NAGY TBOCST KPESSG ANALITIKAI MDSZEREK

(High Throughput Analytical Methods)

MODERN GYGYSZERKUTATS
GNTECHNOLGIA VALIDLT CLMOLEKULA KIVLASZTS CLMOLEKULA ORIENTLT VEZETMOLEKULA (LEAD) KERESS HTS (HIGH THROUGHPUT SCREENING) AUTOMATIZLS (ROBOTTECHNIKA) MINIATRIZLS BIOINFORMATIKA

Gygyszerkutatsi paradigma
Fokuszlt knyvtrak Optimization process Term. hat.anyagok Primr assay Vezet molek.

Virtulis screening
Optimalizlt vez. molekulk Gygyszer

Random knytrak

Nagyhatkonysg tesztels Farmakofr (Validlt clmolekula)) modell

Hipotzis

Clzott knytrak

Ismert hatanyag molekulk 3D szerkezet

Racionlis hatanyag tervezs

QSAR, Neural Network Farmakofr modell

A FEW "CLASSIC" REFERENCES IN COMBINATORIAL CHEMISTRY

Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid," H.M. Geysen, R.H. Meloen, and S.J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 3998-4002 (1984). "General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificity of antigen-antibody interactions at the level of individual amino acids," R.A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 5131-5135 (1985). "General method for rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures", A. Furka, F. Sebestyen, M. Asgedom, and G. Dibo, Int. J. Peptide Protein Res., 37, 487-493 (1991). "A new type of synthetic peptide library for identifying ligand-binding activity", K.S. Lam, S.E. Salmon, E.M. Hersh, V.J. Hruby, W.M. Kazmierski, and R.J. Knapp, Nature, 354, 82-84 (1991). "Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery", R.A. Houghten, C. Pinilla, S.E. Blondelle, J.R. Appel, C.T. Dooley, and J.H. Cuervo, Nature, 354, 84-86 (1991). "Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis", S. Fodor, J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryer, A.T. Lu, and D. Solus, Science, 251, 767-773 (1991). "Diversomers: An approach to nonpeptide, non-oligomeric chemical diversity", S. Hobbs Dewitt, J.S. Kiely, C.J. Stankovic, M.C. Schroeder, D.M.R. Cody, and M.R. Pavia, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90, 6909-6913 (1993). "The combinatorial synthesis and chemical and biological evaluation of a 1,4benzodiazepine library", B.A. Bunin, M.J. Plunkett, and J.A. Ellman, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 91, 4708-4712 (1994).

VEGYLETTRAK ANALITIKAI VIZSGLATA

VEGYLETTRAK TPUSAI
TERMSZETES ANYAGOK KOMBINCIS KNYVTRAK
KEVERKEK (POOLS) EGYEDI ANYAGOK

ANALITIKAI PROBLMK
REAKCI KVETS (MONITOROZS) TISZTASG VIZSGLATA (KONCENTRCI MEGHATROZSA) SZERKEZET IGAZOLS

KVETELMNYEK (MILYEN AZ IDELIS MDSZER?)

EGYSZER GYORS RONCSOLSMENTES SZELEKTIV RZKENY OLCS

REAKCI KVETSI MDSZEREK

SZILRD FZIS SZINTZISEKNL (SPS)
LEHASITS MINDEN LPSBEN, S ELLENRZS SZOKSOS MDSZEREKKEL "ON-BEAD" ANALIZIS (GYANTN) :
MIKROANALIZIS (RONCSOLSOS, HALOGN KN STB. MRSRE, GRAVIMETRIA) KMIAI (PL. KAISER -NINHIDRINES, PIKRINSAVAS ) REAKCI NMR (MAGIC ANGLE SPINNING "MAS" TECHNIKA = SZILRD/GL FZIS NMR) UV SPEKTROSZKPIA (PL. A LEHASITOTT VDCSOPORT (FMOC= DIBENZOFULVN) KVANTITATIV MRSRE ) FT-IR, REFLEXIS MRS KVANTITATIV IR MIKROSZKPIA

IR MIKROSZKPIA
PROBLMK:
GYANTASZEMCSE MRET (60-110 mm) RZKENYSG SUGRMENET TORZULS (REFRAKCI A LEVEG-GYANTA-LEVEG HATRRTEGEN) GYENGE SZELEKTIVITS A HASONL FUNKCIS CSOPORTOKRA (PL. SAV, SZTER, ALDEHID)

