BIORREMEDIACIN IN VITRO DE UN SUELO CONTAMINADO CON

HIDROCARBURO UTILIZANDO BACTERIAS AUTCTONAS

Soto Gladys, Crdenas Carmen, Araujo Ismenia, Mndez Enida, Isea Daisy,
Delgado Jos. PDVSA, Universidad del Zulia. Centro de Investigaciones del Agua
- INPELUZ, Maracaibo - Venezuela.

ABSTRACT
The present study shows the behavior of a sample of isolated flora taken from
hydrocarbon contaminated soil which was capable of biodegrading. The different
fractions of crude at stake (a mixture of saturated oils, aromatics, resins and
asphalts). The test was carried out in a laboratory. The samples of soil were
collected in an area nearby a rubber tank farm, property of Lagoven, S.A.
Company, located on the Oriental Coast of Maracaibo Lake, Venezuela. Two kinds
of bacteria of the Bacillus family of microorganisms were selected which reached
their maximum growth during the isolation phase in the laboratory. The test lasted
a total of six months, bacterial counts being determined, as well as a
concentrations of complete chain hydrocarbons and fractions of saturated
hydrocarbons, aromatics hydrocarbons, and fractions of saturated hydrocarbons,
aromatics, resins and asphalts; denitrified. The results indicate that the isolated
samples disposed of a total of a 66 percent of the complete chain hydrocarbons
furthermore, a transformation of heavy crude fractions was observed to take place
Key Words: Bioremediation, Indigenous bacterias, Contaminated land,
Hidrocarbons.


RESUMEN
El presente estudio muestra el comportamiento de la flora microbiana aislada de
un suelo contaminado con hidrocarburo, la cual fue capaz de biodegradar las
distintas fracciones del crudo presente (saturados, aromticos, resinas y
asfltenos). El ensayo se llev a cabo a escala de laboratorio. Las muestras de
suelo se colectaron en un rea cercana al patio de tanque de Ul, perteneciente a
la empresa Lagoven, S.A, ubicado en la Costa oriental del Lago de Maracaibo. Se
seleccionaron dos cepas bacterianas del gnero Bacillus que alcanzaron el mayor
crecimiento durante el aislamiento en el laboratorio. La prueba tuvo una duracin
de seis meses, determinndose contajes bacterianos, as como concentracin de
hidrocarburos totales y fraccin de saturados, aromticos, resinas y asfltenos.
Los resultados indicaron que las cepas aisladas realizaron una remocin de 66
por ciento en los hidrocarburos totales. Adicionalmente se observ una
transformacin de las fracciones ms pesadas del crudo en fracciones ms
livianas.
Palabras Claves: Biorremediacin, Bacterias Autctonas, Suelo Contaminado,
Hidrocarburo.
INTRODUCCIN
Con la explotacin petrolera se han generado grandes cantidades de desechos
petrolizados. Los desechos ms comnmente producidos incluyen lodos
petrolizados, aguas de formacin y petrleo crudo. La prctica para disponer
estos desechos ha sido a travs de fosas a cielo abierto. La presencia de este tipo
de compuestos en los suelos ha ocasionado modificaciones que alteran su
composicin, afectando su calidad e imposibilitando su recuperacin natural. Sin
embargo, se han realizado muchos estudios para la recuperacin de suelos con
este tipo de contaminacin. Entre las modalidades de remediacin de suelos se
encuentra el uso de extractos y liofilizados bacterianos, los cuales transforman los
productos del petrleo en compuestos de fcil degradacin, devolviendo al suelo
su actividad bitica. Muchas han sido las metodologas desarrolladas para tratar
de resolver este gran problema, entre las cuales ha surgido la biotecnologa o bien
llamada biorremediacin. La biorremediacin es un proceso de descomposicin
de compuestos orgnicos, llevado a cabo por la accin de un determinado grupo
de microorganismos [1]. La aplicacin de tecnologas de biorremediacin ha ido
en ascenso en los ltimos aos, dicho proceso se ha utilizado para sanear aguas,
suelos, lodos, sedimentos y otros materiales contaminados con constituyentes
orgnicos [2,3]. En cuanto a su aplicacin en suelo, la misma ha sido aplicada en
suelos contaminados con hidrocarburos y sus derivados [4].
Existe gran variedad de bacterias que crecen en presencia de hidrocarburos,
cuando crecen en este medio las mismas producen polisacaridos y glicolipidos,
los cuales actuan como solventes de los hidrocarburos. Las enzimas responsables
de la degradacin de hidrocarburos son conocidas con el nombre de oxigenasas
debido a que introducen uno o ms atmos de oxgeno en el componente a
degradar [5,6].
Los hidrocarburos son considerados como sustancias qumicas biodegradables.
Cuando las bacterias crecen en presencia de hidrocarburos los mismos pueden
ser utilizados como fuente de energa y nutrientes a travs de procesos oxidativos.
La oxidacin de hidrocarburos se produce en forma secuencial, desde los
compuestos ms susceptibles (saturados, aromticos) hasta los ms resistentes
(resinas y asfaltenos) [7,8].
La Universidad del Zulia con el apoyo de la empresa Lagoven, S.A, Filial de
Petrleos de Venezuela, con el inters de recuperar reas impactadas con crudo,
ha promovido los trabajos enfocados hacia la recuperacin de estas reas
utilizando tratamientos biolgicos. Por lo cual, el objetivo del presente estudio, es
una evaluacin a escala de laboratorio del potencial degradador de las cepas
bacterianas autctonas aisladas, provenientes de un suelo contaminado con
crudo, para su posterior utilizacin en la biorremediacin de suelos.

