PREDKLINIČNE RAZISKAVE

(TOKSIKOLOGIJA)
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Farmakološko rešetanje (screening): In vitro, In vivo

Npr.poizvedba “Drug screening methods”: 276 zadetkov

Protein Microarrays in Combination with Multi-Layered Affinity Interaction Detection: Advances in Proteomics Techniques
Improved Fluorogenic Protease Substrates for High Throughput Screening: Identification of a Fluorogenic Rhodamine-Labelled Malarial
Protease Substrate
An Assay for Double Stranded Breaks in DNA Useful for Early Stage Genotoxicity Screening of Compounds of Therapeutic Interest
Tools for the Discovery of New Antibiotics: Targeting Essential NAD+-Dependent Bacterial DNA Ligases
Human Signal Peptide Peptidase (SPP) as a Drug Target in Hepatitis C Virus Infections: Development of a High Throughput Screen
Tools for the Discovery of New Anti-Fungal Drugs: Targeting Essential RNA Cap Formation
Hepatitis C Virus Drug Screening: Discovery of a Region in the Core Protein that is Required for Localisation
Development of a Novel Screening System to Identify Novel Chemopreventive Agents for Oral Cancer
Development of an in vivo Drug Screen for T cell Reconstitution: Identification of Effective Compounds for Treating Diseases without Interfering
with T cell Production
Enabling Technology Leading to the Production of Soluble and Functional Large Eukaryotic Proteins
Method of Fractionation of Biologically-Derived Materials using Critical Fluids to Elucidate Novel Anticancer and Anti-Infective Drugs:
SuperFluidsTM CXF Technology
Identification of Genes Linked to Bone Metastatic Activity as Diagnostics and Drug Targets
Development of a Novel System for Screening Protein-Protein Interactions in Mammalian Cells
Development of a Novel High-Throughput Screening Tool: The NS5B HCV Viral Polymerase and JEV Viral Polymerase as Antiviral Screening
Target
A Novel Method for Drug Screening: Cellular Uptake of Modified Peptides
The MOREsystem and MolMind in Drug Discovery: Methods and Systems for Discovery of Chemical Compounds and their Synthesis
Novel Apicomplexan Parasitic Infection Treatment: Development of a Library of Inhibitors
Novel Enabling Technology to Screen Inhibitors of Candida Albicans
Screening Partnerships Sought for Phytopure Library of Pure, Novel Compounds
Kv1.5 Channel Blockade for the Treatment of Atrial Fibrillation: Elucidation of a Novel Therapeutic Compound
A New Pathogenetic Mechanism Leading to Migraine: Drug Screening Assay and Molecular Diagnosis
A Novel Therapeutic Approach to Treat Thrombosis: Sustaining Constitutive Nitric Oxide Synthase Activity
Development of a Novel Drug Screening Technology: An in vitro Display Technology for the Rapid Generation of Libraries
Development of Novel Model Systems: Biomimetic Systems of Lipid Membranes Bound to a Substrate
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Farmakokinetika
ABSORPCIJA: prenos zdravila z mesta aplikacije v sistemsko cirkulacijo
skozi membrane:
- filtracija: koncentracijski gradient
- pasivna difuzija: koncentracijski gradient
lipofilnost (>partition coefficient>lipofilnost)
stopnja ionizacije (le ne-ionizirana oblika gre skozi bariero)
- aktivni transport: specifični sistem nosača (“carrier”)
energija
koncentracijski gradient
saturacija
inhibicija
konkurenca
- pospešena difuzija: specifični sistem nosača (proteinske molekule)
saturacija/kompetitivna inhibicija
koncentracijski gradient
- fagocitoza / pinocitoza
Farmakokinetika
ABSORPCIJA: mesta absorpcije (aplikacije)
KOŽA: pasivna difuzija
PLJUČA: pasivna difuzija
GI TRAKT: pasivna difuzija
pospešena difuzija
aktivni transport
fagocitoza
(vpliv mikroflore; direktno v jetra-”first-pass effect”)

PARENTERALNO: i.p., i.m., s.c., i.v.

Farmakokinetika
DISTRIBUCIJA: po absorpciji v cirkulacijo v tkivo

Organi in tkiva

UČINEK
Plazma METABOLIZEM
vezan

svoboden vezan na proteine

DEPONIRANJE
metaboliti
IZLOČANJE
svoboden
svoboden

vezan

RESORPCIJA IZLOČANJE
 Farmakokinetika
DISTRIBUCIJA:
1x aplikacija
Koncentracija v plazmi po i.v.aplikaciji Koncentracija v plazmi po p.o. aplikaciji

80 80

70 70

60 60
Koncentracija

50 50

Koncentracija
40 40

30 30

20 20

10 10

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0 0,5 1 2 3 4 5 6 7
Čas (h) Čas (h)

Večkratna aplikacija
Koncentracija v plazmi po p.o. aplikaciji
Koncentracija v plazmi po p.o. aplikaciji

1,2
40

t1/2 = 1h
1
t1/2 = 24 h
30
0,8
apl. 30 min Koncentracija
Koncentracija

0,6
20

0,4
t1/2 = 12 h

10
0,2
apl. 2 h Aplikacija 8 h
0 0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 0 1 2 3 4 5 6
Čas (h) Čas (dan)
Farmakokinetika
Biotransformacija:

Reakcije I.faze Reakcije II.faze Reakcije III.faze

Oksidacija Sulfatacija

Redukcija Glukuronidacija

Hidroliza Konjugacija z Nadaljni metabolizem

glutationskih konjugatov
glutationom
Hidracija Acetilacija

Dehalogenacija Konjugacija z
aminokislino
Metilacija
Farmakokinetika
Biotransformacija, I.faza:
OKSIDACIJA
-mikrosomalna oksidacija (citokrom P-450 monooksigenazni sistem, monooksigenaze s flavinom,
aromatska hidroksilacija, alifatska hidroksilacija, aliciklična hidroksilacija, heterociklična
hidroksilacija, N-dealkilacija, S-dealkilacija, O-dealkilacija, N-oksidacija, N-hidroksilacija,
S-oksidacija, P-oksidacija, desulfuracija, deaminacija, oksidacijska dehalogenizacija, oksidacija
etanola, desaturacija alkilnih skupin)
-ne-mikrosomalna oksidacija (oksidacija aminov, oksidacija alkoholov in aldehidov, oksidacija purina,
aromatizacija alicikličnih spojin, peroksidacija)
REDUKCIJA
-redukcijska dehalogenizacija
HIDROLIZA (amidov, hidrazidov, karbamatov, epoksidov)