MEGOLDS
IR MIKROSZKP (BRUKER) 0.1 mm-es HIGANY-KADMIUM-TELLURID DETEKTOR FOLYKONY NITROGN HTSSEL EGY GYANTASZEMCSE KBr PASZTILLRA HELYEZVE AZ IR SUGARAT A GYANTASZEMCSE KZEPRE FKUSZLJK DEUTERLT VDCSOPORTOK (BOC) ALKALMAZSA NVELI A SZELEKTIVITST DEUTERLT REAGENSEK KAPHATAK A C-D REZGS 2200-2300 cm-1 -NL ELKLNLTEN LTSZIK A SPEKTRUMBAN A POLISZTIROL GYANTA ELNYELST KI LEHET SZRNI (DIFFERENCIA SPEKTRUM)

HASZNLHATSG:
KVANTITATIV REAKCI KVETS GYANTRA KTTT PEPTIDEK KVANTITATIV MEGHATROZSA MRSI ID KB 1 PERC

MAS (MAGIC ANGLE SPINNING) NMR (TBBNYIRE H)

GL FZISBAN TRTNIK A FELVTEL AZ OLDSZER MOZGSA A POLIMERBEN KINYJTJA A LNCOKAT S IGY GYORSITJA A KTTT MOLEKULK MOZGST A MEGNVEKEDETT MOLEKULRIS MOBILITS KVETKEZTBEN A SZILRD ANYAG SPEKTRUMBAN NHA 20 Hz-ES VONALKISZLESEDST OKOZ KLCSNHATSOK (PL. HOMONUKLERIS DIPOLRIS ~) KITLAGOLDNAK, IGY A VONALKISZLESEDS CSKKEN. A KITLAGOLDS NEM TELJES A GYANTA ANIZOTRPIJA FOLYTN, A MARADK "DIPOLRIS" VONALSZLESEDS A MINTA "MGIKUS SZGBEN" TRTN, MEGFELEL SEBESSG (A NEM FORGATOTT MINTA VONALKISZLESEDSNL NAGYOBB FREKVENCIJ) FORGATSVAL ELIMINLHAT.

KEVERKEK ANALIZISE
MDSZEREK
VRK HPLC MS HPLC-MS GC-MS MS-MS (TANDEM)

ALAPVET PROBLMA:
20 J ANYAG ESETN MR KICSI AZ ESLY AZ ELVLASZTSRA EZRT INKBB AZT CLOZZK, HOGY A TERVEZETT ANYAGOK TBBSGE BENNE VAN AZ ELEGYBEN (ES-MS)

LTALBAN MINDEN REAKCILPST LEGALBB EGY EGYEDI MINTA VIZSGLATVAL KVETNEK. A REFERENCIA MINTT HAGYOMNYOS ESZKZKKEL VIZSGLJK.

AUTOMATIZLT SZINTETIKUS MDSZEREK

STANDARDIZLT ELJRSOK PARALLEL MDSZER

AUTOMATA PIPETTOROK
MIKROTITER LAPOK (96 MULTIWELL), CSVEK

AUTOMATIZLT ANALITIKAI MDSZEREK

AUTOMATA INJEKTOROK AUTOMATA FRAKCISZEDK (SPLITTEREK) SZMITGPES VEZRLS HPLC
RVIDEBB OSZLOPOK (5 CM) SPECILIS DETEKTOROK (UV, MS) ALACSONY OLDSZERIGNY GYORSABB FUTS (3 PERC) PREPARATIV ALKALMAZSI LEHETSGEK

TMEGSPEKTROMETRIA
A MOLEKULKAT (ATOMOKAT) TMEGK ALAPJN VLASZTJA EL ALKALMAS ELEMEK, MOLEKULK, MAKROMOLEKULK (PROTEINEK) ANALIZISRE A GRAVITCIS KLCSNHATS NEM ELEGEND AZ ELVLASZTSHOZ -> IONIZLNI KELL A RSZECSKKET, S IONFIZIKAI MDSZEREKET KELL ALKALMAZNI

MILYEN ADATOKAT SZOLGLTAT AZ MS?

PONTOS RSZECSKE TMEGET FRAGMENTCIS UJJLENYOMATOT (A VEGYLETRE JELLEMZ) AMI ADATBZISBL VISSZAKERESHET A KONTROLLLT FRAGMENTCI (MS-MS) J VEGYLETEK SZERKEZETNEK MEGHATROZSRA ALKALMAS EGYES FUNKCIS CSOPORTOK JELLEMZ CSCSOK FORMJBAN AZONOSITHATAK A SPEKTRUMBAN A RELATIV IZOTPELFORDULSOK INFORMLNAK A VEGYLETBEN LEV ELEMEKRL KEVERKEK VIZSGLHATAK KAPCSOLT TECHNIKKKAL (LC-MS, GC-MS) IGY ELKERLHET AZ ELZETES MINTA TISZTITS

TRTNETI ELZMNYEK
J.J. THOMSON (CAVENDISH LABORATORIES, 1897) A KUTATCSOPORT HT FIZIKAI ILL. KMIAI NOBEL DIJAT NYERT EL AZ ELS HASZNLHAT KERESKEDELMI MS 1948-BEN (MS-2 , MANCHESTER,UK) (KB 300 TMEGEGYSGIG MRT)

