P r o c . N a t l . A c a d . S c i .

US A
V o l . 9 0 , p p . 1 1 8 2 5 - 1 1 8 2 9 , D e c e m b e r 1 9 9 3
G e n e t i c s
I n h e r i t e d a m p l i f i c a t i o n o f a n a c t i v e g e n e i n t h e c y t o c h r o m e P 4 5 0
CYP 2 D l o c u s a s a c a u s e o f u l t r a r a p i d m e t a b o l i s m o f d e b r i s o q u i n e
( g e n e a m p l i f i c a t l o n / s p a r t e i l n e / b u f u r a l o l / p h a r m a c o g e n e t l c s / d r u g t h e r a p y )
I N G E R J O H A N S S O N * , E V A L UN D Q V I S T * , L E I F B E R T I L S S O N t , M A R J A - L I I S A D A H L t , F O L KE S J 6 Q V I S T t ,
A N D M A G N US I N G E L M A N - S UN D B E R G *
* D e p a r t m e n t o f M e d i c a l B i o c h e m i s t r y a n d B i o p h y s i c s , Ka r o l i n s k a I n s t i t u t e t , 1 7 1 7 7 S t o c k h o l m , S w e d e n ; a n d t D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y S c i e n c e s a n d
T e c h n o l o g y , Ka r o l i n s k a I n s t i t u t e t , H u d d i n g e Un i v e r s i t y H o s p i t a l , 1 4 1 8 6 H u d d i n g e , S w e d e n
Co m m u n i c a t e d b y R o b e r t T . S c h i m k e , S e p t e m b e r 1 3 , 1 9 9 3
A B S T R A CT D e f i c i e n t h y d r o x y l a t i o n o f d e b r l s o q u i n e I s a n
a u t o s o m a l r e c e s s i v e t r a i t t h a t a f f e c t s =7 % o f t h e Ca u c a s i a n
p o p u l a t i o n . T h e s e i n d i v i d u a l s ( p o o r m e t a b o l i z e r s ) c a r r y d e f i -
c i e n t CYP 2 D 6 g e n e v a r i a n t s a n d h a v e a n i m p a i r e d m e t a b o l s m
o f s e v e r a l c o m m o n l y u s e d d r u g s . T h e o p p o s i t e p h e n o m e n o n
a l s o e x i s t s , a n d c e r t a i n i n d i v i d u a l s m e t a b o l i z e t h e d r u g s v e r y
r a p i d l y , r e s u l t i n g i n s u b t h e r a p e u t i c p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s a t
n o r m a l d o s e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e h a v e i n v e s t i g a t e d t h e
m o l e c u l a r g e n e t i c b a s i s f o r u l t r a r a p i d m e t a b o l i s m o f d e b r i s o -
q u i n e . R e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i s m a n a l y s i s o f
t h e CYP 2 D l o c u s i n t w o f a m i l i e s w i t h v e r y r a p i d m e t a b o l i s m o f
d e b r i s o q u i n e [ m e t a b o l i c r a t i o ( M R ) f o r d e b r i s o q u i n e = 0 . 0 1 -
0 . 1 1 r e v e a l e d t h e v a r i a n t CYP 2 D 6 g e n e CYP 2 D 6 L . E c o R I R F L P
a n d X b a I p u l s e d - f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n a l y s e s s h o w e d t h a t
t h i s g e n e h a d b e e n a m p l i f l e d 1 2 - f o l d i n t h r e e m e m b e r s ( f a t h e r
a n d h i s t w o c h i l d r e n ) o f o n e o f t h e f a m i l i e s , a n d t w o c o p i e s w e r e
p r e s e n t a m o n g m e m b e r s o f t h e o t h e r f a m i l y . T h e CYP 2 D 6 L
g e n e h a d a n o p e n r e a d i n g f r a m e a n d c a r r i e d t w o m u t a t i o n s
c a u s i n g a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s : o n e i n e x o n 6 , y i e l d i n g a n
A r g - 2 9 6
- -
Cy s e x c h a n g e a n d o n e i n e x o n 9 c a u s i n g S e r - 4 8 6
- -
T h r . T h e M R o f s u b j e c t s c a r r y i n g o n e c o p y o f t h e CYP 2 D 6 L
g e n e d i d n o t s i g n i c a n t i y d i f f e r f r o m t h a t o f t h o s e w i t h t h e
w i l d - y p e g e n e , i n d i c a t i n g t h a t t h e s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s w e r e
n o t o f i m p o r t a n c e f o r t h e c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f t h e g e n e
p r o d u c t . E x a m i n a t i o n o f t h e M R a m o n g s u b j e c t s c a r r y i n g
w i l d - t y p e CYP 2 D 6 , CYP 2 D 6 L , o r d e f i c i e n t a l l e l e s r e v e a l e d a
r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e n u m b e r o f a c t i v e g e n e s a n d M R . T h e
d a t a s h o w t h e p r i n c i p l e o f i n h e r i t e d a m p l i f i c a t i o n o f a n a c t i v e
g e n e . F u r t h e r m o r e , t h e f i n d i n g o f a s p e c i f i c h a p l o t y p e w i t h t w o
o r m o r e a c t i v e CYP 2 D 6 g e n e s a l l o w s g e n o t y p i n g f o r u l t r a r a p i d
d r u g m e t a b o l i z e r s . T h i s g e n o t y p i n g c o u l d b e o f p r e d i c t i v e v a l u e
f o r i n d i v i d u a l i z e d a n d m o r e e f f i c i e n t d r u g t h e r a p y .
G e n e a m p l i f i c a t i o n w a s f i r s t d e s c r i b e d i n 1 9 7 8 a s a m e c h a -
n i s m o f a c q u i r e d r e s i s t a n c e i n c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l s ( 1 ,
2 ) . S i n c e t h e n , m o s t e x a m p l e s o f g e n e a m p l i f i c a t i o n h a v e
b e e n r e l a t e d t o c a n c e r b i o l o g y , i n p a r t i c u l a r t o o n c o g e n e
a m p l i f i c a t i o n . T h e e x t e n t o f o n c o g e n e a m p l i f i c a t i o n a p p e a r s
t o b e h i g h e s t i n t h e m o s t m a l i g n a n t t u m o r s ( 3 , 4 ) . G e n e
a m p l i f i c a t i o n i s u s u a l l y r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h f r e q u e n c y o f
r e s i s t a n c e t o c e r t a i n d r u g s c o m m o n l y o b s e r v e d u p o n i n v i t r o
s e l e c t i o n i n m a n y m a m m a l i a n c e l l l i n e s ( 5 ) . H o w e v e r , D N A
a m p l i f i c a t i o n i s r a r e i n n o r m a l h u m a n c e l l s ( 6 ) , a n d t h u s o n l y
a l i m i t e d n u m b e r o f e x a m p l e s o f D N A a m p l i f i c a t i o n i n s u c h
c e l l s h a v e b e e n r e p o r t e d . S r i v a s t a v a e t a l . ( 7 ) f o u n d t h a t t h e
H a - r a s g e n e i s a m p l i f i e d 4 - f o l d i n c u l t u r e d n o r m a l h u m a n
f i b r o b l a s t s d u r i n g q u i e s c e n c e a n d c o n c l u d e d t h a t a s u c c e s -
s i o n o f c l o n e s w i t h a h i g h r a s c o p y n u m b e r o c c u r r e d d u r i n g
s e r i a l p a s s a g e . I n a d d i t i o n , T u r n e r e t a l . ( 8 ) s h o w e d t h a t
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g e
p a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "
i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U. S . C. 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .
i n a c t i v a t i o n o f t h e h y p o x a n t h i n e g u a n i n e p h o s p h o r y r i b o s y l -
t r a n s f e r a s e g e n e i n n o r m a l h u m a n l y m p h o c y t e s , s e l e c t e d
w i t h 6 - t h i o g u a n i n e , w a s a c c o m p a n i e d b y a m p l i f i c a t i o n .
I n h e r i t e d g e n e a m p l i f i c a t i o n h a s a p p a r e n t l y b e e n d e s c r i b e d
o n l y o n c e : P r o d y e t a l . ( 9 ) f o u n d t h a t p a r t s o f a p a r t i c u l a r
" s i l e n t " c h o l i n e e s t e r a s e g e n e w e r e h i g h l y a m p l i f i e d i n a
f a r m e r a n d h i s s o n , w h o w e r e m e m b e r s o f a f a m i l y e x p o s e d
t o o r g a n o p h o s p h o r o u s i n s e c t i c i d e s f o r s e v e r a l g e n e r a t i o n s .