Biotransformacija, II.faza:
KONJUGACIJA
-z glukoronsko kislino
-sulfatna konjugacija
-konjugacija z glutationom,( cisteinska konjugacija)
-acetilacija
-konjugacija z aminokislinami
-metilacija
Farmakokinetika
Biotransformacija – posledice:

SUBSTANCA

DIREKTEN TOKSIČNI UČINEK

detoksikacija
metabolička
aktivacija formiranje
stabilnega metabolita

stabilni metabolit TOKSIČNI / REAKTIVNI METABOLIT stabilni metabolit

metabolizem /
reakcija z zaščitnim
agensom

reakcija s detoksifikacija TOKSIČNI UČINEK

kritično tarčo
stabilni metabolit

izločanje izločanje

TOKSIČNI UČINEK
Farmakokinetika
Izločanje:
- ledvica: urin
- GI trakt: blato (žolč, pasivna difuzija v lumen)
- pljuča: izdihan zrak
- mleko
- pot, solze, slina, semenska tekočina

Parametri:
Cmax , tmax , t1/2α , t1/2β , AUC, ka, ke, k12, k21, Vd, Cl, …..
biološka razpoložljivost (bioavailability), biološka enakovrednost
(bioequivalency)
Farmakokinetika

ICH GUIDELINES:
S3A: Toxicokinetics: Guidance on the assessment of systemic
exposure in toxicity studies

S3B: Pharmacokinetics: Guidance for repeated dose tissue distribution

studies
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Farmakodinamika

Eksperimentalni modeli – ugotavljanje LASTNOSTI:

-biokemijski nivo (encimi, deli celic)
-izolirane celice / tkivo
-izolirani organi
-živali (zdrave; eksperimentalno povzročene bolezni/stanja)

SAR (Structure Activity Relationship)

Farmakodinamika
ugotavljanje LASTNOSTI:
*KVALITATIVNO: selektivnost učinka

100
Relativni učinek(%)

50

večja AKTIVNOST
večji
AFINITET
0

log doze ali koncentracije

100 A večji AFINITET enaki

A B C B manjši AFINITET UČINEK
Relativni učinek (%)

50
C drugi mehanizem delovanja
D D manjši AFINITET, manjši UČINEK

log doze ali koncentracije

Farmakodinamika
ugotavljanje LASTNOSTI:
*KVANTITATIVNO: krivulje: koncentracija/učinek; učinek/čas

100 100

Relativni učinek (%)

Relativni učinek (%)

50
50

0
0
2 4 6 8 10 12 14 16 2 4 8 16

Koncentracija log koncentracije

Farmakodinamika
MEHANIZEM DELOVANJA:

*specifično,
*nespecifično,
*vezava na receptorje: stimulacija, blokada; agonist, antagonist
*delovanje na enzime
*second messenger (npr. cAMP)
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija
VPLIV NA POMEMBNE ORGANE (Safety Pharmacology):

ICH S7A: Safety pharmacology studies for human pharmaceuticals

(CPMP/ICH/530/00)
Cilji:
-identifikacija nezaželjenih lastnosti, ki bi lahko imele vpliva na varnost
-evalvacija nuzdelovanja, ki so ugotovljeni v toksikoloških/kliničnih študijah
-ugotavljanje mehanizma
Metode:
In vitro, ex vivo, in vivo

“Safety pharmacology core battery” – minimalno*

1.centralni živčni sistem
2.kardiovaskularni sistem
3.respiratorni sistem
(+ renalni/urinarni sistem, avtonomni živčni sistem, gastrointestinatni sistem, mišični
sistem, imunski sistem, endokrini sistem)

* V skladu z DLP načeli!!!!!

Toksikologija
AKUTNA TOKSIČNOST:

Definicija:
Določitev kvalitativnih in kvantitativnih lastnosti substance
po enkratnem dajanju visokih (toksičnih) odmerkih.

OECD guidelines for testing chemicals:

401: Acute oral toxicity (1987)
420: Acute oral toxicity - Fixed dose method (1992)
423: Acute oral toxicity - Acute toxic class method(1996)
425: Acute oral toxicity - Up-and-Down procedure (1998)

ICH guideline:
S4: Single dose toxicity tests (1991)

SOP 612-002-XX

Cilji: -ocenitev nevarnosti in razvrstitev substanc

Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:

Živali: miši, podgane, (kunci, psi); mlade, zdrave; t.t.= M±20%, ♂♀

Substanca: primeren nosilec (vehicle) → analitika
Odmerki: !!!!!!!
Aplikacija: p.o., i.p., i.v., s.c.
Parametri: klinični znaki toksičnega delovanja (časovni potek!), pogini,
spremembe telesne teže, patologija
Statistika: LD50, spremembe telesne teže
Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
OECD guideline: 401: Acute oral toxicity (1987)

Živali: min. 5 / spolu / odmerku

Odmerki: min. 3 (max.2000 mg/kg):
-ki omogočajo ugotovitev odnosa odmerkov-toksičnih učinkov in odmerkov-
poginov
-dovolj podatkov za dose-response krivuljo
-dovolj podatkov za sprejemljivo določanje LD50
Čas opazovanja: min.14 dni
Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
OECD guideline: 420: Acute oral toxicity - Fixed dose method (1992)
Preliminarna študija:
Odmerki: 5, 50, 500 in 2000 mg/kg
Živali: 1♀/odmerek
Opazovanje: 7 dni (če so znaki toksičnosti še 7 dni)
I.primer: 500 mg/kg: če ni toksičnosti → 2000 mg/kg
2000 mg/kg: če ni toksičnosti → definitivna študija
2000 mg/kg: toksičnost → med 500 in 2000 mg/kg
II.primer: 500 mg/kg: toksičnost → 50 mg/kg
50 mg/kg: če ni toksičnosti → med 50 in 500 mg/kg
50 mg/kg: toksičnost → 5 mg/kg
5 mg/kg: če ni toksičnosti → definitivna študija
5 mg/kg: toksičnost → odmerek < 5 mg/kg
Definitivna študija:
Odmerek izbran v preliminarni študiji: evidentna toksičnost, ne pogin!
Živali: 5♀, 5♂
Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
OECD guideline: 420: Acute oral toxicity - Fixed dose method (1992)
Rezultati:
Podatki o substanci, nosilcu, živalih, pogojih,……
Toksičnost po spolu in odmerku:
-število živali
-število, pri katerem se pojavljajo toksični znaki, vključno pogini
-narava, resnost in trajanje učinka
-čas pojavljanja znakov toksičnosti, reverzibilnost
-nekropsija + histopatologija
-določitev odmerka, ki povzroča pomembno toksičnost
-določitev minimalnega letalnega odmerka
-določitev najvišjega odmerka, ki ne povzroča pogina
Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
OECD guideline: 423: Acute oral toxicity – Acute Class method (1996)

