Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

16. AKVATIKI TESTOVI TOKSINOSTI*

Otrov (toksin ili polutant) definira se kao bilo koja tvar koja se nalazi u vodi i koja moe, kad je unijeta u tijela vodenih organizama, svojim specifinim djelovanjem promijeniti njihovo zdravlje. Toksina djelovanja mogu biti letalna i subletalna. Subletalna obuhvaaju npr. promjene u rastu, razvoju, razmnoavanju, ponaanju, pa histoloke, biokemijske ili fizioloke promijene. Djelovanje otrova obino ovisi o njegovoj koncentraciji i/ili trajanju trovanja. Veinu otrova, ako su u veoma niskim koncentracijama i ako djeluju kratkotrajno normalni homeostatski mehanizmi organizama sposobni su svladati, pa se otrov izluuje iz organizma ili detoksicira tako da ne dolazi do oteenja. Vie koncentracije ili dulja izvrgnutost otrovu mogu izazvati odreene reverzibilne fizioloke promjene, a posljedica toga su kratkotrajna naruavanja pojedinih funkcija organizama. Pri jo viim koncentracijama ili pri duljem trajanju trovanja dostie se kritina faza kad dolazi do trajnih oteenja organizma. Napokon, od veoma visokih koncentracija i od dugog trovanja organizam ugiba. U razdoblju od drugog svjetskog rata ekstenzivno se vre testovi akutne toksinosti. Cilj je tih testova da se odredi koncentracija spoja u testu ili razina faktora 8temperature, pH, tvrdoe vode, i dr.) koji izazivaju tetna djelovanja, na grupi testnih organizama u tijeku kratkotrajnog izvrgavanja trovanju. Test se postavlja tako da se grupe organizama odreene vrste izvrgavaju progresivno sve veim koncentracijama toksikanta i da se prati odreena reakcija koja se moe lako kvantificirati (reakcija tipa sve ili nita). Kako je smrt lako uoljiva i jasno definirana tetna reakcija, najee se vre akutni testovi toksinosti koji su ujedno testovi akutne smrtnosti. Prvenstvena je svrha tih testova da se procijeni koncentracija toksikanta u testu koja je letalna za 50% organizama odreene vrste unutar odreenog vremenskog razdoblja (obino 24, 48, 72 ili 96 sati). Ta koncentracija definira se kao srednja letalna koncentracija (LC50). Ovisno o trajanju trovanja razlikuje se npr. 24h-LC50, 96h-LC50 itd. upotreba LC50 za procjenu jakosti otrova je arbitrarna. U pojedinim sluajevima moe biti praktinije sluiti se vrijednou LC95 ili kojom drugom LC-vrijednou. Ipak, vrijednost LC50 upotrebljava se u veini testova jer za odreeni broj uzoraka ima manju varijancu (veu reproduktibilnost) nego bilo koja druga veliina. Premda se akutnim testovima letalne toksinosti mogu dobiti mnogi korisni podaci, osobito kad se ispituje djelovanje novih tvari i usporeuje osjetljivost razliitih vrsta, dolo se do spoznaje da je za potpunije razumijevanje toksikolokih uinaka potrebno vriti testove na razliitim razinama bioloke organizacije i ukljuiti testove kroninog i supkroninog trajanja. Ekoloki gledano, promijene oponaanja, naruena fiziologija ili izazvana sterilnost mogu imati isti krajnji uinak na populaciju kao i naglo ugibanje jedinaka.

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

Oitim vanjskim znakovima toksinosti (a to su gubitak apetita, gubitak ravnotee, promjena obojenosti ili smrt) gotovo uvijek prethode biokemijske i/ili morfoloke promijene u organizmu. Nae li se nain da se kvalitativno ili kvantitativno izmjere spomenute promijene, moe to esto pruiti rane znakove toksinosti i vrijedne podatke o mehanizmu trovanja. Testovi toksinosti se mogu svrstati u nekoliko grupa s obzirom na trajanje, na nain vrenja i na svrhu vrenja. a) prema trajanju razlikuju se testovi kratka trajanja (akutni testovi toksinosti), testovi srednjega trajanja (supkronini testovi toksinosti), testovi duga trajanja (kronini testovi toksinosti). Trajanja testa odreuju vrsta toksine tvari i testni organizam i obino je isto za razliite skupine organizama. Za organizme kratka ivotnog ciklusa, npr. za fitoplankton, uobiajeno trajanje eksperimenta moe obuhvatiti mnoge generacije. Stoga treba odrediti trajanje testa djelomino ili prema trajanju ivotnog ciklusa. b) prema nainu vrenja razlikuju se statini test, recirkulacijski test, polustatini test protoni test. c) prema svrsi (namjeni) vrenja razlikuju se test procjene kvalitete efluenata, test relativne osjetljivosti, test brzine rasta, test poredbene toksinosti, test biostimulacije, test bioakumulacije, itd. Pojedini istraivai modificiraju odreene procedure ovisno o svojim potrebama, interesima ili mogunostima laboratorija. Ali, da bi se rezultati dobiveni testovima toksinosti mogli usporeivati, nuno je voditi iste testne protokole.

