PrcticasdeFundamentosdeAlimentacinyNutricin.GradodeNutricinHumanay Diettica.

Curso20122013

METODO DEL RADICAL DPPH. 2,2-DIFENIL 1-PICRYLHYDRAZYL. DETERMINACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS DE MANZANA, BRCOLI Y ALCACHOFA Dra. Pilar Jimnez y Dr. Toms Girbs Nutricin y Bromatologa; Facultad de Medicina. Universidad de Valladolid 1.- Introduccin. Artculo de referencia Pharmacognosy Magazine. 2010 Jul-Sep; 6(23): 198203 Totalphenolic,anthocyanincontentsandantioxidantcapacityofselectedelderberry (SambucuscanadensisL.)accessions MustafaOzgen1,JosephCScheerens2,RNeilReese3,RaymondAMiller2
DepartmentofHorticulture,GaziosmanpasaUniversity,Tasliciftlik,Tokat60240,Turkey DepartmentofHorticultureandCropScience,TheOhioStateUniversity,OhioAgricultural ResearchandDevelopmentCenter,1680MadisonAvenue,Wooster,OH44691,USA 3 DepartmentofBiologyandMicrobiology,NPB249B,Box2140D,SouthDakotaState University,Brookings,SD57007,USA
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Abstract Fourteen purple-black American elderberry accessions (Sambucus canadensis L.) obtained from various sites in midwestern USA and then grown at a single Ohio production site in USA were analyzed for their total phenolic (TP) and total monomeric anthocyanin (TMA) contents and for their antioxidant capacity by the ferric reducing antioxidant power (FRAP) and DPPH radical scavenging assays. Total phenolic and anthocyanin contents were measured using the Folin-Ciocalteu reagent and the pH differential methods, respectively. Overall, the phytonutrient contents and antioxidant capacity of our elderberry accessions were similar to those typically reported for black raspberries, blackberries and other dark-fleshed small fruits. Variability among accessions was greatest for TMA content (CV 37.5%); individuals ranged nearly threefold from 1308 to 4004 g cy3-GE/g on a fresh weight basis. Variation among accessions was also evident for TP, FRAP and DPPH values (CV 14.4, 21.7 and 26.8%, respectively). TP and TMA values were very highly correlated (r = 0.93), although individuals differed in the estimated proportion of total phenolics attributable to anthocyanins. Both TP and TMA also highly correlated to antioxidant capacity values (r = 0.700.85). Within this limited study of 14 accessions, variability for phytonutrient content and antioxidant capacity suggested the employment of wild germplasm within an elderberry improvement program to incorporate an array of superior horticultural,
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post-harvest or processing traits into new or existing cultivars with superior phytonutrient profiles. Keywords: DPPH, ferric reducing antioxidant power, small fruits, phytonutrient, radical scavenging assay

2.- Materiales

Cubetas de 3 ml para espectrofotometra visible. Puntas desechables de pipeta automtica. Pipetas automticas de diferentes volmenes Malla de nylon Tubos de ensayo de plstico de 15 ml con tapn Probeta de 500 ml Probeta 100 ml Tubos de 50 ml Pipetas Pasteur Agita-tubos (vortex) Espectrofotmetro visible (medicin a 515 nm) Helios. Epsilon Thermo Scientif Batidora Moulinex Centrfuga Orto Alresa Digicen Balanza de laboratorio Colador Cazuelas Cronmetro Embudos 3.- Muestras Los extractos de manzana,brcoli y alcachofa deben guardarse en recipientes protegidos de la luz, y en fro (- 20 C)

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4.- Reactivos Solucin patrn de Trolox 1 mM en metanol. Aldrich Ref. 238813-1G DPPH. Radical 2, 2-Difenil-1-picrylhydrazyl 0,1 mM en metanol. Aldrich. Ref. D-9132 Metanol. Ref. Panreac. 131091.1211 Agua mQ. Millipore