T h e i n i t i a l a m p l i f i c a t i o n e v e n t p r o b a b l y o c c u r r e d a n d w a s
s e l e c t e d f o r d u r i n g s p e r m a t o g e n e s i s o r o o g e n e s i s a n d w a s
t h e n i n h e r i t e d .
Cy t o c h r o m e P 4 5 0 e n z y m e s a r e i n v o l v e d i n t h e o x i d a t i v e
m e t a b o l i s m o f b o t h e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s m o l e c u l e s .
A m o n g t h e p h y s i o l o g i c a l s u b s t r a t e s a r e s t e r o i d s , f a t t y a c i d s ,
p r o s t a g l a n d i n s , l e u k o t r i e n e s , a n d b i o g e n i c a m i n e s . E x o g e -
n o u s c o m p o u n d s i n c l u d e p l a n t t o x i n s , d r u g s , a n d c a r c i n o -
g e n s . I n m a m m a l s , > 1 0 0 i n d i v i d u a l g e n e s b e l o n g i n g t o 1 2
d i f f e r e n t g e n e f a m i l i e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d . D u r i n g e v o l u t i o n
p a r t i c u l a r P 4 5 0 s i n a g i v e n s p e c i e s m a y h a v e b e e n r e q u i r e d
f o r s u r v i v a l a n d t h e r e f o r e s e l e c t e d ( c f . r e f . 1 0 ) . M u t a n t a l l e l e s
o f s o m e P 4 5 0 g e n e s a p p e a r t o h a v e b e e n i n b r e d i n s o m e
p o p u l a t i o n s , c o n s t i t u t i n g t h e b a s i s f o r m a r k e d i n h e r i t e d v a r i -
a t i o n a n d i n t e r e t h n i c d i f f e r e n c e s i n d r u g m e t a b o l i s m ( 1 0 - 1 2 ) .
G e n e t i c d e f i c i e n c y o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 2 D 6 ( CYP 2 D 6 ) ,
w h i c h i s i n h e r i t e d a s a n a u t o s o m a l r e c e s s i v e t r a i t , c a u s e s t h e
d e b r i s o q u i n e / s p a r t e i n e p o l y m o r p h i s m . A p p r o x i m a t e l y 7 % o f
t h e Ca u c a s i a n p o p u l a t i o n a r e p o o r m e t a b o l i z e r s - i . e . , t h e y
a r e d e f i c i e n t i n t h e m e t a b o l i s m o f t h e a n t i h y p e r t e n s i v e p r o b e
d r u g d e b r i s o q u i n e a n d a b o u t 2 5 o t h e r c o m m o n l y p r e s c r i b e d
d r u g s s u c h a s n e u r o l e p t i c s , a n t i d e p r e s s a n t s , a n d l i p o p h i l i c
3 - a d r e n e r g i c b l o c k e r s ( 1 1 ) , w h e r e a s t h e r e m a i n i n g a r e c l a s -
s i f i e d a s e x t e n s i v e m e t a b o l i z e r s . T h e CYP 2 D 6 g e n e i s p a r t o f
a c l u s t e r o n c h r o m o s o m e 2 2 , w h i c h i n c l u d e s t w o t o t h r e e
r e l a t e d p s e u d o g e n e s ( 1 3 , 1 4 ) . F o u r a l l e l i c v a r i a n t s o f t h e
CYP 2 D 6 g e n e h a v e h i t h e r t o b e e n i d e n t i f i e d . T h e m o s t c o m -
m o n d e f e c t i v e a l l e l e s c o n s i s t o f v a r i a n t g e n e s w i t h p o i n t
m u t a t i o n s , h a v i n g a s p l i c i n g d e f e c t ( CYP 2 D 6 B ) , a f r a m e - s h i f t
m u t a t i o n ( CYP 2 D 6 A ) ( 1 5 ) , o r a d e l e t i o n o f t h e e n t i r e CYP 2 D 6
g e n e ( CYP 2 D 6 D ) ( 1 6 ) . A b o u t 9 5 % o f p o o r m e t a b o l i z e r s i n t h e
S w e d i s h p o p u l a t i o n c o u l d b e i d e n t i f i e d b y a l l e l e - s p e c i f i c P CR
a n a l y s i s o f g e n o m i c D N A d e s i g n e d f o r t h e s e v a r i a n t g e n e s
( 1 7 ) .
T h e r a t e o f CYP 2 D 6 - d e p e n d e n t h y d r o x y l a s e a c t i v i t y c a n
b e s t u d i e d i n v i v o b y m e a s u r i n g t h e r a t i o b e t w e e n t h e u r i n a r y
r e c o v e r y o f d e b r i s o q u i n e a n d t h a t o f 4 - h y d r o x y d e b r i s o q u i n e
a f t e r a s i n g l e o r a l d o s e o f d e b r i s o q u i n e . T h i s r a t i o ( d e b r i s o -
q u i n e m e t a b o l i c r a t i o , M R ) v a r i e s i n t h e p o p u l a t i o n f r o m
' - 0 . 0 1 t o > 1 0 0 , a n d t h e e x t e n s i v e m e t a b o l i z e r p h e n o t y p e i s
d e f i n e d a s p e o p l e h a v i n g M R < 1 2 . 6 ( 1 1 , 1 7 , 1 8 ) . A s m a l l
p e r c e n t a g e o f t h e S w e d i s h p o p u l a t i o n i s e x t r e m e l y r a p i d
m e t a b o l i z e r s o f d e b r i s o q u i n e w i t h M R s o f <0 . 2 ( 1 8 ) . Ca s e
A b b r e v i a t i o n s : M R , m e t a b o l i c r a t i o ; R F L P , r e s t r i c t i o n f r a g m e n t
l e n g t h p a t t e r n ; w t , w i l d t y p e .
1 1 8 2 5
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 )
r e p o r t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t s u c h i n d i v i d u a l s m a y r e q u i r e
v e r y h i g h d o s e s o f d r u g s m e t a b o l i z e d b y CYP 2 D 6 f o r a
t h e r a p e u t i c e f f e c t ( 1 9 , 2 0 ) . We h a v e i n v e s t i g a t e d t h e m o l e c -
u l a r g e n e t i c b a s i s f o r t h i s r a p i d d r u g m e t a b o l i s m . I n t h e
c u r r e n t r e p o r t w e p r e s e n t t h e o c c u r r e n c e o f a 1 2 - f o l d -
a m p l i f i e d a c t i v e v a r i a n t o f t h e CYP 2 D 6 g e n e i n a f a m i l y w i t h
M R s c 0 . 0 2 . T h e a m p l i f i e d v a r i a n t CYP 2 D 6 g e n e a p p e a r s t o
b e p r e s e n t i n t w o c o p i e s i n a n o t h e r f a m i l y w i t h v e r y l o w M R s
f o r d e b r i s o q u i n e .
M A T E R I A L S A N D M E T H O D S
S u b j e c t s f o r G e n e t i c A n a l y s i s . D N A s a m p l e s u s e d i n t h e
p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n w e r e o b t a i n e d f r o m p a r t i c i p a n t s o f a
p r e v i o u s s t u d y o f t h e p o l y m o r p h i c h y d r o x y l a t i o n o f d e b r i s o -
q u i n e a n d d e s m e t h y l i m i p r a m i n e ( 1 7 ) . D a t a r e g a r d i n g t h e i r
p h e n o t y p e f o r h y d r o x y l a t i o n o f b o t h d r u g s a s w e l l a s t h e i r
CYP 2 D 6 g e n o t y p e w i t h r e s p e c t t o X b a I r e s t r i c t i o n f r a g m e n t
l e n g t h p o l y m o r p h i s m ( R F L P ) a n d o c c u r r e n c e o f t h e d e f e c t i v e
CYP 2 D 6 A a n d CYP 2 D 6 B a l l e l e s h a v e b e e n r e p o r t e d ( 1 7 ) .
G e n o m i c R F L P A n a l y s i s . D N A w a s i s o l a t e d f r o m p e r i p h -
e r a l l e u k o c y t e s b y a g u a n i d i n i u m i s o t h i o c y a n a t e m e t h o d .
