs. Karena delta G = RT LNK, K menjadi kesetimbangan konstan untuk reaksi, dan = RT lna, dimana adalah koefisien aktivitas termodinamika untuk aditif S, maka Oleh karena itu, jika suatu zat aditif adalah stabilisator, reaksi digeser ke kiri dan dari Persamaan 5.3 vs akan menjadi negatif. Ini berarti pasti ada sedikit ikatan stabilizer yang terdenaturasi.

Karena permukaan kontak antara protein dan pelarut merupakan sebuah interface,ada ketegangan dalam permukaan interfacial. Crioprotektif dari karbohidrat dgn BM yang rendah seperti sukrosa dan sorbitol mengganggu kekuatan kohesif air dan tegangan permukaannya. Kelebihan atau kekurangan aditif dalam lapisan permukaan dapat dihitung dengan Gibbs 'adsorpsi isoterm: d=-d dimana adalah tegangan permukaan dan adalah adsorpsi (konsentrasi berlebih) dari copelarut di permukaan. Dengan demikian, jika suatu zat dapat meningkatkan tegangan permukaan di air, kelebihannya di lapisan permukaan akan negatif. Timasheff dan Arakawa membandingkan rasio interaksi preferensial yang diukur dengan keseimbangan dialisis yang dihitung dari efek tegangan permukaan untuk berbagai protein dan stabilisator, dan menyimpulkan bahwa mekanisme ini tampaknya menimbulkan pengecualian gula, asam amino , dan garam2 yang menstabilkan struktur. Stabilisasi ditingkatkan oleh tegangan media yang muncul sbg factor yang dominan pada stabilitas termal protein, khususnya protein globular. Selain itu, seperti diamati sebelumnya, hidrasi preferensial protein dengan keberadaan gula adalah karena kemampuan gula untuk meningkatkan tegangan permukaan air. peningkatan tegangan permukaan air dengan adanya poliol dan gula telah dikaitkan dengan ikatan hidrogen kuat atau lebih luas antara kelompok-kelompok hidroksil terlarut dan molekul air, seperti yang disarankan dari studi spektroskopi dan termodinamika. Penjelasan alternatif adalah bahwa stabilisasi karena efek spesifik dari kekuatan hidrasi larutan2 ini pada permukaan protein. Larutan dapat mempengaruhi kekuatan hidrasi jika mereka diadsorbsi ke dalam protein-water interface, dimana mereka akan menghasilkan sebuah interface dengan mengubah kapasitas kedalam polarisasi air dan mobilitas permukaan, atau diluar dari interface dan juga membuat sebuah penghalang antar makromolekul . Faktor utama yang berkontribusi terhadap ketidakstabilan protein pada suhu subambient adalah penurunan kekuatan interaksi hidrofobik intramolekul, yang

menstabilkan struktur protein asli, dengan menurunnya temperatur. Karena interaksi hidrofobik adalah respon termodinamika pada struktur air oleh kelompok apolar pada permukaan protein, ini mempengaruhi konsentrasi larutan dan juga meningkatkan tegangan permukaan larutan yang dihasilkan dari pembekuan air murni menjadi es. Sebuah diskusi yang lebih mendalam dari teori eksklusi terlarut diberikan dalam MacDonald dan Lanier. Validitas dari prinsip eksklusi pelarut dalam surimi digambarkan dalam penelitian cryoprotective dari natrium laktat. Secara keseluruhan, baik studi freeze-thaw dan denaturasi menunjukkan bahwa natrium laktat lebih efektif sebagai penstabil daripada sukrosa. Namun, dalam setiap kasus, di atas konsentrasi tertentu, laktat menjadi tidak stabil terhadap aktomyiosin. Gambar 5.11 menunjukkan hasil percobaab freeze-thaw pada denaturasi actomyosin nila. Hilangnya aktivitas Ca2+- ATPase menunjukkan tingkat denaturasi selama pembekuan-pencairan. Efek cryoprotective meningkatkan maksimal sekitar 6% (b / v) konsentrasi natrium laktat untuk merocovery 80% aktivitasnya. Sebaliknya, untuk sukrosa, tingkat cryoprotection meningkat secara monoton dengan konsentrasi gula. natrium laktat empat kali lebih efektif daripada sukrosa karena 25% sukrosa akan diperlukan untuk memberikan tingkat kriopektif optimum yang setara dengan sodium laktat. Disimpulkan bahwa natrium laktat, seperti sukrosa, menstabilkan aktomyosin oleh mekanisme yang dapat meningkatkan tegangan permukaan.Pengukuran tegangan permukaan memperlihatkan bahwa konsentrasi sodium laktat , yang berhubungan dengan stabilisasi dan destabilisasi actomyosin yang