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EXPERIMENTO 1. Curva patrn de Trolox 1 mM DPPH 0,1 mM A.- Mtodo experimental. Espectrofotometra. Recta patrn Importante: Al aadir el Trolox hacedlo con intervalos de 1 minuto utilizando el cronmetro 1. Se preparan los tubos de ensayo numerados. 2. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de metanol. 3. Se aade a cada tubo la cantidad de 2900 l de DPPH 0,1 mM excepto en el Blanco 1. 4. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de patrn de Trolox 1mM 5. Se agita cada tubo en el vortex. 6. A continuacin se mide la absorbancia de las muestras a 515 nm en el espectrofotmetro bajo la supervisin de un monitor. 7. Representar grficamente a travs de una recta de degradacin. Se representan las absorbancia de los 5 puntos (Blanco 2 y los patrones 1, 2, 3 y 4)

RECTA PATRN DPPPH 0,1 mM TROLOX 1 mM

Blanco 1

Blanco 2

Patrn 1

Patrn 2

Patrn 3

Patrn 4

Metanol 80%

3000 l

100 l

75 l

50 l

25 l

0 l

DPPH 0,1 mM

2900 l

2900 l

2900 l

2900 l

2900 l

Trolox 1 mM

25 l

50 l

75 l

100 l

t = 10 minutos

Abs. 515 nm

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EXPERIMENTO 2. Medida de la capacidad antioxidante total en muestras de alimentos. A.- Preparacin de los diferentes extractos. Muestra 1. Extracto de manzana. Se aaden 25 g de manzana pelada y troceada a 100 ml de agua y se pasa por la batidora. El extracto se filtra a travs de una malla de nylon. El lquido resultante se centrfuga durante 15 minutos a 4C de temperatura y a 3.500 r.p.m (guardar en fro) Muestra 2. Extracto de brcoli. Se parte de una pieza de brcoli de 50 g dividida en fragmentos pequeos. Hervir durante 5 minutos en 500 ml de agua. Pasar la muestra por un colador y recoger el extracto en una cazuela. Posteriormente el extracto se filtra a travs de una malla de nylon. El lquido resultante se centrfuga durante 20 minutos a 4C de temperatura y a 3.500 r.p.m (guardar en fro) Muestra 3. Extracto de alcachofa. Se parte de una pieza de alcachofa de 50 g dividida en fragmentos pequeos. Hervir durante 5 minutos en 500 ml de agua. Pasar la muestra por un colador y recoger el extracto en una cazuela. Posteriormente el extracto se filtra a travs de una malla de nylon. El lquido resultante se centrfuga durante 20 minutos a 4C de temperatura y a 3.500 r.p.m (guardar en fro)

Nota importante: equilibrar los tubos en balanza antes de meterlos a la centrfuga

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B.- Anlisis de las muestra. Espectrofotometra Importante: Al aadir las muestras de manzana, brcoli y alcachofa hacedlo con intervalos de 1 minuto utilizando el cronmetro. 1. Se preparan los tubos de ensayo numerados. 2. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de metanol. 3. Se aade a cada tubo la cantidad de 2900 l de DPPH 0,1 mM excepto en el Blanco 1. 4. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de muestra 5. Se agita cada tubo en el vortex. 6. A continuacin se mide la absorbancia de las muestra a 515 nm en el espectrofotmetro bajo la supervisin de un monitor.

1 METODO DPPH Blanco 1 Blanco 2 Manzana

2 Brcoli

3 Alcachofa

Metanol 80%

3000 l

100 l

0 l

0 l

90 l

DPPH 0,1 mM

2900 l

2900 l

2900 l

2900 l

Muestra

100 l

100 l

10 l

t = 10 minutos

Abs. 515 nm

Representaciones grficas en papel milimetrado. Clculos. Expresar los resultados en moles equivalentes de Trolox por gr de peso fresco
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Nota importante. Tirar los residuos en los contenedores habilitados al efecto

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