UGYANEKKOR FEDEZTK FEL A TOF (TIME-OFFLIGHT) MS TECHNIKT

1953. A QUADRUPOLE DETEKTORT SZABADALMAZTATTK

IONIZLSI MDSZEREK I.
FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB)
A SZILRD MINTA-MTRIX KEVERKET GYORS RSZECSKESUGRRAL TKZTETIK A MTRIX KISMOLEKULJ SZERVES ANYAG (GLICERIN VAGY 3NITROBENZIL-ALKOHOL)

A MTRIX SZEREPE A "FRISS FELLET" FENNTARTSA AZ TKZTETSHEZ

IGY N A SPEKTRLIS LETTARTAM S N AZ RZKENYSG A RSZECSKESUGR LTALBAN ARGON VAGY XENON, AZ ENERGIJA 4-10 KeV

AZ TKZSEK KVETKEZTBEN A FELLETBL POZITIVAN S NEGATIVAN TLTTT IONOK LPNEK KI

A KELETKEZETT IONOKAT ELVEZETVE A SPEKTROMTERREL ANALIZLJUK AZ ELVEZET ELEKTRD POLARITSA TKAPCSOLHAT, IGY LEHETSG VAN +FAB (POZITIV ION) ANALIZISRE (NEGATIV TLTS ESETN) ILL. -FAB ANALIZISRE IS. A FAB MS "SOFT" IONIZLSI TECHNIKA, IGY LEHETSG VAN KIS ILLKONYSG MINTK MRSRE A MINTK PSZEUDO-MOLEKULA IONOKAT SZOLGLTATNAK (M+H)+ ill. (M-H)- JELLEMZ FRAGMENS IONOK S NAGYOBB TMEG DIMEREK, ASSZOCITUMOK MELLETT

IONIZLSI MDSZEREK II.

ELEKTROSPRAY IONIZATION (ESI)
1930, CHAPMAN, 1960 DOLE, 1980 FENN S MANN EGYIK LEGELTERJEDTEBB MDSZER TLTTT CSEPPEKET LLITANAK EL PL. EGY KAPILLRISON KERESZTLPRSELVE AZ ANYAG OLDATT, MELYRE MEGFELEL FESZLTSGET KAPCSOLNAK

A FESZLTSG HATSRA AZONOS TLTS FINOM CSEPPEK KELETKEZNEK

AZ OLDSZER ELPROLOG, CSKKENTVE A RSZECSKEMRETET S NVELVE A FELLETI TLTSKONCENTRCIT EGY ADOTT CSEPPMRETNL (RALEIGH LIMIT) A MEGNVEKEDETT TLTS SZTROBBANTJA A CSEPPEKET,MELYBL APR KISEBB TLTS RSZEK KELETKEZNEK A FOLYAMAT ADDIG FOLYTATDIK, MIG "CSUPASZ" IONOK KELETKEZNEK A TLTSEK STATISZTIKUSAN ELOSZLANAK A MOLEKULA TLTHET RSZEI KZTT, MEGFELEL KRLMNYEK KZTT TBBSZRS TLTS IONOKAT HOZVA LTRE. SZRIT GZT VEZETVE A FOLYADKRAMBA ILL. NVELVE AZ RAMLSI SEBESSGET, N A TBBSZRS TLTS IONOK SZMA CSKKENTVE A KAPILLRISTMRT, CSKKENTVE AZ RAMLSI SEBESSGET = NANOSPRAY ("SOFT" IONIZATITON) NAGYOBB M/Z ARNYOKAT EREDMNYEZ, AMI A BIOANALIZISBEN IS HASZNLHAT

IONIZLSI MDSZEREK III.

MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI)
POLRIS, NAGYMOLEKULJ ANYAGOK VIZSGLATRA A LZERSUGRZST ABSZORBEL MTRIX ALKALMAZSVAL NAGY MOLEKULATMEG VEGYLETEK VIZSGLATA VLT LEHETV NAGYON KICSI MENNYISG MINTT IGNYEL AZ IONOK ASSZOCICIJA EZRT CSEKLYEBB MRTK A MINTA MOLEKULI EGYENLETESEN DISZPERGLVA VANNAK A MTRIXBAN (SZILRD OLDAT) A LZERREL GERJESZTETT MTRIXBL MINTA RSZECSKK LPNEK KI, MELYEKET SEMLEGES S GERJESZTETT MTRIXMOLEKULK VESZNEK KRL A MTRIXMOLEKULK ELPROLOGVA GERJESZTETT MINTA MOLEKULT HAGYNAK VISSZA TIPIKUSAN (M+X)+ IONOK KELETKEZNEK, AHOL X= H, Li, Na, K STB.) ILL. KISEBB MENNYISGBEN TBBSZRS TLTS RSZECSKK NEGATIV IONOK IS KELETKEZNEK DEPROTONLDSSAL (M)-