16.1. Laboratorijski uvjeti

Za izvoenje akvatikih testova toksinosti treba imati dobro opremljen laboratorij da bi se osigurali adekvatni uvjeti za vrenje testova toksinosti prema standardnim protokolima.

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

16.1.1. Voda Potreban je adekvatan izvor slatke ili morske vode dobre kvalitete (koja nije zagaena). 16.1.2. Temperaturni uvjeti Kako toksinost spojeva varira ovisno o temperaturi nuno je omoguiti odravanje konstantnih temperaturnih prilika u laboratoriju. Temperatura u tijeku provoenja testa ne smije varirati vie od 1-2C. u veini sluajeva temperatura u laboratoriju via je nego ona u prirodi gdje su ivotinje sakupljene, pa to iziskuje sustav hlaenja. Konstantne temperaturne prilike mogu se odrati pomou air-condition-a, konstruiranjem malenih hladnih soba, upotrebom akvarija kojima se moe regulirati temperatura, ili hladnim kupkama. 16.1.3. Svjetlost Potrebe za svjetlou variraju ovisno o vrsti organizama. Fitoplnkton, naravno, iziskuje svjetlost da bi mogla tei fotosinteza. Pojedine ivotinje, npr. manji rakovi i ribe, iziskuju sasvim odreeni reim svjetla i tame, drugi, npr. mnogoetinai nemaju posebnih potreba za svjetlom. Ipak, veinom se nastoje osigurati svjetlosni uvjeti adekvatni onima u prirodi tj. normalno dnevno-noni ritam rasvjete. Ako laboratorij ima prozore, moda ak i nije potrebno ivotinjama osigurati umjetno svjetlo. Ako pak nema prozora, tada treba osigurati hladno, fluorescentno svjetlo. Reim svjetlotama treba kontrolirati elektrinim satnim mehanizmom i osigurati uvjet svjetla-tame kakvi su u prirodi na lokalitetu gdje je odreena vrsta sakupljena, osim ako ivotinje nemaju drugaije specifine potrebe. 16.1.4. Aeracija Za vrijeme aklimatizacije nuna je aeracija i opskrba ivotinja kisikom, za pojedine vrste i dok traje test. Jedna velika tlana pumpa pogodnija je nego vie malenih akvarijskih pumpica. Zrak pod tlakom moe se rasprivati sustavom PVC-cijevi s vlastitim kontrolnim ventilima. Ako se u cijevima javljaju kapljice ulja, potreban je ureaj za njihovo hvatanje (filtraciju).