A f t e r d i g e s t i o n w i t h X b a I o r E c o R I , a g a r o s e e l e c t r o p h o r e s i s
w a s d o n e ( 0 . 5 5 % o r 0 . 8 5 % a g a r o s e ) a t 0 . 5 V / c m f o r 1 0 d a y s
o r 1 V / c m f o r 4 8 h r . S o u t h e r n b l o t t i n g w a s d o n e b y t h e u s e
o f G e n e S c r e e n P l u s f i l t e r s ( D u P o n t ) a n d h y b r i d i z a t i o n w i t h
[ a - 3 2 P ] d CT P - l a b e l e d CYP 2 D 6 c D N A , p r o v i d e d b y U. A .
M e y e r ( B i o z e n t r u m , B a s e l , S w i t z e r l a n d ) a n d F . J . G o n z a l e z
( N a t i o n a l Ca n c e r I n s t i t u t e , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h ,
B e t h e s d a , M D ) . A u t o r a d i o g r a m s w e r e a n a l y z e d w i t h a l a s e r
d e n s i t o m e t e r , P e r s o n a l D e n s i t o m e t e r w i t h I m a g e Q u a n t v e r -
s i o n 3 . 2 s o f t w a r e ( M o l e c u l a r D y n a m i c s ) .
P u l s e d F i e l d G e l E l e c t r o p h o r e s i s . V e r y h i g h - m o l e c u l a r -
w e i g h t D N A w a s i s o l a t e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d d e s c r i b e d
b y S a m b r o o k e t a l . ( 2 1 ) . A f t e r d i g e s t i o n w i t h X b a I , t h e D N A
f r a g n e n t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 . 2 % a g a r o s e i n 0 . 5 x T B E
( T r i s / b o r a t e / E D T A ) b u f f e r u s i n g a G e n e N a v i g a t o r s y s t e m
( P h a r m a c i a L KB ) . T h e g e l w a s r u n f o r 1 0 h r a t 3 0 0 V , a n d t h e
p u l s e t i m e w a s 1 0 s e c . A D N A c o n c a t e m e r s w e r e u s e d a s
m a r k e r s .
I s o l a t i o n o f t h e CYP 2 D G e n e s . L e u k o c y t e D N A w a s c o m -
p l e t e l y d i g e s t e d w i t h E c o R I a n d l i g a t e d t o A E M B L 4 a r m s f o r
c o n s t r u c t i o n o f a g e n e l i b r a r y . T h e D N A w a s p a c k a g e d u s i n g
G i g a p a c k I I G o l d ( S t r a t a g e n e ) . T h e D N A l i b r a r y w a s
s c r e e n e d w i t h 3 2 P - l a b e l e d CYP 2 D 6 c D N A . P h a g e s f r o m
p o s i t i v e c l o n e s w e r e a n a l y z e d f o r CYP 2 D 6 a l l e l e - s p e c i f i c
P CR a m p l i f i c a t i o n ( 2 2 ) a n d r e s t r i c t i o n m a p s a f t e r d i g e s t i o n
w i t h E c o R I , E c o R I p l u s B a m H I a n d E c o R I p l u s Kp n I ,
r e s p e c t i v e l y .
S e q u e n c i n g A n a l y s i s . P h a g e D N A w a s i s o l a t e d f r o m c l o n e s
c o r r e s p o n d i n g t o t h e CYP 2 D g e n e s a n d w a s d i g e s t e d w i t h
E c o R I a n d Kp n I . T h e 5 . 8 - k b f r a g m e n t s , c o n t a i n i n g a l l 9
e x o n s a n d 1 5 3 1 b p o f t h e u p s t r e a m r e g i o n , w e r e s u b c l o n e d
i n t o t h e p UC1 9 v e c t o r ( P h a r m a c i a ) . T h e E c o R I - Kp n I f r a g -
m e n t s w e r e p a r t l y s e q u e n c e d b y t h e d o u b l e - s t r a n d e d d i d e o x y -
n u c l e o t i d e c h a i n - t e r m i n a t i o n m e t h o d u s i n g S e q u e n a s e v e r -
s i o n 2 . 0 T 7 D N A p o l y m e r a s e ( Un i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l ) .
S y n t h e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 7 - m e r s ) , u n i v e r s a l p r i m e r s ,
a n d r e v e r s e p r i m e r s w e r e u s e d .
P CR - B a s e d A l l e l e - S p e c i f i c A n a l y s i s . C YP 2 D 6 A a n d
CYP 2 D 6 B w e r e a n a l y z e d a s d e s c r i b e d ( 1 7 , 2 2 ) . M u t a t i o n s i n
b o t h e x o n 1 ( C1 8 8
- )
T ) a n d e x o n 9 ( G 4 2 a C) , w h i c h c a u s e
a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s a n d a r e p r e s e n t i n a c t i v e CYP 2 D 6
a l l e l e s a m o n g t h e Ch i n e s e p o p u l a t i o n , w e r e d e t e r m i n e d b y
a l l e l e - s p e c i f i c P CR a m p l i f i c a t i o n a n d s u b s e q u e n t a n a l y s i s o f
m u t a t i o n s u s i n g p r i m e r s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( I . J . , Q . Y.
Yu e , L . B . , F . S . , M . I . - S . , u n p u b l i s h e d w o r k ) . I n a d d i t i o n , a n
a l t e r n a t i v e p r i m e r l O B , 5 ' - G T G G T G G G G CA T CCT CA G G -
3 ' , w a s u s e d f o r a m p l i f i c a t i o n o f a l l e l i c CYP 2 D 6 D N A
c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e b e t w e e n b p 3 0 2 a n d 3 3 3 i n i n t r o n 1 ,
w h i c h i s i d e n t i c a l t o t h e p s e u d o g e n e CYP 2 D 7 P ( c f . r e f . 2 3 ) .
A m u t a t i o n ( C2 9 3 8
- -
T ) i n e x o n 6 w a s a n a l y z e d b y a l l e l e -
s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n o f e x o n s 5 a n d 6 ( 2 2 ) , f o l l o w e d b y
s p e c i f i c a m p l i f i c a t i o n u s i n g p r i m e r 1 9 , 5 ' - G CCA CCA CT A T -
G CG - 3 ' f o r t h e w t g e n e a n d p r i m e r 2 0 , 5 ' - G CCA CCA CT A T -
G CA - 3 ' f o r t h e m u t a n t v a r i a n t .