ANALIZTOROK I.
TIME-OF-FLIGHT (TOF)
A LEGEGYSZERBB ANALIZTOR NAGYON RZKENY GYAKORLATILAG NINCS TMEGHATR AZ ALKALMAZOTT POTENCILKLNBSG A FORRS S A DETEKTOR KZTT FELGYORSITJA AZ IONOKAT IDELIS ESETBEN MINDEN ION EGYSZERRE HAGYJA EL A FORRST, UGYANAKKORA ENERGIVAL. IGY A REPLSI ID CSAK A TMEGTL S A TLTSTL FGG. NAGY FELBONTS MRSHEZ VISZONYLAG HOSSZ CSBEN KEL MRNI

A TOF tmegspektrometris mrsek smja s alapegyenlete

TOF
mi = mass of analyte ion zi = charge on analyte ion E = extraction field ti = time-of-flight of ion ls = length of the source ld = length of the field-free drift region e = electronic charge (1.6022x10-19 C)

ANALIZTOROK II.
QUADRUPOLE ANALIZTOROK
KETT-KETT ELLENTTES TLTS RDON EGY SZINUSZOSAN VLTAKOZ RF TERET ALAKITANAK KI. AZ IONOK A RUDAK KZTT OSZCILLLNAK. MEGFELEL FESZLTSG-KLNBSG S FREKVENCIA ESETN CSAK EGYETLEN M/Z JUT EL A DETEKTORBA, A TBBI NAGYOBB AMPLITUDVAL OSZCILLLVA BELETKZIK VALAMELYIK RDBA.

AZ OSZCILCIS FREKVENCIA PRAKTIKUS OKOKBL 1-2 MHZ

A RUDAK MRETE SZABJA MEG A TMEGINTERVALLUMOT S A FELBONTST, AMI LTALBAN 4000 DA (A FELBONTS 2000)

KVADRUPL
Kett szemben lev rd +(U+Vcos(wt)) potencillal rendelkezik mig a msik kett -(U+Vcos(wt))-vel ahol U egy adott optimlis, stabil potencil s Vcos(wt) a rdifrekvencis tr (RF), melynek amplitdja V s frekvencija w. Amikor cos(wt) idben periodikusan vltozik,, az alkalmazott feszltsg az ellenttes rdprok kztt szinuszosan vlt6zik, de ellenttes polaritssal. A kvadrupl elrendezs kzponti tengelye mentn s az egyms melletti rudak kztt is az ered elektromos tr zrus. A transzverzlis irnyban egy ion bonyolult mdon oszcilllni fog a rudak kztt, m/z rtktl, a feszltsgtl, V-tl s a frekvencitl fggen. U, V s w alkalmas megvlasztsval csak egy adott m/z rtkkel rendelkez ionok fognak stabilan keresztl oszcilllni a rudak kztt, s eljutni a detektorig. Az sszes tbbi ion nagyobb amplitudval fog rendelkezni, s a rudak egyikbe tkzik. A gyakorlatban ez a frekvencia, w, ltalban 1-2 MHz. A rudak hossza s tmrje megszabja a tmegtartomnyt s a felbontst. Ezzel az analiztorral vizsglhat tmeg hatr 4000Da kb. 2000 krli felbontssal.

ANALIZTOROK III.
IONCSAPDA ANALIZTOR
GY MKDIK MINT A RSZECSKEGYORSITK A BEVEZETETT IONOKAT FKUSZLJK, KLNBZ FESZLTSGEKET ALKALMAZVA "CSAPDZZK" ILL. ELENGEDIK A KLNBZ TLTS S TMEG IONOKAT. MEGFELELEN KIALAKITOTT 3D POTENCIL TR AZ IONOKAT STABIL PLYKRA KNYSZERITI (FOGLYUL EJTI). A DETEKTLS SORN VLTOZTATJK AZ ELEKTRDRENDSZER POTENCILJT, S IGY INSTABILL VLNAK AZ IONPLYK, MELYNEK KVETKEZTBEN A CSAPDA ELERESZTI AZ IONOKAT A TENGELY IRNYBA. AZ ELERESZTETT IONOK A TMEG/TLTS NVEKV ARNYA SZERINTI SORRENDBEN REFKUSZLHATAK S DETEKTLHATAK .

FOURIER TRANSFORMCIS ION-CYCLOTRON REZONANCIA (FT-ICR) F = Lorentz force (observed by the incident ion) B0 = ICR magnetic field mi = mass of the ion zi = charge on the ion v = incident velocity of the ion wc = induced rotational (cyclotron) frequency

KVADRUPL IONCSAPDA ANALIZTOR

Vannak mg lehetsgek....