Izvaja se po korakih

Živali: 3 (enega spola) / koraku

Odmerki: (začetni) 25, 200 ali 2000 mg/kg
Osnovni kriterij: pogin DA / NE!
 ZAČETEK

25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

3 živali; 3 živali; 3 živali;
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 0-1 0-1

2-3 2-3 2-3
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg
3 živali; 3 živali; 3 živali;
2.spol 2.spol 2.spol
0 0
2-3 1 2-3 1 2-3 0-1

I.možnost: PRENEHANJE ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

II.možnost: NADALJEVANJE ŠTUDIJE

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 0-1
2-3 2-3 2-3 0-1

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
2.spol 2.spol 2.spol

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0-1

ZAKLJUČEK ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

 ZAČETEK

25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

3 živali; 3 živali; 3 živali;
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 2-3 0-1 0-1

2-3 2-3
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg
3 živali; 3 živali; 3 živali;
2.spol 2.spol 2.spol

2-3 0
2-3 1 1 2-3 0-1

I.možnost: PRENEHANJE ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

II.možnost: NADALJEVANJE ŠTUDIJE

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 0-1
2-3 2-3 2-3 0-1

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
2.spol 2.spol 2.spol

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0-1

ZAKLJUČEK ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

 ZAČETEK

25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

3 živali; 3 živali; 3 živali;
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 2-3 0-1 2-3 0-1

2-3
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg
3 živali; 3 živali; 3 živali;
2.spol 2.spol 2.spol

2-3
2-3 1 1 2-3 0-1

I.možnost: PRENEHANJE ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:
25 mg/kg 200 mg/kg 2000 mg/kg

II.možnost: NADALJEVANJE ŠTUDIJE

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
1.spol 1.spol 1.spol

0-1 0-1
2-3 2-3 2-3 0-1

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

3 živali 3 živali 3 živali
2.spol 2.spol 2.spol

2-3 0-1 2-3 0-1 2-3 0-1

ZAKLJUČEK ŠTUDIJE

KLASIFIKACIJA:

5 mg/kg 50 mg/kg 500 mg/kg

Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
OECD guideline: 423: Acute oral toxicity – Up-and-Down procedure (1998)

-uporabna metoda, če žival pogine (ali jo usmrtimo) v 1-2 dni

-osnovne (dostopne) informacije o substanci (SAR!)

Začetni odmerek: 200, 500 ali 2000 mg/kg apliciramo eni živali
če preživi 24 h, naslednja dobi višji odmerek (faktor 1,3), do max.
2000 mg/kg
če pogine, ali jo usmrtimo, naslednja dobi nižji odmerek
*Ko ugotovimo mejne odmerke, postopek ponovimo na 4 živalih.
*Če je potrebno, test opravimo na drugem spolu ( ne več kot 3 živali), z
odmerki nad in pod LD50

Limit test: 2000 mg/kg

če 1. žival preživi 24 h, 2. žival dobi enak odmerek
če 2. žival preživi, enaki odmerek apliciramo še 3.(istega spola)
če vse tri živali preživijo, uporabimo še 3 živali drugega spola

Izračun LD50: “Maximum likelehood method” (SAS ali BMDP program)

Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:
SOP 612-002-XX:Izvajanje toksikološkega poskusa akutne toksičnosti

Odmerki:

1.faza 2.faza
10 100 1000 mg/kg
Uporabljene/poginule živali
3/0 3/0 3/0 2000
3/0 3/0 3/1 600 1000 1600 2000
3/0 3/0 3/2 200 400 800 1600
3/0 3/0 3/3 140 225 270 600
3/0 3/1 3/3 50 100 200 400
3/0 3/2 3/3 20 40 80 160
3/0 3/3 3/3 15 25 40 60
3/1 3/3 3/3 5 10 20 40
3/2 3/3 3/3 2 4 8 16
3/3 3/3 3/3 1 2 4 8

Lorke DA. A new approach to practical acute toxicity testing. Arch Toxicol 1983; 54: 275-87.
 Toksikologija AKUTNA TOKSIČNOST:

Interpretacija rezultatov (vrednosti LD50)

ODMEREK * REZULTAT INTERPRETACIJA

< 100% preživelih ZELO TOKSIČNO (LD50 ca. 25 mg/kg ali <)
5 mg/kg 100% preživelih, toksičnost DA TOKSIČNO (LD50 med 25 in 200 mg/kg)
100 % preživelih, toksičnost NE → aplikacija 50 mg/kg
< 100% preživelih TOKSIČNO ali ZELO TOKSIČNO → aplikacija 5 mg/kg
50 mg/kg 100% preživelih, toksičnost DA ŠKODLJIVO (LD50 med 200 in 2000 mg/kg)
100 % preživelih, toksičnost NE → aplikacija 500 mg/kg
< 100% preživelih TOKSIČNO ali ŠKODLJIVO → aplikacija 50 mg/kg
500 mg/kg 100% preživelih, toksičnost DA MOŽNI TOKSIČNI UČINKI (LD50 ca. 2000 mg/kg)
100 % preživelih, toksičnost NE → aplikacija 2000 mg/kg
2000 mg/kg < 100% preživelih MOŽNI TOKSIČNI UČINKI → aplikacija 500 mg/kg
100 % preživelih, toksičnost DA ali NE NI POMEMBNEGA AKUTNEGA TOKSIČNEGA RIZIKA

Legenda: * = če odmerek povzroči smrt, substanco je potrebno aplicirati v nižjem odmerku, ki povzroči toksični učinek, ampak ne smrt
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Definicija in cilji:
Karakterizacija toksikološkega profila substance po večkratnem dajanju; identifikacija morebitnega
tarčnega organa, razmerje med izpostavljenjem in odgovorom (exposure/response: TIME-
RELATED, DOSE-RELATED); morebitna reverzibilnost toksičnega učinka.