PARTE EXPERIMENTAL
Aislamiento de las Cepas Bacterianas Autctonas
Para el estudio se utililizaron muestras de suelo contaminado con hidrocarburos,
provenientes de un rea de 10 Has. Aproximadamente, tomandose muestras en
cuatro puntos del rea. Se realizaron contajes en placas, a partir de stas se hizo
el aislamiento de las cepas bacterianas y la prueba de tincin de Gram [9]. Los
anlisis microbiolgicos se realizaron siguiendo la metodologa establecida en el
Estandar Mtodo [10].
Ensayo
Inculo
De las cepas bacterianas aisladas se escogieron las cinco cepas que presentaron
mayor crecimiento, determinado por turbidez [9]. Las cepas seleccionadas fueron
sembradas en caldo de Tripticasa de Soya a una concentracin del 10 %, se
incubaron a 37 1 C durante 5 das en agitacin a 100 rpm Posteriormente las
dos cepas que alcanzaron mayor crecimiento fueron selecionadas para la
segunda fase del ensayo y las mismas fueron cultivadas hasta alcanzar una
concentracin superior a 1 x 10
8
UFC/ml.
Anlisis de las Muestras
Se tomaron dos muestras de 14 Kg cada una de uno los puntos del rea
contaminada. Una de las muestras fue inoculada con el cultivo mixto (muestra
experimental) con las dos cepas bacterianas seleccionadas para el inculo,
mientras que la otra (muestra control) permaneci inalterada. Cada dos semanas
se tomaron 5 porciones de 10 g de cada cubeta y se le hizo diluciones seriadas
hasta 10
-6
para realizar el contaje por placa vertida (por triplicado). Del mismo
modo, una vez al mes se tomaron 5 porciones de 10 g por cada cubeta para
determinacin de hidrocarburos totales (HCT)y sus fracciones saturados,
aromticos, resinas y asfltenos (SARA). El ensayo se realiz durante un perodo
de seis (6) meses.
Anlisis Estadstico
El anlisis estadstico se fundament en un muestreo no probabilstico (muetra
selecionada). Se replic el ensayo utilizando una muestra de suelo control y una
muestra de suelo experimental, el tamao de la muestra utilizado en cada caso
fue de 35 observaciones, las cuales fueron procesadas mediante el procedimiento
PROG MEANS del sistema de Anlisis Estadstico (SAS), | 11|,
Una regresin lineal (modelo trigonomtrico de primer grado) fue ajustada
utilizando el procedimiento PROC REG, |11|, cuyo modelo viene dado por:
Polinomial Trigonomtrico:
$ sen cos y b b t b
t
b
t
= + +
|
\