dipanaskan, erat kaitannya dengan konsentrasi di mana tegangan permukaan bisa meningkat atau menurun. Penurunan tegangan permukaan dianggap berasal dari dimer formasi pada konsentrasi yang lebih tinggi, menciptakan molekul amphifilik. Dalam perbandingan, tegangan permukaan pelarut sukrosa meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Hal ini berkorelasi dengan studi sebelumnya yang menyebutkan hubungan monototonik antara stabilisasi protein dan konsentrasi sukrosa. Tegangan permukaan pada pelarut sukrosa juga lebih rendah daripada pelarut natrium laktat sampai 20%. Natrium laktat adalah contoh yang sangat berguna sebagai aditif dengan mekanisme eksklusi, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari natrium laktat tidak menstabilkan actomyosin. 5.6.2 Ligan Pembatas Sebuah pengecualian terhadap destabilisasi umum protein oleh cosolvents yang mengikat protein ini terjadi ketika protein oligomer disatbilkan dengan mengikat ligan yang spesifik. Misalnya, nukleotida ATP, ADP, IMP memberikan efek perlindungan pada actomyosin ikan yang disimpan di suhu 20oC sementara catabolites nukleotida, inosin dan hipoksantin, menstabilkan protein ini. myosin adalah heksamer yang terdiri dari dua rantai identik dan dua pasang rantai esensial dan diatur dengan nukleotida binding yang spesifik. ATP binding menginduksi perubahan konformasi dalam struktur myosin, yang mengarah kpada peningkatan stabilitas protein. Pentingnya interaksi ligan-protein ditunjukkan oleh penemuan carpenter et al yang melaporkan bahwa konsentrasi ion Zn2 + yg rendah mengaktifkan sinergitas gula untuk menstabilkan tetrametik ATPase, fosfofruktokinase, selama freeze-thawing dan bekukering, sedangkan MacDonald et al. menunjukkan bahwa bahkan pada tingkat yang sangat rendah, Zn2 + tidak menstabilkan actomyosin ikan selama freeze-thawing. 5.6.3 Antioksidan Polifosfat pada konsentrasi 0,2 hingga 0,3% biasanya ditambahkan sebagai fungsi sinergis untuk efek cryoprotective terhadap karbohidrat pada surimi. Fosfat dapat berfungsi untuk meng-kelat ion kalsium yang dapat menginduksi agregasi protein. Sebagai antioksidan lipid, mereka juga dapat melindungi protein dari denaturasi yang disebabkan oleh hidrolisis atau autooxidasi fosfolipid. Antioksidan lainnya juga dapat ber fungsi dalam melindungi lipid tak jenuh dan protein selama penyimpanan beku. Erickson baru-baru ini meninjau berbagai antioksidan dan aplikasinya pada makanan beku, termasuk makanan laut. 5.6.4 Penekanan Titik beku Konsentrasi2 reaktan pembentuk es, khususnya garam dan ion hidrogen (pH depresi), yang secara termodinamika tdk menstabilkan protein. Volume es yang dibentuk meningkat dengan menurunkan suhu di bawah titik beku. Dengan demikian, dengan menekan titik beku dengan

pelarut berBM rendah, mempengaruhi konsentrasi protein pada saat pembekuan. Keberadaan beberapa pelarut akan merendahkan titik pembekuan dari air. Idealnya, kinerjanya terkait dengan konsentrasi menurut hukum Raoult, di mana fraksi mol zat terlarut sama dengan pengurangan tekanan uap pada pelarut murni. Gambar 5.12 menggambarkan penekakan titik beku yang dipengaruhi oleh sejumlah karbohidrat food gradesebagai fungsi konsentrasi. Titik beku air didefinisikan sebagai suhu di mana tekanan uap dari fase padat (es) adalah sama dengan tekanan uap phase. Jadi, pada basis massa yang sama, pelarut dgn berat molekul lebih rendah akan memiliki molaritas lebih besar dan oleh karena itu efek lebih besar pada penekanan titik beku. Interaksi antara pelarut dan molekul air mempengaruhi tekanan uap air dapat menyebabkan penyimpangan dari kebiasaan ideal. 