OECD guidelines for testing chemicals:

407: Repeated dose oral toxicity – rodent: 28-day or 14-day study (1981)
408: Subchronic oral toxicity – rodent: 90-day study (1981)
408 (ad.): Repeated dose 90-day oral toxicity study in rodents (1998)
409: Subchronic oral toxicity – Non-rodent: 90-day study (1981)
409 (ad.): Repeated dose 90-day oral toxicity study in non-rodents (1998)
410: Repeated dose dermal toxicity: 21/28-day study (1981)
411: Subchronic dermal toxicity: 90-day study (1981)
417: Toxicokinetics (1984)

ICH/EMEA guidelines:
CPMP/ICH/300/95 (S4A): Duration of chronic toxicity testing in animals (rodent and non-rodent toxicity
testing) (1998)
CPMP/SWP/1042/99: Note for guidance on repeated dose toxicity
CPMP/ICH/384/95 (S3A): Toxicokinetics: A guidance for assessing systemic exposure in toxicology
studies
CPMP/ICH/385/95 (S3B): Pharmacokinetics: Guidance for repeated dose tissue distribution studies

SOP 612-021-XX: Izvajanje toksikološkega poskusa po večkratnem dajanju preskušanca

laboratorijskim živalim
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Sinomimi: subakutna/subkronična/kronična = toksičnost po večkratnem
dajanju (repeat-dose toxicity, repeated dose toxicity)
Čas dajanja: 7-,14-, 28-, 30-, 90-, 180-dni
*odvisno od predvidenega časa dajanja v kliniki:
-1x: min.7 dni
-7x: min.30 dni
-dolgotrajno: 90- do 180 dni
*ICH S4A (1999): glodalci 6 mesecev, neglodalci 9 mesecev
Način dajanja: enako kot v kliniki
Živali: * idealen model: enake farmakokinetske lastnosti
* glodalci (podgane); min. 6 (-10)
* neglodalci (psi, opice): 3
- Primeren sev, mladi odrasli, obeh spolov, ZDRAVI!
Odmerki: 3: nizki odmerek(N): brez toksičnega učinka (NOEL, NOAEL)
srednji odmerek(S): blagi toksični učinek
visoki odmerek(V): toksični učinek, minimalna smrtnost
kontrola (K): nosilec
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Način izbire odmerkov:
- Vrednosti LD50: N odmerek = ca.1/10 LD50
V odmerek: ca. 1/3 LD50
- “Dose-ranging study” : min.4 odmerki, 14-dni, izbor MTD (zmanjša
prirast telesne teže za ca. 10%)
Parametri: (dnevno / tedensko)
-klinični znaki
-spremembe telesne teže
-poraba hrane
-poraba vode
-hematološke analize
-klinično-biokemijske analize
-analize urina
-oftalmološke preiskave
-funkcionalni testi
-patomorfološke preiskave
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Klinični znaki toksičnega delovanja:
KLINIČNO OPAZOVANJE ZNAKI PRIZADETI ORGAN / SISTEM / TKIVO
Dihanje spremembe v hitrosti in globini dihanja, CŽS (respiratorni center), pljučni edem,
spremembe barve kože/sluznic, izcedek (nos) pljučna/srčna insuficiencija, paraliza dihalnih mišic
Motorna aktivnost spremembe v hitrosti in naravi gibov CŽS, neuromuskularni, avtonomni, senzorni sistem
Konvulzije neprostovoljne kontrakcije, napadi kontrakcij CŽS, neuromuskularni, avtonomni, respiratorni s.
Refleksi oči (kornea,pupila),ušesa, "righting", "startle" CŽS, neuromuskularni, sentorni, avtonomni s,
Oči lakrimacija, mioza, midrijaza, egzoftalmus, Avtonomni sistem
ptoza, refleks tretje veke, kromodakrioreja, infekcija, krvavitev, iritacija
motna kornea, iritis, konjunktivitis
Kardiovaskularni sitem bradikardia, tahikardia, vasodilatacija, CŽS, avtonomni, srčna/pljučna insuficiencija,
vazokonstrikcija, aritmija infarkt, (vroče/mrzlo okolje)
Salivacija povečano slinjenje Avtonomni sistem
Piloerekcija neurejena dlaka Avtonomni sistem
Analgezija manjša občutljivost na izzvano bolečino CŽS, senzorni sistem
Tonus mišic Hipotonija, hipertonija Avtonomni sistem
Blato konzistenca, barva, pogostost izločanja Avtonomni sistem, GI motiliteta, zaprtost, driska
Bruhanje (podgane NE!) CŽS, senzorni, avtonomni sistem
Urin barva, pogostost, nekontrolirano Senzorni, avtonomni sistem, ledvica
Koža edem, eritem Iritacija, vnetje, senzitizacija, imobilizacija, poškodbe
tkiva, poškodbe ledvic
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Spremembe telesne teže: (tehtanje vsakodnevno !)

300 Control
25 mg/kg
75 mg/kg
150 mg/kg
250 *
Body weight changes (%)

*
* *
200
*
*
150 *

*
100
0 15 30 45 60 75 90
Days
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Hematološke analize:
(pred začetkom, min. 1x med poskusom, na koncu)

-eritrociti: število, oblika(!)

-hematokriti
-hemoglobin
-levkociti: število, diferencialna krvna slika
-krvne ploščice: število trombocitov, protrombin, (protrombinski čas)
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Klinično-biokemijske analize: serum/plazma
(pred začetkom, min. 1x med poskusom, na koncu)

-karbohidratni metabolizem
-metabolizem proteinov
-balans elektrolitov
-funkcije organov (funkcionalni testi)

Analize urina: (pred začetkom, min. 1x med poskusom, na koncu)

-specifična teža, pH, proteini, glukoza, ketoni, bilirubin, urobilinogen,
epitelne celice, kamni

Funkcionalni testi: EKG, EEG, prevodnost živčevja, jetra, ledvica

Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:
Patomorfološke preiskave:
MAKROSKOPSKO: vse živali
HISTOPATOLOŠKO: obvezno živali iz K in V skupine,
• če so ugotovljene poškodbe organov v V skupini, tudi iz S (N)
• število organov*: bazirano na znanstveni presoji
TEŽE ORGANOV

*CPMP/SWP/1042/99 (2000): Note for guidance on repeated dose toxicity:

mesto aplikacije (če je smiselno) traheja jetra epididimis
tkivo tumorja pluča (bronhi, bronhioli) žolčnik seminalne žleze
krvni razmaz srce pankreas ovariji
limfni vozli (mezenterialni, periferni) aorta vranica uterus ( z cerviksom in jajcevodi)
mlečna žleza ščitnica, paratiroida ledvica in uretri vagina
slinovnice (mandibularna, parotida, sublingvalna) požiralnik nadledvična žleza možgani (cerebrum, cerebelum, možgansko steblo)
skeletne mišice želodec mokračni mehur periferni živci
prsnica, femur, vretenca (vključno kostni mozeg) tenko črevo prostata oko in vidni živec
hipofiza debelo črevo (Payer-jeve plošče) testesi hrbtenjača
timus
Toksikologija SUBAKUTNA TOKSIČNOST:

Statistična obdelava:
Osnovna statistika: srednja vrednost ± napaka srednje vrednosti
Vrednotenje: Student t-test (p<0,05), analiza variance
Neparameterski testi: Kruskal-Wallis, Mann-Whitneyer U-test, …..
Toksikologija TOKSIKOKINETIKA:
(“multiple-dose pharmacokinetics”)
-”step-by-step”, “case-by-case”
-izbrani optimalni parametri
-omogočena optimalna interpretacija toksikoloških izvidov
-lahko je vključena v vse vrste toksikoloških poskusov (akutna,
subakutna, reprodukcija, mutagenost, karcinogenost)

Cilji:
*opisati doseženo sistemsko izpostavljanje organizma: odnos do
odmerkov in časa poskusa (dose-, time-related exposure)
*odnos dosežene koncentracije in toksikoloških izvidov
*zagovarjati izbiro vrste in režima aplikacije
*pridobitev informacij za dodatne študije
Toksikologija TOKSIKOKINETIKA:
Živali: dodatne skupine, podskupine v toksikološkem poskusu ali
ločena študija, oba spola, min. 6/spolu/skupini
Odmerki: 3 (kot v toksikološki študiji)

ANALIZNA METODA !