|
.
|
+
|
\

|
.
|
0 1 2 3
2
12
2
12
t t


RESULTADOS Y DISCUSION
Aislamiento de las Cepas Bacterianas Autctonas.
Se aislaron catorce cepas bacterianas de las cuales se seleccionaron cinco cepas
sobre la base de su crecimiento. Las caractersticas de las cinco cepas se
resumen a continuacin en la Tabla 1. De las cinco cepas seleccionadas, despus
de cultivos y transferencias sucesivas, se seleccionaron las dos cepas bacterianas
que resultaron con mayor crecimiento, cepa 2.a y 2.6, ambos bacilos gram
positivos esporulados.

Tabla 1. Cepas Seleccionadas para el cultivo mixto.
CEPA CARACTERSTICAS

1.6
Bacilos cortos, Gram negativos. Formadores de colonias pequeas de
color grisceo a verdoso, circulares, bordes ondulados, elevadas,
brillantes y rugosas.

2.5
Bacilos Gram negativos. Formadores colonias pequeas de color
grisceo, circular, bordes ondulados, elevada, brillante y rugosa.

2.a
Bacilos Gram positivos. Generalmente en pares, esporulados, algunos
formando largas cadenas. Colonias de color blanco, borde dentado,
circular, plana, opaca y rugosa.
1.6.b Bacilos Gram positivos, un poco largos, no esporulados.
2.6 Bacilos Gram positivos esporulados, en pares y algunos formadores de
cadenas muy largas

Ensayo
Determinaciones Bacteriolgicas
Los resultados del ensayo se determinaron por el promedio de los contajes
obtenidos durante el tratamiento, y se representan en la Tabla 2.

Tabla 2.Promedios de los contajes en muestra control y muestra
experimental expresados en UFC/gr para cada tiempo de muestreo
Tiempo (Meses) Muestra Control Muestra Experimental
0 14x10
5
41x10
5

1 4,3x10
5
45x10
5

2 1,15x10
5
66,18x10
5

3 1,8x10
5
10,4x10
5

4 5,78x10
5
37,5x10
5

5 7,1x10
5
11,98x10
5

6 2,7x10
5
10,18x10
5


En la muestra experimental los valores de los contajes expresados en UFC/gr se
mantuvieron por encima a los determinados en la muestra control durante el
ensayo. Adems se detect que para el segundo mes del ensayo la muestra
experimental sufri un incremento del 38 %, con respecto al inculo inicial (Tabla
2). Adicionalmente, el crecimiento bacteriano fue evaluado a travs de varios
modelos de regresin como el modelo exponencial, logartmico,gamma, inverso,
parablico y el modelo peridico. De todos estos modelos considerados, se
observ que el que result con un mejor ajuste (R
2
) fue el modelo peridico. Little
et al.,1980 |12| establecieron un modelo peridico para la evaluacin del
crecimiento bacteriano en suelos, especficamente para el crecimiento de
variedades de trigo. Dicho modelo fue utilizado en esta investigacin a fin de
evaluar el crecimiento de las cepas en ambas muestra (experimental y control). La
Fig. 1 muestra el crecimiento bacteriano en la muestra control y su ajuste con el
modelo peridico. El modelo se ajust al crecimiento de la muestra control en un
88%.
5
5,2
5,4
5,6
5,8
6
6,2
6,4
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en Meses
C
o
n
t
a
j
e

B
a
c
t
e
r
i
a
n
o

(
L
o
g
)
Control
Prediccin

Figura 1. Crecimiento bacteriano en muestra control y su ajuste
con el modelo peridico

Se puede observar que en la muestra experimental (Fig. 2), igualmente se
determin un ajuste del modelo versus el crecimiento bacteriano, explicando slo
un 50% de la variabilidad del crecimiento, la cual se debi al factor tiempo,
mientras que el 50% restante se debi probablemente a otros factores (biticos y
abiticos) los cuales no fueron tomados en cuenta en esta investigacin.Sin
embargo, dicho modelo result ser el ms apropiado para la estimacin de las
cargas bacterianas del suelo en dichas muestras.
6
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7
0 2 4 6
Tiempo en Meses
C
o
n
t
a
j
e