R E S UL T S
A n a l y s i s o f t h e CYP 2 D L o c u s f r o m Ul t r a r a p i d M e t a b o i e r s o f
D e b r i s o q u i n e . A m o n g t h e p a r t i c i p a n t s o f a p r e v i o u s s t u d y o f
t h e p o l y m o r p h i c m e t a b o l i s m o f d e s m e t h y l i m i p r a m i n e ( 1 7 ) , w e
i d e n t i f i e d f i v e s u b j e c t s b e l o n g i n g t o t w o d i f f e r e n t f a m i l i e s ( I
a n d I I ) , w i t h M R s f o r d e b r i s o q u i n e o f <0 . 1 ( T a b l e 1 ) . G e n o m i c
D N A f r o m f a m i l y I w a s s u b j e c t e d t o X b a I R F L P . T h e t w o
s o n s w e r e h e t e r o z y g o u s w i t h a X b a I 4 2 / 2 9 - k b g e n o t y p e ,
w h e r e a s t h e m o t h e r h a d o n e 4 2 - k b a n d o n e 1 1 . 5 - k b h a p l o t y p e
( t h e l a t t e r n o t v i s i b l e i n F i g . 1 A ) . A 1 1 . 5 - k b f r a g m e n t i n d i c a t e s
d e l e t i o n o f t h e a c t i v e CYP 2 D 6 g e n e ( CYP 2 D 6 D ) ( 1 6 ) , a 2 9 - k b
f r a g m e n t i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f t h e n o r m a l l o c u s w i t h t w o
p s e u d o g e n e s ( CYP 2 D 8 P a n d CYP 2 D 7 P ) a n d o n e c o p y o f t h e
CYP 2 D 6 g e n e ( 1 3 ) , w h e r e a s a 4 2 - k b f r a g n e n t s u g g e s t s a g e n e
i n s e r t i o n . E c o R I R F L P o f g e n o m i c D N A f r o m f a m i l y I r e -
v e a l e d t h e p r e s e n c e o f f o u r D N A f r a g m e n t s o f 1 5 . 1 - , 1 2 . 1 - ,
9 . 4 - , a n d 8 . 8 - k b s i z e ( F i g . 1 B ) , i n d i c a t i v e o f t h e p r e s e n c e o f
f o u r g e n e s i n t h e l o c u s . T h e 1 5 . 1 - a n d 8 . 8 - k b f r a g m e n t s
c o r r e s p o n d t o t h e p s e u d o g e n e s CYP 2 D 7 P a n d CYP 2 D 8 P ,
r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s t h e E c o R I 9 . 4 - k b f i a g m e n t c o r r e s p o n d s
t o t h e CYP 2 D 6 g e n e ( 2 3 ) . I t c a n b e c o n c l u d e d t h a t t h e 9 . 4 - k b
f r a g m e n t d o e s n o t r e p r e s e n t e i t h e r t h e CYP 2 D 6 A o r CYP 2 D 6 B
d e f e c t i v e v a r i a n t s , b e c a u s e P CR a n a l y s i s o f g e n o m i c D N A
w a s n e g a t i v e f o r t h e s e m u t a t i o n s ( T a b l e 1 ) . T h e 1 2 . 1 - k b
T a b l e 1 . CYP 2 D 6 g e n o t y p e a n d p h e n o t y p e o f f a m i l i e s I a n d I I
A l l e l e - X b a I
D e b r i s o q u i n e s p e c i f i c P CR f i a g m e n t s ,
M R a n a l y s i s * k b E c o R I f r a g m e n t s , k b
F a m i l y I
F a t h e r 0 . 5 2 w t / L 2 9 / 2 9 1 5 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
M o t h e r 0 . 1 2 L I - 4 2 / 1 1 . 5 1 5 . 1 , 1 3 . 0 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
S o n 1 0 . 0 7 L / w t 4 2 / 2 9 1 5 . 1 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
S o n 2 0 . 0 5 L / w t 4 2 / 2 9 1 5 . 1 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
F a m i l y I I
F a t h e r 0 . 0 2 L I B 1 7 5 / 4 4 1 5 . 1 , 1 3 . 7 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
M o t h e r 1 0 2 B / B 2 9 / 2 9 1 5 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
D a u g h t e r 0 . 0 2 L I B 1 7 5 / 2 9 1 5 . 1 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
S o n 0 . 0 1 L I B 1 7 5 / 2 9 1 5 . 1 , 1 2 . 1 , 9 . 4 , 8 . 8
P h e n o t y p e d a t a a r e f r o m D a h l e t a l . ( 1 7 ) .
* P CR a n a l y s i s w a s d e s i g n e d f o r a n a l y s i s o f w t CYP 2 D 6 , t h e a c t i v e v a r i a n t CYP 2 D 6 L , a n d t h e d e f e c t i v e
a l l e l e s CYP 2 D 6 A ( A ) a n d CYP 2 D 6 B ( B ) ( c o m p a r e w i t h T a b l e 2 ) .
1 1 8 2 6 G e n e t i c s : J o h a n s s o n e t a l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 1 1 8 2 7
E
I - t -=t
U. . - . - .
c
L L
t U
f ( j I t ( )
r
: .
. .
w r
: : :
- s s 8
- -
w . .
B
= E
C\C\( N e t
N C
k b
W
1 5 . 1 -
1 3 . 7 - -
*
1 3 . . .
1 2 . 1
U-
U-
( N
( N
8 . 8 w S
C
. , - ~ t a )
I ~ t CN
I k b
1 5 . 1 -
1 3 . 7 - 4 -
1 2 . 1 -
) uL L E
9 . 4
8 . 8
-
Wj
D
k b
2 3 4 -
1 9 4 -
1 4 6 -
9 7 -
4 9
-
2 9 -
S F D
F I G . 1 . X b a I a n d E c o R I R F L P a n a l y s i s o f t h e CYP 2 D l o c u s o f g e n o m i c D N A f r o m f a m i l i e s I a n d I I . ( A ) X b a I R F L P o f g e n o m i c D N A f r o m
f a m i l y ( F a m ) I a n d f a m i l y I I i n c o m p a r i s o n w i t h Ch i n e s e s u b j e c t s c a r r y i n g t h e X b a I 4 2 - a n d 4 4 - k b h a p l o t y p e s . T h e m o t h e r ( M ) o f f a m i l y I i s
o f t h e X b a I 4 2 / 1 1 . 5 - k b h a p l o t y p e . Un d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d , t h e 1 1 . 5 - k b f r a g m e n t i s n o t v i s i b l e o n t h e g e l . T h e a l l e l i c X b a I f r a g m e n t s f r o m
f a m i l y I I , f a t h e r ( F ) , s o n ( S ) , a n d d a u g h t e r ( D ) a r e t o o l o n g f o r a c c u r a t e s i z e d e t e r m i n a t i o n b e c a u s e o f f r a g m e n t a t i o n . ( B ) E c o R I R F L P o f f a m i l y
I , s o n ( S ) , m o t h e r ( M ) , a n d f a t h e r ( F ) i n c o m p a r i s o n w i t h s a m p l e s o b t a i n e d f r o m s u b j e c t s c a r r y i n g t h e X b a 1 4 2 - a n d 4 4 - k b h a p l o t y p e s . T h e E c o R I
f r a g m e n t s d e s c r i b e d ( 2 3 ) c o r r e s p o n d t o CYP 2 D 7 A P ( 1 5 . 1 k b ) , CYP 2 D 7 B P ( 1 3 . 7 k b ) , w t CYP 2 D 6 o r CYP 2 D 6 B ( 9 . 4 k b ) , a n d CYP 2 D 8 P ( 8 . 8 k b ) .
T h e 1 3 - k b f r a g m e n t o r i g i n a t e s f r o m t h e X b a I 1 1 . 5 a l l e l e , l a c k i n g t h e e n t i r e CYP 2 D 6 g e n e , w h e r e a s t h e 1 2 . 1 - k b f i a g m e n t o r i g i n a t e s f r o m t h e
CYP 2 D 6 L g e n e ( s e e t e x t ) . ( C) E c o R I R F L P o f D N A f r o m f a m i l y I I c o m p a r e d w i t h D N A f r o m s u b j e c t s w i t h X b a I 4 4 - , 4 2 - , a n d 2 9 - k b h a p l o t y p e s .
T h e m o t h e r , h o m o z y g o u s f o r t h e CYP 2 D 6 B a l l e l e , l a c k s t h e 1 3 . 7 - a n d 1 2 . 1 - k b f r a g m e n t s . T h e 1 2 . 1 - k b f i a g m e n t , c o r r e s p o n d i n g t o t h e CYP 2 D 6 L
g e n e , i s p r e s e n t a t a n i n t e n s i t y s i m i l a r t o t h a t o f t h e p s e u d o g e n e s i n t h e X b a I 4 2 / 2 9 i n d i v i d u a l b u t i s m u c h s t r o n g e r i n t h e s a m p l e s f r o m t h e
s o n ( S ) , f a t h e r ( F ) , a n d d a u g h t e r ( D ) o f f a m i l y I I . T h e 1 3 . 7 - k b b a n d f r o m t h e f a t h e r c o r r e s p o n d s t o t h e p s e u d o g e n e CYP 2 D 7 B P . ( D ) P u l s e d - f i e l d
g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f g e n o m i c D N A f r o m t h e s o n ( S ) , d a u g h t e r ( D ) , a n d f a t h e r ( F ) o f f a m i l y I I a f t e r d i g e s t i o n w i t h X b a I . A s e v i d e n t , f r a g m e n t s
o f 1 7 5 , 2 9 , a n d 4 4 k b , r e s p e c t i v e l y , c o u l d b e i d e n t i f i e d . T h e 1 7 5 - k b f r a g m e n t c o r r e s p o n d s t o 1 2 c o p i e s o f t h e CYP 2 D 6 L g e n e , o n e a d d i t i o n a l
CYP 2 D 6 g e n e , p r o b a b l y o f t h e CYP 2 D 6 L t y p e , a n d t h e CYP 2 D 7 P g e n e p r e s e n t b e t w e e n t h e X b a I r e s t r i c t i o n s i t e s ( c o m p a r e t e x t a n d r e f . 2 3 ) .
T h e D N A f r o m t h e d a u g h t e r , p r e p a r e d b y t h e g u a n i d i n i u m i s o t h i o c y a n a t e m e t h o d , h a s b e e n p a r t i a l l y d e g r a d e d .
f r a g m e n t r e p r e s e n t s a v a r i a n t o f t h e CYP 2 D 6 g e n e n o t d e -
s c r i b e d e a r l i e r a n d w a s f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d ( s e e b e l o w ) .