*osnovni podatki o FK pridobljeni v predhodnih poskusih (FK, dose-

range; ista vrsta)

Parametri: (dovolj pogosto) Določitev substance ali metabolita

- v plazmi/serumu: Cmax, Cčas , AUC
- v tkivu
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
*fertilnost (segment I.)
*embriotoksičnost in teratogenost (segment II.)
*peri- in post-natalni razvoj (segment III.)

1.Pred parjenjem do zanositve: reproduktivne funkcije odraslih samcev in samic, razvoj in

dozorevanje gamet, obnašanje pri parjenju, fertilizacija
2.Od zanostive do implantacije: reproduktivne funkcije samičk, razvoj in dozorevanje
gamet, implantacija
3.Od implantacije do zaprtja trdega neba: reproduktivne funkcije samičk, razvoj embrija,
formiranje pomembnih organov
4.Od zaprtja trdega neba do konca brejosti: reproduktivne funkcije samičk, razvoj in rast
fetusa, razvoj in rast organov
5.Od rojstva do odstavitve: reproduktivne funkcije samičk, prilagoditev mladičev na
življenje zunaj maternice, rast in razvoj pred odstavitvijo
6.Od odstavitve do spolne zrelosti: rast in razvoj po odstavitvi, prilagoditev samostojnemu
življenju, pridobivanje popolnih spolnih funkcij
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:

OECD Guidelines:
414:Prenatal developmental toxicity study (2001)
415: One-generation reproduction toxicity (1983)
416: Two-generation reproduction toxicity study (2001)
421: Reproduction/developmental toxicity screening test (1995)
422: Combined repeated dose toxicity study with the
reproduction/developmental toxicity screening test (1996)
426: Developmental neurotoxicity study (1999)

ICH/EMEA Guidelines:
CPMP/ICH/386/95 (S5A): Detection of toxicity to reproduction for
medicinal products (1995)
CPMP/ICH/136/95 – modification (S5B,M): An addendum on toxicity to
male fertility (2000) (dodatek k S5A)
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:

Termini:
0.dan brejosti: prisotnost sperme v vaginalnem razmazu in /ali vaginalni
zamašek
Implantacija: miši, podgane: 3.-5. dan, kunci: 6.-7. dan brejosti
Čas najpomembnejše organogeneze: miši, podgane: 5.-15. dan; hrčki: 6.-14.
dan; kunci: 6.-18. dan
Zaprtje trdega neba: 15.-18. dan brejosti
Trajanje brejosti: podgane: 21.-23. dni, kunci: 29.-35. dni
0.dan posnatalnega razvoja ali 0.dan laktacije: dan rojstva
Čas odstavitve/laktacije: podgane: 3 tedne
Spolna zrelost: podgane: 3 mesece

Fo generacija: starši
Fx generacija: mladiči
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
Pred parjenjem do zanositve; od zanositve do implantacije (fertilnost, segment I);
Od rojstva do odstavitve; od odstavitve do spolne zrelosti (peri- in post-natalni razvoj,
segment III.) 1 ali 2 generacijske študije
APLIKACIJA GESTACIJA LAKTACIJA

F0♂ P
POROD
A
R
E
F0♀ N
F 1♀ F2
J
F0♀ E

ŽRTVOVANJE

APLIKACIJA

F0
• tretirane ♀ + tretirani ♂
• netretirane ♀ + tretirani ♂
• tretirane ♀ + netretirani ♂
• 1♂+1♀
Aplikacija:
F0 ♂: pred parjenjem: min.10 tednov (med odraščanjem,
najmanj eden celotni ciklus spermatogeneze: 56 dni
miši, 70 dni podgane), med parjenjem
F0 ♀: pred parjenjem (med odraščanjem, nekaj celotnih
estrustnih ciklusov) min. 2-3 tedne, med parjenjem, v
teku brejosti in laktacije
F1 ♂♀: pred parjenjem (med odraščanjem), med parjenjem,
♀: v teku brejosti in laktacije do odstavitve F2
Odmerki: Najmanj 3 + K (NOAEL), v hrani, vodi ali p.o.
sondom
Limit: 1000 mg/kg
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
Pred parjenjem do zanositve (fertilnost); 1 ali 2 generacije

OPAZOVANJE:
*Klinični znaki toksičnega delovanja (najmanj 1x dan)
*Tehtanje: F0 ♂♀ pred parjenjem, med parjenjem (1.dan aplikacije, 1-2 x teden);
F0, F1 ♀(starši): med brejostjo (0., 7., 14., 20./21. dan),
med laktacijo (0., 4., 7., 14., 21.dan),
pred žrtvovanjem
F1, F2 ♀(mladiči): 0., 1., 4., 7., 14., 21.dan po rojstvu,
F1 starši: med odraščanjem
*Estrusni cikel: F0, F1 ♀
*Spolni organi F0, F1 ♀: Število rumenih telesc, implantacija, brejosti, porod, makroskopski pregled
(placenta)
*Spolni organi F0, F1 ♂ : teža, makroskopski in histološki pregled (testes, epididimis), spermiji (število,
gibljivost, morfologija), min. v V in K skupini
*Mladiči: število, spol, mrtvorojeni (vzrok!), živi, malformacije, tel.teža (takoj po rojstvu)
tehtanje (1., 4., 7., 14., 21.dan); spremembe v obnašanju, znaki odraščanja (odpiranje oči,
odpiranje vagine/balano-prepucijska separacija, motorna aktivnost, senzorne funkcije, refleksi),
fertilnost
*Patološke preiskave (makroskopsko): vsi starši (F0, F1), mladiči z zunanjimi abnormalnostmi, najmanj
en naključno izbran mladič/spol/leglo iz F1, F2,
vsi poginuli ali žrtvovani
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
Pred parjenjem do zanositve (fertilnost); 1 ali 2 generacije