B
a
c
t
e
r
i
a
n
o

(
L
o
g
)
Experimental
Prediccin

Figura 2. Crecimiento bacteriano en muestra experimental y su ajuste
con el modelo peridico

Determinaciones Fsico - Qumicas.
Los resultados del ensayo se determinaron por el promedio de los valores
obtenidos para los HCT y SARA en las muestras control y experimental, Fig. 3 .En
la muestra experimental se obtuvo valores de concentracin (mg/Kg) para los HCT
que disminuyeron a lo largo del perodo experimental resultando para el primer
mes 27%, y al cabo de seis meses 66%, mientras que los obtenidos para las
muestras control permanecieron muy similares durante toda la prueba, por lo que
la remocin en las muestras control resultaron muy insignificantes.

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en Meses
0
2000
4000
6000
8000
10000
H
C
T

(
m
g
/
K
g
)
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en Meses
M. Control M. Experimental

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
0
26,6
31,35
38,03
54,16 54,63
65,77
0
10
20
30
40
50
60
70
R
e
m
o
c
i

n

(
%
)
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
Tiempo en Meses

Figura 3. Concentracin de los HCT vs Figura 4: Remocin de HCT en la
tiempo en muestras control y experimental. muestra experimental

Algunos investigadores [13,14] han reportaron tasas de remocin para los
HCT del 80 al 95% al cabo de 30 das, en tratamientos de suelos contaminados
con hidrocarburos y sus derivados, controlndose igualmente los factores
abiticos para estimular la flora microbiana autctona presente en dichos suelos.
Entre estas investigaciones se encuentra la reportada por Mc Millen et al., 1992
[14], en la cual report una remocin de los HCT aproximadamente del 92 % con
la aplicacin de un compostaje en suelo contaminado con lodos petrolizados, al
cabo de un mes. Cabe recordar que para el caso particular de la presente
investigacin el suelo contaminado fue inoculado con la mezcla de dos cepas
bacterianas autctonas, adems no fueron controlados los factores
abiticos,debido a que se deseaba conocer solo el comportamiento de las cepas
autctonas. El estudio evidencia que ha pesar de no haberse controlado los
factores abiticos se obtuvo porcentajes de remocin significativos, hasta un 66
%, en la muestra experimental. En cuanto a la reduccin de las fracciones del
crudo, es conocido que los microorganismos por lo general oxidan rpidamente
los compuestos ms simples (con menos enlaces y ramificaciones) de los
hidrocarburos como las parafinas y los aromticos, mientras que aquellos
compuestos con las cadenas ms largas entre los cuales se encuentran los
sistemas aromticos, las ciclo parafinas, el bitumen y los asfaltos se consideran
los ms resistentes a la biodegradacin [15,16,17]. En las Tablas 3 y 4 se
presentan las determinaciones de los SARA expresados en concentracin
(mg/Kg) para las muestra control y la muestra experimental. Los valores de las
fracciones para la muestra experimental, van disminuyendo considerablemente a
lo largo de la prueba, mientras que para la muestra control, permanecieron muy
similares.
Tabla 3. Valores promedios de los componentes de los HCT para los
Controles
Tiempo Fracciones del SARA (mg/Kg)
(Meses) Satur. Arom. I Arom. II Resinas Asfaltenos
0 1021,53 620,07 620,07 2999,23 2029,05
1 963,55 582,52 575,46 3163,48 1966,30
2 999,96 544,56 464,15 3324,72 2116,96
3 864,26 520,56 425,32 2949,38 1941,90
4 972,33 556,90 579,48 3263,18 2007,12
5 1013,15 567,98 557,47 3296,39 2204,86
6 1002,88 592,57 573,77 3547,28 2121,83