A m o n g m e m b e r s o f f a m i l y I I , t h e f a t h e r , s o n , a n d d a u g h t e r
e x h i b i t e d u r i n a r y d e b r i s o q u i n e / 4 - O H - d e b r i s o q u i n e r a t i o s o f
O 0 . 0 2 ( T a b l e 1 ) ( 1 7 ) . X b a I R F L P a n a l y s i s ( F i g . 1 A ) s h o w e d
t h e p r e s e n c e o f D N A f r a g m e n t s w i t h l e n g t h s o f > 6 5 k b f r o m
a l l t h r e e i n d i v i d u a l s . I n a d d i t i o n , X b a I f r a g m e n t s o f 4 4 - k b
( f a t h e r ) a n d 2 9 - k b l e n g t h ( s o n a n d d a u g h t e r ) w e r e s e e n .
A l l e l e - s p e c i f i c P CR a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t a l l t h r e e w e r e
h e t e r o z y g o u s w i t h o n e d e f e c t i v e a l l e l e e a c h ( CYP 2 D 6 B )
( T a b l e 1 ) . E c o R I R F L P a n a l y s i s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t h e
1 2 . 1 - k b f r a g m e n t i n a l l t h r e e i n d i v i d u a l s ( F i g . 1 C) b u t w i t h a
v e r y h i g h i n t e n s i t y c o m p a r e d w i t h t h e f r a g m e n t s c o r r e s p o n d -
i n g t o t h e CYP 2 D 6 , CYP 2 D 7 P , a n d CYP 2 D 8 P g e n e s . T o
a n a l y z e t h e n u m b e r o f g e n e c o p i e s r e p r e s e n t e d b y t h e 1 2 . 1 - k b
f r a g m e n t , E c o R I - d i g e s t e d D N A s a m p l e s ( 0 . 2 5 - 5 p g ) w e r e
s u b j e c t e d t o q u a n t i t a t i v e S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s , u s i n g t h e
CYP 2 D 6 b a n d ( 9 . 4 k b ) a s i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e n u m b e r o f
g e n e c o p i e s t h u s d e t e r m i n e d w a s =1 2 ( f a t h e r , 1 4 ; s o n , 1 1 ; a n d
d a u g h t e r , 1 2 ) .
T h e l e n g t h o f t h e X b a I f r a g m e n t f o u n d f r o m t h e s e i n d i -
v i d u a l s w a s f u r t h e r d e t e r m i n e d b y p u l s e d f i e l d g e l e l e c t r o -
p h o r e s i s o f h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t D N A . F i g . 1 D s h o w s t h a t
t h e l e n g t h w a s " 1 7 5 k b i n t h e g e n o m i c D N A o b t a i n e d f r o m
b o t h t h e f a t h e r a n d h i s t w o c h i l d r e n . T h i s l e n g t h c o r r e s p o n d s
t o 1 2 e x t r a c o p i e s o f t h e CYP 2 D g e n e , o n e n o r m a l CYP 2 D 6
g e n e , a n d t h e p s e u d o g e n e CYP 2 D 7 P .
Ch a r a c t e r i z a t i o n a n d S e q u e n c e A n a l y s i s o f t h e A m p l i f i e d
G e n e . T h e CYP 2 D g e n e w i t h i n t h e 1 2 . 1 - k b E c o R l f r a g m e n t
w a s c h a r a c t e r i z e d . A g e n o m i c l i b r a r y w a s c o n s t r u c t e d f r o m
t h e s o n o f f a m i l y I I . T h e p h a g e
D N A f r o m 1 0 CYP 2 D 6 -
p o s i t i v e c l o n e s w a s d i g e s t e d w i t h E c o R l , a n d t h e l e n g t h o f t h e
i n s e r t e d D N A w a s d e t e r m i n e d . A l l i s o l a t e d c l o n e s e x h i b i t e d
t h e 1 2 . 1 - k b D N A i n s e r t a n d , t h u s , r e p r e s e n t e d t h e a m p l i f i e d
g e n e a n d , i n a d d i t i o n , w e r e p o s i t i v e f o r CYP 2 D 6 , a s d e t e r -
m i n e d b y CYP 2 D 6 - s p e c i f i c P CR a m p l i f i c a t i o n ( c f . r e f . 2 2 ) .
T h e 1 2 . 1 - k b f r a g m e n t w a s d i g e s t e d w i t h E c o R I p l u s B a m H I ,
a n d t h e l e n g t h o f t h e f r a g m e n t s t h a t h y b r i d i z e d t o CYP 2 D 6
c D N A w e r e 3 . 2 , 2 . 2 , a n d 1 . 9 k b . S i m i l a r a n a l y s i s w i t h E c o R I
p l u s Kp n I y i e l d e d a 5 . 8 - k b f r a g m e n t . T h i s f r a g m e n t a t i o n
p a t t e r n i s i n c o n s i s t e n t w i t h t h o s e o f t h e p s e u d o g e n e s
CYP 2 D 7 P , CYP 2 D 7 A P , CYP 2 D 7 B P , a n d CYP 2 D 8 P b u t i s
i d e n t i c a l t o t h a t d e s c r i b e d f o r CYP 2 D 6 B ( 2 3 ) a n d t h e a c t i v e
Ch i n e s e v a r i a n t CYP 2 D 6 Ch 1 ( I . J . , Q . Y. Yu e , L . B . , F . S . ,
M . I . - S . , u n p u b l i s h e d w o r k ) , w h i c h b o t h c o n t a i n a n e x t r a
B a m H I c l e a v a g e s i t e i n i n t r o n 1 .
T h e n i n e e x o n s o f t h e a m p l i f i e d CYP 2 D g e n e w e r e s e -
q u e n c e d . I n c o m p a r i s o n t o w t CYP 2 D 6 , t h r e e m u t a t i o n s w e r e
f o u n d ( T a b l e 2 ) . T w o c a u s e d a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s : o n e i n
e x o n 6 , A r g - 2 9 6
- *
Cy s , a n d o n e i n e x o n 9 , S e r - 4 8 6 - ) T h r .
T h e g e n e w a s t e r m e d CYP 2 D 6 L . T h e i n t r o n s w e r e o n l y
p a r t i a l l y s e q u e n c e d . H o w e v e r , i n i n t r o n 1 , t h e s e q u e n c e
b e t w e e n G 3 0 2 a n d A 3 3 3 w a s i d e n t i c a l t o t h a t o f t h e p s e u d o g e n e
CYP 2 D 7 P , i n d i c a t i n g t h e o c c u r r e n c e o f a g e n e c o n v e r s i o n
e v e n t .
D i s t r i b u t i o n o f t h e CYP 2 D 6 L G e n e A m o n g S w e d e s . T h e
d i s t r i b u t i o n o f t h e CYP 2 D 6 L a l l e l e a m o n g e f f i c i e n t m e t a b o -
l i z e r s h o m o z y g o u s f o r t h e X b a I 2 9 - k b h a p l o t y p e , l a c k i n g
t h e
- A a n d - B m u t a t i o n s ( n
=
7 1 ) ( 1 7 ) w a s d e t e r m i n e d b y a n a l y s i s
o f ( i ) t h e C1 8 8
- -
T ( P r o - 3 4
- -
S e r ) m u t a t i o n f o u n d a m o n g
Ch i n e s e a l l e l e s ( I . J . , Q . Y. Yu e , L . B . , F . S . , M . I . - S . , u n p u b -
l i s h e d w o r k ) , ( i i ) t h e g e n e c o n v e r s i o n o f t h e f r a g m e n t
G " 2 -
A
> 6 5 I <b -
4 4 1 <b -
4 2 1 <b -
2 9 k b -
G e n e t i c s : J o h a n s s o n e t a l .
" l l , I l a w
. . .
. - , i l - , I I I &
- 1 . : : :
.P R
r .
. W,
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 )
T a b l e 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n d e b r i s o q u i n e M R a n d n u m b e r o f w t CYP 2 D 6 o r CYP 2 D 6 L a l l e l e s a m o n g e f f i c i e n t
m e t a b o l i z e r s h o m o z y g o u s f o r t h e X b a I 2 9 - k b h a p l o t y p e
A l l e l e M u t a t i o n
F r e q u e n c y , * E x o n B a s e A m i n o a c i d D e b r i s o q u i n e M R ,
T y p e % n o . s u b s t i t u t i o n e x c h a n g e G e n o t y p e m e d i a n ( n )
w t 5 5 . 6 w t / w t 0 . 3 6 ( 2 1 )
L 3 4 . 7 3 G 1 7 2 6 - . C N o n e L / w t 0 . 4 3 ( 3 4 )
6 C2 9 3 8
-
T A r g - 2 9 6 Cy s L / L 0 . 4 2 ( 5 )
9 G 4 2 6 8 - C S e r - 4 8 6 T h r
T h e s u b j e c t s h a v e b e e n p r e v i o u s l y p h e n o t y p e d ( 1 7 ) .