5.6.5 Cryostabilization oleh Aditif berberat molekul Tinggi Carpenter dan Crowe berteori bahwa polimer berberat molekul tinggi tertentu (misalnya, polivinilpirolidon, glikol polietilen, dan dekstran) adalah krioprotektan yang baik karena mereka dapat dikeluarkan dari permukaan protein sesuai ukuran mereka. Namun, mekanisme tambahan telah didalilkan oleh pekerja lain yang menjelaskan bahwa cryoprotective mempengaruhi beberapa polimer polyol dan glukosa ber BM tinggi (produk hidrolisis pati), suatu mekanisme yang memperhitungkan peningkatan viskositas yang terjadi sebagai polimer2 dalam pembekuan dan penggelasan. Dengan terus menurunkan suhu di bawah titik beku, tingkat reaksi deteriorative menurun terus seperti es yang mencair dan peningkatan viskositas pelarut, yang menurunkan difusivitas dari reaktan (yaitu, mobilitas molekul). Zat terlarut yang paling berinteraksi dengan air untuk mempengaruhi viskositas solusi dan mobilitas air akan memiliki efek yang lebih besar dalam mengurangi laju reaksi pada setiap suhu subfreezing. Viskositas pelarut mencapai maksimum pada suhu transisi kaca (Tg) dari pelarut. Gambar 5.13 menggambarkan suhu transisi gelas pelarut sederhana sebagai fungsi konsentrasi zat terlarut. Pada konsentrasi tinggi zat terlarut, Tg terjadi pada suhu di atas titik beku. Dengan demikian, campuran mendingin untuk membentuk "permen" kaca langsung dari keadaan cair. Pada konsentrasi pelarut di bawah Cg titik, ketika temperatur turun di bawah kurva freezing, pelarut akan ada baik sebagai pelarut jenuh dalam fase cair, lebih umum, sebagai campuran kristal es dan pelarut jenuh. Dibawah kondisi tersebut, sistem ini disebut sebagai "karet," menunjukkan viskositas tinggi karena adanya kristal es dan / atau interaksi terlarut yang kuat antarmolekul / belitan. The rubber state ditandai dengan perhitungan kinetika kimia Arrhenius dan reaksi enzimatik, mengikuti kinetika Williams-Landel-Ferry. Tingkat pembekuan dan suhu penyimpanan akan mempengaruhi ukuran kristal es dan jumlahnya, dan juga konsentrasi pelarut. Dengan demikian, Tg dapat diubah sebagai faktor waktu yang tidak ditampilkan dalam diagram fasa dua dimensi pada Gambar 5.13.

Sebagaipendekatan suhu transisi kaca, reaksi difusi menjadi terbatas karena imobilisasi air dalam keadaan bentuk struktur zat terlarut kaca adalah dicapai ketika zat terlarut-terlarut interaksi menggantikan terlarut-air atraksi dan terjadi di Tg untuk zat terlarut yang diberikan dan konsentrasi. Viskositas dekat 10 Pa.s merupakan karakteristik. Struktur adalah amorf, seperti yang cair, tanpa kristalinitas selain dari kristal-kristal es terjerat. Jika vitrifikasi lengkap (pembentukan kaca) tercapai, tidak ada pembentukan es lanjut akan menemani penurunan temperature.According dengan teori cryostabilization dari Levine dan Slade, proses yg memburuk berhenti dalam jangka waktu yang praktis sekali negara kaca tercapai. Mobilitas atau difusi dalam sistem kaca yang diklaim hampir tidak ada. Namun, Fennema77 berpendapat bahwa tidak ada sistem pangan yang begitu sederhana bahwa Tg tunggal dapat berasal karena microenvironments dalam makanan akan memiliki nilai yang lebih rendah Tg. Untuk alasan ini, ia menegaskan konsep zona transisi kaca suhu, stabilitas di bawah ini yang utama dicapai karena imobilisasi air. Persyaratan dalam cryostabilization untuk penggunaan polimer menunjukkan berat molekul yang relatif besar muncul dari kemampuan mereka untuk membentuk gelas pada suhu beku yang lebih tinggi. Ini adalah karena kecenderungan mereka untuk melibatkan serta membentuk hidrogen dan obligasi lainnya, menyampaikan viskositas yang lebih besar pada setiap konsentrasi tertentu. Transisi kaca dari karbohidrat adalah lemah tergantung pada struktur, dengan ketergantungan yang lebih kuat pada berat molekul. Levine dan Slade telah menerbitkan tabel dan grafik yang menunjukkan hubungan langsung antara umumnya berat molekul (atau, terbalik, dekstrosa ekuivalen, DE, untuk produk hidrolisis pati) dan Tg. Roos dan Karel85 dan Roos86 juga menemukan hubungan antara Tg meningkatkan dan berat molekul meningkat serangkaian polimer glukosa, meskipun mereka menemukan bahwa "berat molekul yang efektif" adalah prediktor daripadayang lebih baik dari kemampuan polimer untuk mengubah Tg berat molekul rata-rata. Percabangan molekul akan mempengaruhi sifat solusi dari polimer, sehingga hubungan akan mengadakanlangsung antara ketat MW (berat molekul) dan Tg hanya untuk seri homolog. Hal ini dimungkinkan untuk meningkatkan suhu transisi kaca keseluruhan (atau zona) dari makanan, dan karena itu secara teoritis meningkatkan stabilitas makanan itu, dengan menambahkan polimer yang membentuk gelas pada suhu tinggi. Persamaan adalahsederhana yang telah digunakan untuk memperkirakan Tg persamaan Gordon Taylor dan: mana TG1 dan Tg2 adalah nilai transisi kaca (dalam K) dari komponen 1 (air) dan 2 (solut) dari sampel, masing-masing; w1 dan w2 adalah fraksi berat dari komponen 1 dan 2 sampel, masing-masing, dan k adalah konstanta empiris. Meskipun Roos dan Karel menemukan Gordon dan persamaan Taylor (yang awalnya dikembangkan untuk sistem biner polimer) berguna untuk memprediksi Tg karbohidrat amorf, perawatan harus dilakukan ketika menggunakannya makanan yang kompleks.untuk memperkirakan Tg Model lebih lanjut dan lebih kompleks dibahas dalam Roos. Sejauh ini, hanya maltodekstrin dan beberapa polimer gula lainnya seperti polydextrose telah diteliti untuk properti cryoprotective mereka sebagai dalam makanan.agen untuk meningkatkan Tg nilai maltodekstrin dipilih dibandingkan dengan sukrosa.Tabel 5.1 menggambarkan Tg Carvajal et al. meneliti peran maltodekstrin dalam cryoprotection dari surimi. Mereka menemukan bahwa, dengan berat molekul meningkat, kemampuan maltodekstrin untuk cryoprotect surimi selama pembekuan / pencairan berkurang sangat, namun kemampuannya untuk cryoprotect selama tetap tinggi.penyimpanan isotermal pada 20 C Hal ini diambil sebagai bukti bahwa maltodekstrin yang terutama cryoprotect dengan menaikkan Tg, meskipun maltodekstrin rendah berat molekul juga dapat cryoprotect sampai batas tertentu dengan mekanisme pengecualian zat terlarut. Terlepas dari perubahan merugikan terkait dengan perubahan fasa sebagai otot atau minces dibekukan dan dicairkan, seperti proses enzimatik, adalah mungkin bahwa destabilisasi dingin myofibrillar proteins16 bisa menjadi faktor dalam ketidakstabilan protein ikan. Beberapa mekanisme utama untuk myosin denaturasi, agregasi, dan hilangnya berikutnya fungsi atau kualitas mungkin tidak difusi dikontrol dan karenanya mungkin tidak sangat dipengaruhi oleh pembentukan kaca. Demikian juga, molekul yang sangat kecil seperti

oksigen mungkin dapat menyebar di dalam kaca terbentuk pada atau di bawah Tg dari sistem, sehingga oksidasi lipid dan protein dapat pergi tanpa hambatan. Dengan demikian, total ketergantungan pada pembatasan mobilitas molekul dengan berat molekul tinggi komponen untuk mencapai cryoprotection mungkin disarankan. Untuk ini dan alasan praktis lainnya, mengembangkan krioprotektan "koktail" yang dirancang khusus untuk setiap makanan dan pengolahan / penyimpanan lingkungannya disarankan. 5.6.6 Vitrifikasi Sebuah sistem biologi vitrifikasi adalah satu di mana tidak ada es (atau hampir tidak ada) hadir dan semua cairan yang bergerak dalam gelas. Aspek negara ini tampaknya berkontribusi terhadap kemampuan serangga tertentu untuk bertahan hidup membeku dan ketahanan membeku di plants.91 Penelitian tentang topik ini serius dikejar dalam Cryobiology dengan tujuan akhirnya mampu berhasil membekukan, tanpa kehilangan viabilitas, organ tubuh manusia secara keseluruhan. Untuk mencapai suatu keadaan fisik dalam sistem biologis mungkin akan memerlukan pendekatan gabungan menambahkan pembentuk kaca krioprotektan untuk meningkatkan Tg, tekanan tinggi selama proses pembekuan dan / atau pencairan untuk menurunkan titik beku / leleh (lihat nanti diskusi) dan meningkatkan Tg, dan tingkat pembekuan sangat cepat. Vitrifikasi Keberhasilan sel kecil dan embrio telah diperoleh di laboratorium tetapi ada masalah sama pencairan spesimen tanpa rekristalisasi besar dan kerusakan pada organisme. Misalnya, Kresin et al.determined bahwa bahkan jika tingkat pendinginan cukup tinggi untuk menghindari kristalisasi substansial tercapai, tingkat pemanasan kritis yang diperlukan untuk menghindari devitrifikasi dan rekristalisasi es 2 sampai 3 lipat lebih tinggi. Untuk alasan praktis, tidak mungkin bahwa vitrifikasi total (yaitu, tanpa pembentukan es) akan menjadi pendekatan yang layak untuk pengawetan makanan, terutama surimi.)