Tabla 4. Valores promedios de los componentes de los HCT para la Muestras
Experimentales
Tiempo Fracciones del SARA (mg/Kg)
(Meses) Satur. Arom. I Arom. II Resinas Asfaltenos
0 1021,53 620,07 620,07 2999,23 2029,05
1 631,04 500,26 420,31 2063,89 1677,84
2 891,96 519,69 361,59 2034,96 1123,77
3 731,44 274,83 231,92 2150,95 1228,08
4 517,09 294,56 292,78 1571,25 729,99
5 427,77 239,30 251,65 1477,81 1007,67
6 462,30 226,35 185,34 1137,64 520,62

En las Figuras 5 y 6, se muestra la composicin del crudo representada por los
valores de sus fracciones (SARA) expresados en porcentaje p/p, para la muestra
control y muestra experimental respectivamente.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en meses
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n

d
e

H
C
T
,

%
Satur.
Arom. I
Arom. II
Resinas
Asfalteno

Figura 5. Transformacin en la composicin de las fracciones
de los HCT en la muestra experimental
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo en meses
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n

d
e

H
C
T
,

%
Satur.
Arom. I
Arom. II
Resinas
Asfalteno

Figura 6. Transformacin en la composicin de las fracciones
de los HCT en la muestra control
Puede observarse como en la muestra experimental, la proporcin de saturados y
resinas van incrementndose con respecto al tiempo, mientras que los asfaltenos
van disminuyendo. Dicho comportamiento pudiera deberse a la transformacin de
la fraccin ms pesada (asfaltenos), mayormente en saturados y resinas, y en
menor proporcin en aromticos. Este comportamiento puede apreciarse a partir
del segundo mes de la prueba en el caso de los asfaltenos, disminuyeron sus
valores en composicin de 29.38 % a 21.04 %, mientras que las resinas se
incrementaron de 36 % a 38 %, al igual que los compuestos saturados del 11% a
16% (Figura 5). Todo esto, evidencia la adaptacin de las cepas autctonas
aisladas en el suelo contaminado, ya que las mismas han sido sometidas por
largos perodos de exposicin a estos hidrocarburos, teniendo la capacidad de
transformar los compuestos ms pesados en componentes ms simples, los
cuales posteriormente son utilizados como fuentes de carbono. Para la muestra
control, (Figura 6), se observa como todas las fracciones (SARA) permanecen sin
cambios significativos con respecto al tiempo, se observa una muy ligera
transformacin en dichas fracciones, por lo que no se obtuvieron porcentajes de
remocin significativos para estas muestras.
En la Figura 7 son mostrados los valores de remocin obtenidos para los SARA
expresados en porcentaje para la muestra experimental, en los diferentes tiempos
del estudio, en la cual se obtienen porcentajes de remocin al sexto mes de 54%
en los Saturados, para los Aromticos I de 63%, para los Aromticos II de 70%,
en las Resinas de un 62%, y para los Asfaltenos de 74%.
0
1
2
3
4
5
6
Satur.
Arom. I
Arom. II
Resinas
Asfalteno
0
10
20
30
40
50
60
70
80
R
e
m
o
c
i

n

(
%
)
Tiempos en Meses
Componentes
de los
Hidrocarburo
Satur.
Arom. I
Arom. II
Resinas
Asfalteno

Figura 7. Remocin de las fracciones de los HCT en la muestra experimental

En la presente investigacin, el menor porcentaje de remocin obtenido al final de
los ensayos fue para los compuestos Saturados (54%) en la muestra
experimental, esto se debi a que inicialmente exista una elevada concentracin
de Saturados dentro del suelo contaminado que fueron removidos al ser utilizado
como fuente de carbono, y que luego se increment debido a las
transformaciones de las fracciones ms pesadas.