* A 4 J e l e f r e q u e n c y i s b a s e d o n r e s u l t s o b t a i n e d f r o m u n r e l a t e d i n d i v i d u a l s o n l y ( n
=
3 6 ) a n d i n c l u d e s a c o m p a r i s o n w i t h
s u b j e c t s c a r r y i n g CYP 2 D 6 J a n d CYP 2 D 6 Ch a l l e l e s ( I . J . , Q . Y. Yu e , L . B . , F . S . , a n d M . I . - S . , u n p u b l i s h e d w o r k ) .
A 3 3 3 i n i n t r o n 1 f r o m CYP 2 D 7 P , ( i i i ) t h e C2 9 3 8 - - T ( A r g - 2 9 6
- -
Cy s ) , a n d ( i v ) t h e G 4 2 6 8 - C ( S e r - 4 8 6 - a T h r ) m u t a t i o n s .
T h e m e d i a n M R d i d n o t d i f f e r b e t w e e n s u b j e c t s h o m o z y g o u s
f o r t h e w t a l l e l e , h e t e r o z y g o u s i n d i v i d u a l s ( L / w t ) o r h o m o z y -
g o u s f o r t h e - L a l l e l e ( T a b l e 2 ) , i n d i c a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f
a n e n z y m e w i t h s i m i l a r c a t a l y t i c p r o p e r t i e s i n a l l t h r e e c a s e s .
A i l e l i c CYP 2 D 6 G e n e s i n I n d i v i d u a l s o f t h e X b a I 4 2 - k b
H a p l o t y p e . A g e n o m i c A E M B L 4 l i b r a r y w a s c o n s t r u c t e d
f r o m t h e m o t h e r o f f a m i l y I ( a s d e s c r i b e d f o r f a m i l y I I ) . T e n
CYP 2 D 6 c D N A - p o s i t i v e p l a q u e s w e r e a n a l y z e d b y CYP 2 D 6 -
s p e c i f i c P CR a m p l i f i c a t i o n . S e v e n w e r e p o s i t i v e f o r CYP 2 D 6 ,
a n d p h a g e D N A s w e r e i s o l a t e d . A l l y i e l d e d a 1 2 . 1 - k b f r a g -
m e n t a f t e r d i g e s t i o n w i t h E c o R I . R e s t r i c t i o n c l e a v a g e w i t h
B a m H I y i e l d e d f r a g m e n t s o f 3 . 2 , 2 . 2 , a n d 1 . 9 k b . T h e c l o n e s
w e r e p o s i t i v e f o r b o t h t h e C2 9 3 8 - - T a n d G 4 2 "
- -
C m u t a t i o n s
b u t w e r e n e g a t i v e f o r t h e C1 8 8
- -
T m u t a t i o n . T h i s r e s u l t
i n d i c a t e s t h e i r i d e n t i t y w i t h t h e CYP 2 D 6 L g e n e a m p l i f i e d i n
f a m i l y I I .
T h e g e n o m i c D N A f r o m t h e m o t h e r o f f a m i l y I , w h o s e X b a
I 1 1 . 5 / 4 2 - k b h a p l o t y p e i n d i c a t e s a CYP 2 D 6 d e l e t i o n i n o n e
a l l e l e , w a s p o s i t i v e f o r b o t h t h e C2 9 3 8
- -
T a n d G 4 2 6 8 - C
m u t a t i o n s b u t w e r e n e g a t i v e f o r t h e - A , - B , a n d C1 8 8 - + T
m u t a t i o n s . T h e d a t a t h u s s u g g e s t t h a t t h e l o c u s i s c o m p o s e d
o f CYP 2 D 8 P ( E c o R I 8 . 8 k b ) , CYP 2 D 7 P ( E c o R I 1 5 . 1 k b ) , a n d
t w o CYP 2 D 6 L g e n e s y i e l d i n g E c o R I f r a g m e n t s o f 9 . 4 k b
( CYP 2 D 6 L , ) a n d 1 2 . 1 k b ( CYP 2 D 6 L 2 ) ( s e e F i g s . 1 B a n d 2 ) .
T h e p r e s e n c e o f t w o a c t i v e CYP 2 D 6 L g e n e s i s a l s o s u p p o r t e d
b y t h e m o t h e r ' s l o w M R f o r d e b r i s o q u i n e .
D e b r i s o q u i n e M R A m o n g S u b j e c t s w i t h D i f f e r e n t N u m b e r s
o f A c t i v e CYP 2 D 6 G e n e s . N o d i f f e r e n c e i n M R w a s f o u n d
b e t w e e n i n d i v i d u a l s w i t h t h e X b a I 2 9 - k b h a p l o t y p e c a r r y i n g
e i t h e r t h e w t CYP 2 D 6 o r t h e CYP 2 D 6 L a l l e l e ( c o m p a r e w i t h
a b o v e ) . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e l o w M R a m o n g t h e
m e m b e r s o f f a m i l i e s I a n d I I i s m a i n l y c a u s e d b y t h e p r e s e n c e
o f s e v e r a l a c t i v e g e n e s e x p r e s s e d i n d i v i d u a l l y a t a s i m i l a r
l e v e l . A c c o r d i n g l y , w e e x a m i n e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n
M R a n d t h e n u m b e r o f a c t i v e g e n e s a m o n g a l l g e n o t y p e d a n d
p h e n o t y p e d S w e d i s h i n d i v i d u a l s ( c o m p a r e r e f . 1 7 ) h a v i n g t h e
d e f e c t i v e a l l e l e s , w t CYP 2 D 6 a n d / o r CYP 2 D 6 L a l l e l e s . A s
s h o w n i n F i g . 3 , a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e p a r a m e t e r s w a s
o b s e r v e d f o r u p t o t h r e e a c t i v e g e n e s . F o r t h e a m p l i f i e d
a l l e l e , t h e M R w a s 4 - f o l d l o w e r t h a n t h a t o f t h e a l l e l e s w i t h
t h r e e g e n e s , w h i c h i s s m a l l e r t h a n t h e p r o p o r t i o n a l d i f f e r e n c e
i n t h e n u m b e r o f g e n e s . T h i s d i f f e r e n c e i s p r o b a b l y t h e r e s u l t
o f l a c k o f s u b s t r a t e s a t u r a t i o n o f t h e e n z y m e b e c a u s e t h e
a m o u n t o f s u b s t r a t e r e m a i n i n g i s i n s i g n i f i c a n t ( 1 / 1 0 0 t h o f t h e
p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n ) . A n o t h e r f a c t o r t o c o n s i d e r i s t h e
d i f f i c u l t y o f a c c u r a t e l y d e t e r m i n i n g M R v a l u e s 5 0 . 0 1 , a s t h e
d e b r i s o q u i n e c o n c e n t r a t i o n i n s u c h s a m p l e s i s e x t r e m e l y l o w .