OPAZOVANJE (nad.):
*Teže organov:
F0, F1 (starši): maternica, jajčniki, testes, epididimis, seminalne žleze, možgani, jetra,
ledvica, vranica, hipofiza, ščitnica, nadledvična žleza, tarčni organ
F1, F2 (izbrani žrtvovani mladiči): možgani, vranica, timus

*Patološke preiskave (histopatološko): najmanj v V in K skupini

F0, F1 (starši): vagina, maternica s cerviksom, jajčniki, testes, epididimis, prostata,
seminalne žleze, koagulacijske žleze, hipofiza, tarčni organ
F1, F2 (mladiči z zunanjimi abnormalnostmi in izbrani): popolna histopatološka slika
izbranih organov
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
Pred parjenjem do zanositve (fertilnost); 1 ali 2 generacije

št.živali z uspešno kopulacijo

KOPULACIJSKI INDEKS = --------------------------------------------- x 100
št.parjenih živali

št.gravidnih samičk
INDEKS FERTILNOSTI = --------------------------------------------- x 100
št.živali z uspešno kopulacijo

št.samičk z živimi mladiči

INDEKS NOSEČNOSTI = ----------------------------------------- x 100
št.gravidnih samičk

št.rumenih telesc – št.implantacij

% PREIMPLANTACIJSKIH IZGUB = --------------------------------------------- x 100
št.rumenih telesc

št.implantacij – št.živih fetusov

% POIMPLANTACIJSKIH IZGUB = --------------------------------------------- x 100
št.implantacij

št.živorojenih mladičev
INDEKS ROJSTEV = ------------------------------------ x 100
št.implantacij
Toksikologija VPLIV NA PROCESE RAZMNOŽEVANJA:
Od zanostive do implantacije, od zaprtja trdega neba do konca brejosti
(embriotoksičnost in teratogenost) KUNCI in PODGANE!

OPLODITEV

APLIKACIJA
KUNCI, 20 ♀

0.dan 6.dan 18.dan 29.dan gestacije

ŽRTVOVANJE
HISTEREKTOMIJA
PREGLED
APLIKACIJA
PODGANE, 20 ♀

3.dan 15.dan 20.dan gestacije

0.dan

OPAZOVANJE:
Med študijo: klinični znaki, telesna teža, poraba hrane
Konec študije: žrtvovanje ♀ po carskem rezu 1 dan pred porodom: makroskopski (histopatološki!)
pregled, število rumenih telesc, implantacije
Mladiči: število živih/mrtvih, spol, teža, abnormalnosti,
50% fetusov iz vsakega legla: pregled za preiskave skeleta
min. 50% fetusov iz vsakega legla: pregled za pregled mehkih tkiv
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija MUTAGENOST
OECD Guidelines:
No.471: Genetic toxicology: Salmonella typhimurium, Reverse mutation assay (1983);
adopted: Bacterial Reverse Mutation test (1997)
No.472: Genetic toxicology: Escherichia coli, Reverse mutation asay (1983)-brisano
No.473: Genetic toxicology: In vitro mammalian cytogenetic test (1983); adopted: In vitro
mammalian chromosome aberration test (1997)
No.474: Genetic toxicology: Micronucleus test (1983); adopted: Mammalian erythrocyte
micronucleus test (1997)
No.475: Genetic toxicology: In vitro mammalian bone marrow cytogenetic test –
chormosomal analysis (1984); adopted: Mammalian bone marrow chromosome
aberration test (1997)
No.476: Genetic toxicology: In vitro mamalian cell gene mutation test (1984); adopted: In
vitro mammalian cell gene mutation test (1997)
No.477: Genetic toxicology: Sex-linked recessive lethal test in Drosophila melanogaster
(1984)
No.478: Genetic toxicology: Rodent dominant lethal test (1984)
No.479: Genetic toxicology: In vitro sister chromatid exchange assay in mammalian cells
(1986)
No.480: Genetic toxicology: Saccharomyces cerevisiae, gene mutation assay (1986)
No.481: Genetic toxicology: Saccharomyces cerevisiae, mitotic recombinant assay (1986)
Toksikologija MUTAGENOST
OECD Guidelines:
No.482: Genetic toxicology: DNA damage and repair, Unschedule DNA synthessis in
mammalian cells in vitro (1986)
No.483: Genetic toxicology: Mammalian germ-cell cytogenetic assay (1986); adopted:
Mammalian spermatogonial chromosome aberration test (1997)
No.484: Genetic toxicology: Mouse spot test (1986)
No.485: Genetic toxicology: Mouse heritable translocation assay (1986)
No.486: Unschedule DNA synthesis (UDS) test with mammalian liver cells in vitro (1997)

EMEA/ICH Guidelines:
CPMP/ICH/141/95 (S2A): Genotoxicity: Guidance on specific aspects of regulatory
genotoxicity tests for pharmaceuticals (1996)
CPMP/ICH/174/95 (S2B): Genotoxicity: A standard baterry for genotoxicity testing of
pharmaceuticals (1998)

EudraLex Guidelines (volume 3B: Safety, enviromnent and information)

3BS5A: Testing of medicinal products for their mutagenic potentaial
3BS6A: Genotoxicity: Specific aspects of regulatory genotoxicity tests for
pharmaceuticals
Toksikologija MUTAGENOST
A standard baterry for genotoxicity testing of pharmaceuticals
Cilj: odkriti substance, ki povzročajo genetske poškodbe (direktno ali indirektno): genske
mutacije, poškodbe kromosomov, rekombinacije in spremembe števila kromosomov
Pozitiven rezulat → potencialni humani karcinogeni /mutageni

I.TEST ZA DOLOČANJE GENSKIH MUTACIJ V BAKTERIJAH (in

vitro)
Salmonella typhimurium sevi: (Ames test)
TA1535, TA1537 / TA97 / TA97a, TA98, TA100 (spremembe na guanin-citozin, G-C
mestu na histidinskom genu),
TA102 (spremembe na adenin-timin, A-T mestu) ali

Escherichia coli WP2 uvrA / Escherichia coli WP2 pKM101 (spremembe na adenin-timin,
A-T mestu)

Test odkrije * spremembe na genih

* genotoksične karcinogene (za glodalce)
* citotoksičnost
Toksikologija MUTAGENOST
A standard baterry for genotoxicity testing of pharmaceuticals

II.TEST ZA DOLOČANJE KROMOSOMSKIH POŠKODB (in vitro)

Celice sesalcev: * humane limfoblastoidne TK6 celice (tk locus)
* mouse lymphoma L5178Y celice (tk locus, hprt locus)
* CHO celice (hprt locus)
* V79 celice (hprt locus)
* AS52 celice (gpt locus)