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

16.2. Izbor vrste

Izbor testnih organizama u velikoj mjeri ovisi o tome to je svrha samog testa i o mogunostima laboratorija u kojem se test vri. Izbor vrste moe biti izvren s obzirom na: - stanite (pelagijal, epibentos, bentos), - trofiku razinu (primarni producent, herbivora, karnivora, detritofagi) - tip organizama (fitoplankton, kolutiavci, mekuci, lankonoci, ribe). Ipak ima vie injenica koje je potrebno uzeti u obzir pri izboru testne vrste: 1. Osjetljivost vrste prema toksinoj tvari ili faktorima koji se promatraju. Kako osjetljivost varira meu vrstama, treba uzeti vrste iroka raspona osjetljivosti kad god je mogue; 2. Geografsku rairenost vrste, brojnost i dostupnost u tijeku godine. Uglavnom treba uzeti vrste koje su iroko dostupne i brojne; 3. Ekoloku vanost vrste. Kad god je mogue, treba uzeti vrste karakteristine za ekosisteme u koje moe dospjeti dotina toksina tvar ili efluent. Izbor vrsta moe varirati od ekosistema do ekosistema i selekcija se esto osniva na specifinim prilikama stanita. Ako se na priliku procjenjuje potencijalan negativan uinak odreenog kemijskog spoja na hladne vodene tokove bit e odabrana vrsta npr. pastrva koja je karakteristian stanovnik takvih voda, a ako se procjenjuje utjecaj na toplije i sporije tokove, odabrat e se vrsta koja je karakteristina za takva stanita, npr. bucanj. Nema standardnih testnih vrsta koje bi se mogle uzeti za sve ekosisteme; 4. Ekonomsko ili rekreativno znaenje vrste; 5. Pogodnost vrste za rutinsko odravanje u laboratoriju ili za uzgoj u kulturi, tako da se njome mogu vriti i kronini testovi. Osobito je vano da bude dobro poznata biologija testne vrste jer se tada mnogo lake mogu tumaiti dobiveni podaci. Jo je vano i poznavanje ponaanja, hranidbenih navika, razmnoavanja i ivotnog ciklusa, rasprostranjenosti u istraivanom podruju i ekoloko znaenje odabrane vrste. Od toksikanata najee se ispituju hlapivi aromatski ugljikovodici, fenol, pentaklorofenolat, tenzidi, metali i dr. prati se mortalitet ivotinja, promjene njihova ponaanja, histopatoloke i fizioloke promjene njihova organizma.

16.3. Skupljanje
ivotinje je mogue skupiti iz prirodnih stanita, nabaviti od komercijalnih dobavljaa ili uzgajati u laboratorijskim kulturama. Za svaku seriju testova ivotinje

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

treba skupiti odjednom i ako je mogue na jednom mjestu. Na mjestu skupljanja treba zabiljeiti temperaturu vode, koliinu otopljenog kisika, pH, tvrdou, a ako je rije o morskim organizmima i salinitet. Treba sakupljati ivotinje priblino jednake veliine, tako da najvei primjerak ne bude 50% vei od najmanjega. To daje odreenu sigurnost da su ivotinje podjednake starosti ili razvojnoga stadija. Skupljanje, dopremu do laboratorija i rukovanje ivotinjama treba provoditi pomnjivo, tako da se ozljede ili fizioloki stres svedu na najmanju moguu mjeru.

16.4. Doprema do laboratorija

Posude za dopremu ivotinja trebaju biti okrugle ili eliptine, to spreava gomilanje ivotinja u uglovima ili ozljeivanje udaranjem o zid. Kad privremeni smjetaj i doprema traju dulje od 30 minuta, treba poduzeti i druge mjere da se ivotinjama prue optimalni uvjeti. Ponekad ih je potrebno zatititi od suneve svjetlosti, od ekstremne topline ili hladnoe, ili pak uvesti aeraciju radi odravanja potrebne koliine otopljenog kisika.

16.5. Dranje u laboratoriju

Poto se ivotinje dopreme u laboratorij, treba prenijeti zdrave primjerke u akvarije sa istom vodom primjerene temperature. Sve ozlijeene primjerke i one s eventualnim parazitima treba odbaciti. Ako 10-20% ivotinja ugine u roku od jednog ili dvaju dana nakon skupljanja, preostali se primjerci rabe u konanom testu toksinosti, ali oni mogu posluiti i u preliminarnom testu. ivotinje skupljene na prirodnim stanitima treba u laboratoriju drati najmanje sedam dana (razdoblje aklimatizacije) prije upotrebe u testu toksinosti i pri tome ih treba hraniti barem jednom u 24 sata.