D I S CUS S I O N
O u r r e s u l t s d e m o n s t r a t e a n i n h e r i t e d 1 2 - f o l d a m p l i f i c a t i o n o f
t h e a c t i v e CYP 2 D 6 L g e n e i n a f a m i l y ( I I ) , w h o s e m e m b e r s
e x h i b i t t h e l o w e s t d e s c r i b e d M R s f o r d e b r i s o q u i n e a m o n g
1 0 1 1 S w e d e s ( 1 8 ) . T h e m o t h e r i s a p o o r m e t a b o l i z e r , M R
=
1 0 2 , w i t h b o t h a l l e l e s d e f i c i e n t w i t h r e s p e c t t o f u n c t i o n a l
CYP 2 D 6 g e n e s . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s a d o m i n a n t i n h e r i t a n c e
o f t h e a m p l i f i e d g e n e f r o m t h e f a t h e r t o b o t h c h i l d r e n . T h e
s a m e t y p e o f g e n e ( CYP 2 D 6 L ) a p p e a r s t o b e p r e s e n t i n t w o
c o p i e s i n t h e o t h e r f a m i l y ( I ) , w h o s e m e m b e r s a l s o e x h i b i t
v e r y r a p i d m e t a b o l i s m f o r d e b r i s o q u i n e . T h i s r e s u l t m i g h t
s u g g e s t t h e p r e s e n c e o f a s e q u e n c e i n t h e f l a n k i n g r e g i o n s o f
t h i s p a r t i c u l a r g e n e t h a t f a c i l i t a t e s d u p l i c a t i o n a n d / o r a m p l i -
f i c a t i o n . CYP 2 D 6 L w a s a l s o f o u n d a m o n g i n d i v i d u a l s o f t h e
X b a I 2 9 - k b h a p l o t y p e w h o h a v e o n l y o n e a c t i v e g e n e . I t s
A
E E E E E
I 8 . 8 > *
1 5 . 1 - 1 2 . 1 - > 9 . 4
-
- 5 + P - E
f
w 6 L
+
8 P 7 P L 2 L
x x < 4 2 k b > x
T o t a l l y 1 2 2 D 6 L 2
B
E E E E E E E E
| <8 . 8 > <- 1 5 . 1 - > <1 2 . 1 <1 2 . 1 <1 2 . 1 - <- + 9 . 4 o
8 P
I P
6 2 6 2 6 L L L
t t 1
x < 1 7 5 k b > x
F I G . 2 . S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f t h e CYP 2 D l o c u s i n i n d i v i d u a l s o f t h e X b a I 4 2 - k b ( A )
a n d 1 7 5 - k b ( B ) h a p l o t y p e s . E a n d X r e p r e s e n t c l e a v a g e
s i t e s w i t h E c o R I a n d X b a I , r e s p e c t i v e l y . R e l a t i v e p o s i t i o n s o f t h e g e n e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d
b y
c o n s t r u c t i o n o f r e s t r i c t i o n
e n z y m e m a p s ( E . L . ,
u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . F o r f u r t h e r e x p l a n a t i o n s , s e e t e x t . 8 P , CYP 2 D 8 P ; 7 P , CYP 2 D 7 P ; 6 L 2 , CYP 2 D 6 L 2 ; 6 L 1 , CYP 2 D 6 L I .
1 1 8 2 8 G e n e t i c s : J o h a n s s o n e t a l .
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 9 0 ( 1 9 9 3 ) 1 1 8 2 9
m e t a b o l i z e d b y CYP 2 D 6 a t n o r m a l l y p r e s c r i b e d d o s e s . We
h a v e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d t w o c a s e s i n w h i c h d o s e s o f
n o r t r i p t y l i n e a n d c l o m i p r a m i n e 3 - t o 4 - f o l d h i g h e r t h a n n o r -
m a l w e r e r e q u i r e d t o a c h i e v e t h e r a p e u t i c c o n c e n t r a t i o n s
( 1 9 ,
2 0 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e m a i n a c t i v e m e t a b o l i t e o f
n o r t r i p t y l i n e w a s 3 - f o l d h i g h e r t h a n n o r m a l i n o n e o f t h e s e
s u b j e c t s ( 1 9 ) , i m p l i c a t i n g a n e s s e n t i a l r o l e o f t h e CYP 2 D 6
g e n o t y p e f o r t h e a c t i v a t i o n o f c e r t a i n d r u g s . We h a v e r e -
c e n t l y f o u n d t h a t t h e s e t w o i n d i v i d u a l s e x h i b i t t h e X b a I
4 2 - k b h a p l o t y p e ( 2 0 ) , w h i c h a c c o r d i n g t o o u r p r e s e n t f i n d i n g s
i s i n d i c a t i v e o f t w o a c t i v e CYP 2 D 6 L g e n e s . I n t h e c a s e o f t h e
CYP 2 D 6 L g e n e b e i n g a m p l i f i e d 1 2 - f o l d , t h e p r o b l e m o f
r e a c h i n g t h e r a p e u t i c d o s e s w i l l b e f u r t h e r a c c e n t u a t e d .
0 1 2 3 4 5 1 0 1 5
F u n c t i o n a l CYP 2 D 6 g e n e s , n o .
F I G . 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n n u m b e r o f a c t i v e CYP 2 D 6 g e n e s
a n d M R f o r d e b r i s o q u i n e . A l l p h e n o t y p e d s u b j e c t s ( 1 7 ) c a r r y i n g t h e
w t CYP 2 D 6 , CYP 2 D 6 L , CYP 2 D 6 A , CYP 2 D 6 B , o r CYP 2 D 6 D a l l e l e s
o r c o m b i n a t i o n s t h e r e o f w e r e c o n s i d e r e d . N u m b e r o f i n d i v i d u a l s i s
i n d i c a t e d w i t h i n p a r e n t h e s e s . T h e S D o f t h e d e b r i s o q u i n e M R f o r
s u b j e c t s w i t h t h r e e g e n e s i s t o o s m a l l f o r v i s u a l i z a t i o n .
p r e s e n c e d i d n o t i n f l u e n c e t h e M R , i n d i c a t i n g t h e e x p r e s s i o n
o f a n e n z y m e w i t h s i m i l a r c a t a l y t i c a c t i v i t y i n b o t h c a s e s . T h e
c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e n u m b e r o f a c t i v e w t CYP 2 D 6 o r
CYP 2 D 6 L g e n e s a n d t h e M R i n d i c a t e s t h a t t h e c a u s e o f
i n c r e a s e d m e t a b o l i c c a p a c i t y a m o n g i n d i v i d u a l s c a r r y i n g
m u l t i p l e g e n e c o p i e s i s r e s t r i c t e d t o t h e a m o u n t o f e n z y m e
e x p r e s s e d .
T h e i n h e r i t e d a m p l i f i c a t i o n o f t h e CYP 2 D 6 L g e n e d e -
s c r i b e d h e r e i s , i n m a n y a s p e c t s , d i f f e r e n t f r o m t h e p r e v i -
o u s l y r e p o r t e d c a s e , i n w h i c h a 1 0 0 - f o l d a m p l i f i c a t i o n o f a n
a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e g e n e c o d i n g f o r s e r u m b u t y r y l c h o l i n e s t -
e r a s e w a s s h o w n ( 9 ) : ( i ) I n t h e p r e s e n t c a s e , t h e e n t i r e g e n e
h a d a p p a r e n t l y b e e n a m p l i f i e d , a s i n d i c a t e d b y t h e s a m e s i z e
o f t h e CYP 2 D 6 - h y b r i d i z i n g E c o R I f r a g m e n t ( 1 2 . 1 k b ) o b -
t a i n e d f r o m b o t h f a m i l y I a n d f a m i l y I I ( F i g . 1 ) . F o r t h e
b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e g e n e , t h e c e n t r a l p a r t o f t h e g e n e w a s
a m p l i f i e d m o r e e x t e n s i v e l y t h a n t h e e x t e r n a l r e g i o n s . T h i s
f i n d i n g i s c o n s i s t e n t w i t h t h e " o n i o n s k i n " m o d e l d e s c r i b e d
f o r s e v e r a l a m p l i f i c a t i o n u n i t s , s e r v i n g a s a n e a r l y i n t e r m e -
d i a t e i n t h e a m p l i f i c a t i o n p r o c e s s ( 3 , 2 4 ) . T h u s , d i f f e r e n t
m e c h a n i s m s o f a m p l i f i c a t i o n a p p e a r t o o p e r a t e i n e a c h o f t h e
t w o c a s e s . ( i i ) F u r t h e r m o r e , o n a n e n z y m a t i c l e v e l , t h e
s u b j e c t s c a r r y i n g t h e a m p l i f i e d b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e g e n e
d i d n o t e x h i b i t h i g h e r s e r u m b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t i e s ,
i n d i c a t i n g t h a t t h e a m p l i f i e d g e n e w a s n o t e x p r e s s e d . F o r
CYP 2 D 6 L , i t i s a p p a r e n t t h a t t h e g e n e i s f u n c t i o n a l o n t h e
b a s i s o f s t r u c t u r a l c r i t e r i a a n d t h e c o n s e q u e n c e s f o r d e b r i s o -
q u i n e m e t a b o l i s m i n v i v o ( c o m p a r e w i t h a b o v e ) . ( i i i ) A t t h e
p r o b a b l e t i m e o f b u t y r y l c h o l i n e s t e r a s e a m p l i f i c a t i o n , t h e
g r a n d p a r e n t s w e r e e x p o s e d t o h i g h l e v e l s o f p a r a t h i o n , w h i c h
c o u l d h a v e t r i g g e r e d g e n e a m p l i f i c a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , t h e
a b i l i t y f o r g e n e a m p l i f i c a t i o n w a s i n h e r i t e d . I n o u r c a s e , t h e
c a u s e f o r a m p l i f i c a t i o n i s u n k n o w n . T h e p o s s i b l e t r i g g e r f o r
g e n e a m p l i f i c a t i o n m i g h t h a v e b e e n a d e f e c t i v e g e n e
i n a
p a r t i c u l a r o o c y t e o r s p e r m c e l l , a n d a m p l i f i c a t i o n o f t h e
CYP 2 D 6 g e n e m i g h t h a v e c o m p e n s a t e d f o r t h e p h y s i o l o g i c a l
f u n c t i o n e x e r t e d b y t h e d e f e c t i v e g e n e . A l t e r n a t i v e l y , t h e
CYP 2 D 6 g e n e m a y n o t h a v e a n y i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a l
f u n c t i o n , a n d t h e r e f o r e n o p r e s s u r e h a s b e e n p l a c e d
o n
r e m o v a l o f t h e e x t r a g e n e s .