CONCLUSIONES
1.- En el presente estudio se pudo demostrar que con la utilizacin de cepas
bacterianas autctonas aisladas del gnero bacillus, se puede remover hasta un
66% de los hidrocarburos presentes.
2.- Con la utilizacin de las cepas autctonas aisladas, se presume que las
fracciones ms pesados del hidrocarburo (asfltenos) fueron transformadas en
compuestos ms livianos como resinas, aromticos y compuestos saturados.
3.- Se alcanzaron altos porcentajes de remocin sin efectuar un
acondicionamiento de los factores abiticos en el suelo (nutrientes, temperatura,
aireacin y humedad).
4.- La aplicacin de la tcnica de biorremediacin para estos suelos
contaminados, se puede aplicar en un tiempo corto de 6 meses, obtenindose
resultados significativos de remocin.
5.- El modelo peridico utilizado para evaluar el crecimiento bacteriano result el
ms adecuado para obtener el mejor ajuste (50%) en la estimacin de cargas
para la muestra experimental.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.- Price M.; Sambasivam y. 1993. Biorremediation of Petroleum Wastes
from the Refining of Lubricant. Enviromental Progress. 12 (1): 5-11.
2.- Hazadous Wastes Managet the University of Texas at Austin Course
Instructor Survey. College of Engineering. 1994.
3.- Infante Carmen; Gonzalez Otilio. 1995. Comparacion del proceso de
biodegradacion de lodos petrolizados en bioractores y en suelos. Visin
Tecnolgica, 3 (13): 29-33.
4.- Aiw Bourquin. 1989. Biorremediation of Hazardous Materials Control.
Enviromental Progress. 2 (5): 17-24.
5.- Perry Jerome J. 1979. Microbial Cooxidations Involving Hydrocarbons.
Microbiological Reviews, 43 (1): 48-55.
6.- Ordoez Victor. 1996. Biorremediacion de Residuos Petroleros.
Tecnificacion de un Proceso de Degradacion Natural. Petroleum, 91: 23-
25.
7.- Ledesma Anselmo. 1994. Biodegradacion de hidrocarburos por actividad
fungida (potencialidades de los hongos para su utilizacion en la
industria petrolera). Facultad Experimental de Ciencias, LUZ. Curso
Internacional de Biotecnologia del petroleo. Facultad de Ciencias, UCV.
8.- A. Jobson F. D. Cook, and D.W.S. 1972. Westlake.Microbial utilization of
Crude Oil. Appl. Microbiology, 23 (6): 1082-1089.
9.- Thomas j. Kerr. 1970. Applications in General Microbiology. A Laboratory
Manual. Second edition. University of Georgia Athens, Georgia. Hunter
Publishing Company. 44-67.
10.- APHA-AWWA-WPCF. 1992. Standard Methods for Examinations of
Water and Wasterwater, 18 th edition.
11.- S.A.S 1988. S.A.S..users guide.(release 603). S.A.S. inst. Inc, Cary, nc.
12.- Little y Hills F.. 1976. Metodos Estadisticos para la investigacion en la
Agricultura. Editorial Trias. Mexico, Capitulo 13,14.
13.- Price M.; Sambasivam Y. 1993. Biorremediation of Petroleum Wastes
from the Refining of Lubricant. Enviromental Progress. 12 (1): 5-11.
14.- Mc Millen Sara J., Kerr Jill, Gray Nancy, Findlay Margaret. 1992.
Composting of a production pit sludge. IGT Symposium on Gas, Oil and
Environmental Biotechnology. Chicago, Il.
15.- Aiw Bourquin. 1989. Biorremediation of Hazardous Materials Control.
Enviromental Progress. 2 (5): 17-24.
16.- Ledesma Anselmo. 1994. Biodegradacion de hidrocarburos por actividad
fungida (potencialidades de los hongos para su utilizacion en la
industria petrolera). Facultad Experimental de Ciencias, LUZ. Curso
Internacional de Biotecnologia del petroleo. Facultad de Ciencias, UCV.
17.- Montero Joseph Isabel, Bellota Mariano, Rodriguez Francisca. 1996.
Degradacin del Petrleo mediante bacterias marinas. Instituto de
Oceonologia Cuba, Ingenieria Qumica, 9:303-307.
BIORREMEDIACIN IN VITRO DE UN SUELO CONTAMINADO
CON HIDROCARBURO UTILIZANDO BACTERIAS AUTCTONAS

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