16.7. Izvoenje testova

Izvoenje testova toksinosti moe se provoditi na planktonskim organizmima vodenim beskraljenjacima (mekuci, kolutiavci, rakovi, liinke kukaca, bodljikai) te ribama. Svaki test toksinost sastoji se od kontrole i pet test-koncentracija. Ako se rabi koje drugo otapalo osim vode, treba ukljuiti i dodatnu kontrolu s tim otapalom u onim koncentracijama u kojima ono u testu slui. Test je nuno izvoditi dva puta, ali je najbolje ako se izvre tri ponavljanja. 5

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

16.7.1. Preliminarni test Kad se izvode testovi s toksinim tvarima nepoznate toksinosti, gotovo uvijek je nuno provesti preliminarni test i odrediti koncentracije koje e se uzeti u izvoenju konanog testa toksinosti. Za preliminarni test postavi se niz koji ine kontrola i tri koncentracije, svaka sa po tri do pet ivotinja. Koncentracije se biraju u nizu tako da su logaritamski odijeljene s velikim razmakom vrijednosti (npr. 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 mg/L ili ppm). Ako je testirana tvar efluent, tada se uzimaju volumni postoci efluenta u testu (npr. 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100%). 16.7.2. Konani test Za odreivanje LC50 primjeren broj test-ivotinja treba izvrgnuti najmanje petorim koncentracijama zagaivala ili efluenta u geometrijskoj progresiji (tj. slijed koncentracija treba da bude takav da je omjer koncentracije prema prethodnoj uvijek jednak; npr. 0,62, 1,25, 2,5, 5, 10 ppm). Upotreba vie od pet koncentracija moe pruiti dodatne podatke i omoguiti ue izraunavanje granica sigurnosti oko srednje koncentracije, ali trud i trokove da se postave i te dodatne koncentracije treba usporediti sa stvarnom dobiti. Da bi se mogle izraunati prihvatljive granice sigurnosti za LC50 definitivni test treba zadovoljiti ove kriterije: 1. Svaka koncentracija testirane tvari ima biti barem 50% vea od idue vee koncentracije (npr. 3,75, 7,5, 15, 30, 60 ppm). 2. Treba ukljuiti koncentracije u kojima je manje od 35% test-ivotinja uginulo ili u kojima se pojavljuju uinci koji se promatraju, te koncentracije u kojima je vie od 65% ivotinja uginulo ili je na njima uoen toksini uinak. Test poinje dodavanjem odreene koliine tzv. stock-otopine ili efluenta vodi u test posudama. Otopina se zatim promijea, izmjere se potrebni fizikalni i kemijski parametri te se tek tada dodaju ivotinje. ivotinje treba staviti u posude jedan sat nakon dodavanja tvari koja se testira. Kad je mogue (tj. ako ima razraenih metoda i ako nije skupo), koncentraciju testnog spoja u otopinama trebalo bi mjeriti u svim posudama barem na poetku i na kraju testa kako bi se utvrdilo je li koncentracija konstantna. Idealno bi bilo mjeriti svaka 24 sata. Promjena, tj. smanjenje koncentracije ne bi smjelo biti vee od 10%. Obino se prakticira atomska apaorpcijska spektrometrija za metale i plinska kromatografija za organske spojeve. U svakom sluaju treba se poznavati spoj s kojim se radi i tek na osnovi toga odrediti i nain mjerenja koncentracije u pokusu i odabir test-vrste. Na primjer, ako je rije o veoma razgradivom spoju, njegova e se koncentracija u statinom testu brzo smanjiti, pa je bolje primijeniti polustatini test. Moe se dogoditi da koncentracija hlapivog ili brzo razgradivog spoja, ako se dulje izvrgava, ostane manja od 10%. U 96 satnom testu svakodnevno se biljei smrt organizama i to je glavni kriterij za odreivanje toksinosti u tom tipu testova. Potrebno je biljeiti znakove stresa ili

Ekologija i zatita okolia

Vjeba 16. Akvatiki testovi toksinosti

abnormalnog ponaanja, jer su to najee predznaci da e nastupiti smrt, a uz to su dodatni podaci pokusa. U svakom pokusu nuna je kontrola. Uvijek se mora postaviti kontrolan serija s istim brojem organizama, nuna su i ponavljanja za svaku pojedinu seriju. Ako se za testiranu toksinu tvar rabi kemijsko otapalo, potrebna je i dodatna kontrola koja sadrava to otapalo. Pokus treba ponoviti ako vie od 10% jedinaka u kontroli ugine za vrijeme testa. Broj uginulih jedinka se biljei u svakoj test-seriji i u svakom ponavljanju. Podaci o mortalitetu u 96 satnom testu slue za procjenu toksinosti odreenog spoja. Za interpretaciju podataka na raspolaganju su brojne statistike metode.

Erben R., Lajtner J., Akvatiki testovi toksinosti, Hrvatska vodoprivreda, br. 28, 1995., str. 30-32.