T h e s u b j e c t s w i t h t w o o r m o r e c o p i e s o f t h e CYP 2 D 6 L g e n e
m a y n o t r e a c h t h e r a p e u t i c p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s o f d r u g s
We a r e i n d e b t e d t o B a r b r o We r e l i u s ( D e p a r t m e n t o f Cl i n i c a l
G e n e t i c s , Ka r o l i n s k a H o s p i t a l ) f o r h e l p w i t h t h e p u l s e d f i e l d g e l
e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s . T h e s k i l l f u l t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f M a r g a -
r e t a P o r s m y r - P a l m e r t z i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . T h i s r e s e a r c h
w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m M a g n B e r g v a l l s S t i f t e l s e , S t i f t e l s e n
S i g u r d o c h E l s a G o l j e s M i n n e , S t i f t e l s e n S o d e r s t r o m - Ko n i g s k a
S j u k h e m m e t , a n d t h e S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h Co u n c i l . T h e s t u d y
r e p r e s e n t s a c o n t r i b u t i o n t o t h e a i m s o f E u r o p e a n Co o p e r a t i o n i n t h e
F i e l d o f S c i e n t i f i c a n d T e c h n i c a l R e s e a r c h B i .
1 . A l t , F . W. , Ke l i e m s , R . E . , B e r t i n o , J . R . & S c h i m k e , R . T .
( 1 9 7 8 ) J . B i o l . Ch e m . 2 5 3 , 1 3 5 7 - 1 3 7 0 .
2 . Wa h l , G . M . , P a d g e t t , R . A . & S t a r k , G . R . ( 1 9 7 9 ) J . B i o l .
Ch e m . 2 5 4 , 8 5 7 9 - 8 6 8 9 .
3 . S t a r k , G . R . ( 1 9 8 6 ) Ca n c e r S u r v . 5 , 1 - 2 3 .
4 . N i s h i m u r a , S . & S e k i u a t , K. ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m . J . 2 4 3 , 3 2 3 - 3 2 7 .
5 . S t a r k , G . R . & Wa h l , G . N . ( 1 9 8 4 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 3 ,
4 4 7 - 4 9 1 .
6 . Wr i g h t , J . A . , S m i d t , H . S . , Wa t t , F . M . , H a n c o c k , N . C. ,
H u d s o n , D . L . & S t a r k , G . R . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .
US A 8 7 , 1 7 9 1 - 1 7 9 5 .
7 . S r i v a s t a v a , A . , N o r r i s , J . S . , S h m o o k l e r - R a i s , R . J . & G o l d -
s t e i n , S . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l . Ch e m . 2 6 0 , 6 4 0 4 - 6 4 0 9 .
8 . T u r n e r , D . R . , M o r l e y , A . A . , H a l l i a n d r o s , M . , Cu t l a c a , R . &
S a n d e r s o n , B . J . ( 1 9 8 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 5 , 3 4 3 - 3 4 5 .
9 . P r o d y , C. A . , D r e y f u s , P . , Z a m i r , R . , Z a k u t , H . & S o r e q , H .
( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 6 , 6 9 0 - 6 9 4 .
1 0 . G o n z a l e z , F . J . ( 1 9 8 9 ) P h a r m a c o l . R e v . 4 0 , 2 4 3 - 2 8 8 .
1 1 . M e y e r , U. A . , Z a n g e r , U. M . , G r a n t , D . & B l u m , M . ( 1 9 9 0 ) i n
A d v a n c e s i n D r u g R e s e a r c h , e d . T e s t a , B . ( A c a d e m i c , L o n -
d o n ) , V o l . 1 9 , p p . 1 9 7 - 2 4 1 .
1 2 . Ka l o w , W. ( 1 9 9 1 ) T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 1 2 , 1 0 2 - 1 0 7 .
1 3 . Ki m u r a , S . , Um e n o , M . , S k o d a , R . C. , M e y e r , U. A . &
G o n z a l e z , F . J . ( 1 9 8 9 ) A m . J . H u m . G e n e t . 4 5 , 8 8 9 - 9 0 4 .
1 4 . G o n z a l e z , F . J . , V i l b o i s , F . , H a r d w i c k , J . P . , M c B r i d e , 0 . W. ,
N e b e r t , D . W. , G e l b o i n , H . V . & M e y e r , U. A . ( 1 9 8 8 ) G e n o m -
i c s 2 , 1 7 4 - 1 7 9 .
1 5 . Ka g i m o t o , M . , H e i m , M . , Ka g i m o t o , K. , Z e u g i n , T . & M e y e r ,
U. A . ( 1 9 9 0 ) J . B i o l . Ch e m . 2 6 5 , 1 7 2 0 9 - 1 7 2 1 4 .
1 6 . G a e d i g k , A . , B l u m , M . , G a e d i g k , R . , E i c h e l b a u m , M . &
M e y e r , U. A . ( 1 9 9 1 ) A m . J . H u m . G e n e t . 4 8 , 9 4 3 - 9 5 0 .
1 7 . D a h l , M . - L . , J o h a n s s o n , I . , P o r s m y r - P a l m e r t z , M . , I n g e l m a n -
S u n d b e r g , M . & S j o q v i s t , F . ( 1 9 9 2 ) Cl i n . P h a r m a c o l . T h e r . 5 1 ,
1 2 - 1 7 .
1 8 . B e r t i l s s o n , L . , L o u , Y. - Q . , D u , Y. - L . , L i u , Y. , Ku a n g , A . - T . ,
L i a o , X . - M . , Wa n g , K. - Y. , R e v i r i e g o , J . , I s e l i u s , L . & S j o q v i s t ,
F . ( 1 9 9 2 ) Cl i n . P h a r m a c o l . T h e r . 5 1 , 3 8 8 - 3 9 7 .
1 9 . B e r t i l s s o n , L . , A b e r g - Wi s t e d t , A . , G u s t a v s s o n , L . L . & N o r -
d i n , C. ( 1 9 8 5 ) T h e r . D r u g M o n i t o r 7 , 4 7 8 - 4 8 0 .
2 0 . B e r t i l s s o n , L . , D a h l , M . - L . , S j o q v i s t , F . , A b e r g - Wi s t e d t , A . ,
H u m b l e , M . , J o h a n s s o n , I . , L u n d q v i s t , E . & I n g e l m a n - S u n d -
b e r g , M . ( 1 9 9 3 ) L a n c e t 3 4 1 , 6 3 .
2 1 . S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . F . & M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 9 ) M o l e c u l a r
Cl o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l ( Co l d S p r i n g H a r b o r L a b .
P r e s s , P l a i n v i e w , N Y) .
2 2 . H e i m , M . & M e y e r , U. A . ( 1 9 9 0 ) L a n c e t l i , 5 2 9 - 5 3 2 .
2 3 . H e i m , M . & M e y e r , U. A . ( 1 9 9 2 ) G e n o m i c s 1 4 , 4 9 - 5 8 .
2 4 . S c h i m k e , R . T . ( 1 9 8 4 ) Ce l l 3 7 , 7 0 5 - 7 1 3 .
T
J - ( 3 4 )
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a :
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( 6 3 )
*
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( 7 2 )
0 ( 3 )
*
( 3 )
G e n e t i c s : J o h a n s s o n e t a L