III.TEST ZA DOLOČANJE KROMOSOMSKIH POŠKODB (in vivo)

Hematopoetske celice glodalcev:
• Kromosomske aberacije v celicah kostnega mozga
• Mikronuklei v kostnem mozgu ali v eritrocitih (pertiferna kri)
(Vključuje možen vpliv absorpcije, distribucije, metabolizma in
ekskrecije na genotoksično aktivnost substance)
Toksikologija MUTAGENOST
A standard baterry for genotoxicity testing of pharmaceuticals

DODATNI TESTI za substance, ki so bile negativne v bateriji

standardnih testov, pokazale pa so karcinogeni učinek in vivo
(nejasen mehanizem)
VKLJUČUJEJO:
• In vitro teste z metabolično aktivacijo (modifikacija bakterijskih
testov)
• In vivo teste za določanje poškodb genov v tarčnem organu (jetrni
UDS test, 32P-markiranje, indukcija mutacije v transgenih,
molekularna karakterizacija genetskih sprememb v tumor-related
genih)
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija KARCINOGENOST

OECD Guidelines:
No.451: Carcinogenicity studies (1981)
No.453: Combined chronic toxicity / carcinogenicity studies (1981)

EMEA/ICH Guidelines:
CPMP/ICH/140/95 (S1A): Guideline on the need for carcinogenicity studies of
pharmaceuticals (1995)
CPMP/ICH/299/95 (S1B): Testing for carcinogenicity of pharmaceuticals (1995, 1997)
CPMP/ICH/366/96 (S1C): Dose selection for carcinogenicity studies of pharmaceuticals
(1994, 1997)
S1C (R): Addendum to S1C: Addition of a limit dose and related notes (1997)
CPMP/SWP/2877/00: Note for guidance on carconigenic potential (2001)

EudraLex Guidelines:
3BS7A: Carcinogenic potential
3BS8A: The need for carcinogenicity studies of pharmaceuticals
3BS9A: Dose selection for carcinogenicity studies of pharmaceuticals
Toksikologija KARCINOGENOST

Cilj: identifikacija tumorigeničnog potenciala substance pri živalih zaradi določanja rizika
za ljudi

Živali:
Izbor bazira na podatkih o farmakologiji, subakutni toksičnosti, metabolizmu (P-450!),
toksikokinetiki, načinu dajanja.
GLODALCI: PODGANE!
transgene živali, druga vrsta glodalcev (miši, hrčki)
50 ♂, 50 ♀ / skupini
3 odmerka substance
negativna kontrola
pozitivna kontrola (?!)
- “interim sacrifice” (medtermin-12 mes.) → povečati začetno število živali
25 živali / skupini mora preživeti (manjše število preživelih je sprejemljivo le če so pogini
povzročeni zaradi karcinigenega delovanja učinkovine)

Čas dajanja: short-term, medium-term, long-term

24 mesecev (podgane)
18-24 mesecev (miši)
18 mesecev (hrčki)
Toksikologija KARCINOGENOST

Parametri:
Telesna teža
Poraba hrane (in vode)
Klinični znaki toksičnega delovanja
Palpacija oteklin
Oftalmoskopija
Hematologija, biokemija, analize urina (med študijo, na koncu)
Krvni razmaz (na kocu)
Patologija: makroskopski pregled, histopatologija:47 organov(vse poginule,
žrtvovane, preživele-žrtvovane na koncu, ali medterminu)

POSEBEJ POZORNO:
*število preiskanih živali
*število (in %) živali s tumorji (identifikacija, tkivo, malignost/benignost)
*pogostost distribucije tumorje; en ali več tumorjev enakega ali različnih tipov;
celotno število malignih tumorjev
*čas vsakega nepričakovanega pogina
*čas pojavljanja kakršnekoli otekline (palpacija), povečanje otekline s časom,
histopatologija
Toksikologija KARCINOGENOST

Analiza podatkov (statistika) kaže na:

• Pojavljanje neoplastičnih in ne-neoplastičnih poškodb
• Število preiskanih živali in živali s rizikom
• Incidenco kombiniranih tumorjev enakega histogenog porekla
• Incidenco tumorjev ocenjenih kot “maligni”
• Seštevek benignih in malignih tumorjev v enem tkivu
• Latentni čas pojavljanja tumorjev
• Razlike med tretiranimi in kontrolnimi skupinami (prisotnost
kakršnegakoli učinka povzročenega s substanco)
• Določitev “dose-related” učinka
• Zgodovinske podatki o “species-related” tumorjih
• Pojavljanje zelo redkih oblik tumorjev (čeprav ne statistični
signifikantno)
Toksikologija KARCINOGENOST

MEHANISTIČNE ŠTUDIJE
*spremembe v celicah (morfologija, histokemija, funkcionalni kriteriji);
POSEBEJ: apoptoza, proliferacija, fokalne spremembe, spremembe v medcelični
komunikaciji
*biokemijske meritve: napr. nivo hormonov v plazmi, faktorji rasti,
vezava na proteine, aktivnost tkivnih enzimov
*zahteve za dodatne genotoksične študije

DRUGI MODELI:
- “initiation-promotion” model pri glodalcih,
- transgene živali: napr.miši: * p53± deficitni model
* Tg.AC model
* TgHras2 model
*XPA deficitni model
- model na neonatalnih glodalcih
 Potek raziskav novega potencialnega zdravila

• Preliminarno:
Farmakološko rešetanje (screening) PROFIL

• Detajlno
Farmakokinetika Farmakodinamika Toksikologija
-absorpcija (zaželjeni učinek) (nezaželjeni učinek)
-distribucija -vpliv na pomembne organe
-lastnosti (“Safety pharmacology”)
-biotransformacija (kvalitativno, kvantitativno)
-izločanje -akutna toksičnost
-mehanizem delovanja -subakutna toksičnost (14,28-dni)

Klinične raziskave -subakutna toksičnost (3,6-mesecev)

I.faza -vpliv na procese razmnoževanja
-mutagenost
II.faza -kacinogenost
-lokalna toksičnost/toleranca
III.faza

IV.faza
REGISTRACIJA
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST/TOLERANCA

OECD Guidelines:
No.404: Acute dermal irritation / corrosion (2002)
No.405: Acute eye irritation / corrosion (2002)
No.410: Repeated dose dermal toxicity: 28-day (1981)
No.411: Subchronic dermal toxicity: 90-day (1981)
No.430: In vitro skin corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance test
(TER) (2002)
No.431: In vitro skin corrosion: Human skin model test (2002)
No.432 In vitro 3T3 NRU phototoxicity test (2002)

EMEA, EudraLex Guidelines:

CPMP/SWP/2145/00 (3BS12A): Non-clinical local tolerance testing of
medicinal products (2001)

SOP 612-022-XX
SOP 612-023-XX
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST

Iritacija: reverzibilne vnetne spremembe

Korozija: ireverzibilne poškodbe tkiva

* KOŽA: na obrito področje na hrbtu (cca. 6 cm2, nasprotna stran-kontrola)

min. 3 živali (KUNCI)
1x aplikacija: 0,5 ml (raztopina) oz. 0,5 g (prah, krema, gel,…): učvrstiti z
obližem, kontakt s kožo: 4 h (ali več)
točkovanje ERITEMA in EDEMA: 30-60 min, 24 h, 48 h, 72 h po odstranitvi
obliža (več časa, če so spremembe še opazne, max.14 dni) (Dreize, 1944; Dreize 1965)
Opis ocena
ERITEM IN KRASTE (maksimalno število točk = 4)
.. ni eritema 0 vsota točk
.. zelo slab eritem 1 Iritacijski indeks (I.I.) = --------------------
.. dobro opazen eritem 2
.. srednje do močno izražen eritem 3 št. odčitanj
.. močan eritem (rdeče kot pesa), formiranje krast (poškodbe v globini) 4

EDEM (maksimalno število točk = 4)

.. ni edema
.. zelo slab edem
0
1
< 2 ali 2 = blagi iritans
.. blagi edem (rob področja dobro viden) 2 2 - 5 = srednji iritans
.. srednje izražen edem (površina dvignjena 1 mm) 3
.. močan edem (površina dvignjena več kot 1 mm, zajeto področje 6 in > = močen iritans
večje od področja, ki je bilo v dotiku s preparatom) 4
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST

* OKO: v prostor, ki nastane pri odmiku spodnje veke (drugo oko-kontrola)

min. 3 živali (KUNCI-predhoden pregled oči)
1x aplikacija: 0,1 ml (raztopina) oz. 100 mg (prah, krema, gel,…);
če je potrebno: lokalni anestetik (bolečine!); izpiranje po 24 h
točkovanje sprememb na KORNEJI, IRISU, KONJUNKTIVI:
30-60 min, 24 h, 48 h, 72 h (max.21 dni) (Dreize 1944)
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST/TOLERANCA * OKO:
OCENA SPREMEMB (Dreize 1944)
Opis ocena
KORNEA

KLASIFIKACIJA (Brunner 1992)

A.Motnost
1. Ni sprememb 0
2. Razpršena ali difuzna področja, iris jasno viden 1
3. Jasno opazna polprozorna področja, detajli irisa delno nejasni 2
4. Opalescentno (biserovinasto) področje, detajli irisa niso vidni, velikost pupile
delno vidna 3
5. Neprozorna kornea, iris ni viden 4
KATEGORIJA OPIS MAS vrednosti
B.Zajeto področje motnosti AMOCO KLASIFIKACIJA
1. 1/4 ali manj 1
2. Več kot 1/4, manj kot 1/2 2
3. Več kot 1/2, manj kot 3/4 3 0 Minimalna iritacija 0 - 15
4. Več kot 3/4 do celo področje 4
1 Nežna iritacija 16 - 30
Točkovanje: AxBx5, maksimalno število točk =80 2 Iritacija 31 - 80
IRIS 3 Zelo močna iritacija, poškodba očesa 81 - 100
1. Ni sprememb 0
2. Značilna nagubanost, kongestija, oteklina, srednje močna cirkumkornealna hiperemija ali
injiciranost žil, ali kombinacije teh sprememb; iris še reagira na svetlobo 1 TEXACO KLASIFIKACIJA
3. Iris ne reagira na svetlobo, hemoragije, močne poškodbe (ali eno od teh) 2
0 Minimalna iritacija 0 - 15
Točkovanje: točka x 5, maksimalno število točk =5 1 Nežna iritacija >15 - 25
KONJUNKTIVA 2 Srednja močna iritacija >25 - 50
A.Rdečina
1. Krvne žile normalne 3 Močna iritacija >50 - 80
2. Nekatere žile hiperemične 0 4 Zelo močna iritacija >80 - 100
3. Difuzna, temno rdeča barva, posamezne žile niso razločno vidne 1
4. Difuzno zelo temno rdeče 2

MAS = maksimalna vrednost srednjih točk

3
B. Oteklina (veke in/ali tretja veka-membrana nicticant)
1. Ni otekline
2. Oteklina večja od normalne 0
3. Očitna oteklina z delnim zavihanjem veke navzven 1
4. Oteklina, veke na pol zaprte 2
5. Oteklina, veke več kot pol zaprte 3
4
C.Izcedek
1. Več kot normalno
2. Vlažne veke in dlake okoli vek 1
3. Vlažne veke in večje področje okrog 2
3
Točkovanje: (A+B+C)x2, maksimalno število točk =20
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST / TOLERANCA
Cilj: določitev tolerance produkta (aktivna substanca + ekscipienti) na
mestu aplikacije-lokalno; določitev sistemske toksičnosti.
Ločiti je potrebno mehanične učinke aplikacije in/ali fizikalno-kemijske
učinke od toksikoloških ali farmakodinamskih učinkov!
→Fizikalno-kemijske lastnosti produkta/formulacije (nizki pH!)
→Farmakodinamski, toksikološki in farmakokinetski podatli za aktivno
substanco, za kombinacije aktivnih substanc, ekscipiente

Mesto aplikacije = mesto aplikacije v kliniki:

(i) organ ali tkivo, ki je predvideno za cilj terapije
Napr. koža: za dermatološke produkte namenjene za zunanjo rabo
oko:
oko za oftalmološke pripravke
(ii) organ ali tkivo, ki je oddaljeno od ciljnega mesta terapije
Napr. koža: transdermalni obliži
vene:
vene za intravenske pripravke
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST / TOLERANCA

TESTIRANJE TOLERANCE NA OČESU: 1x, večkratna aplikacija

Pripravki: oftalmološki; losioni, geli za tretman kože lica, medicinski
šamponi
Metoda: in vivo, kunci (Dreize-ov test)
Preiskave: veke, konjunktiva, nictitating membrana, kornea, iris, leča,
vitreus, fundus: nekajkrat v teku 72 h; ev.histologija očesa

TESTIRANJE TOLERANCE NA KOŽI: 1x, večkratna aplikacija (4 tedne)

Pripravki: namenjeni za aplikacijo na kožo + vehikel
Metode: in vitro (korozija),
in vivo: kunci (Dreize.ov test): intaktna, abradirana koža
Preiskave: eritem, edem, deskvamacija, hraste, druge poškodbe; 24 h,
48 h, 72 h po aplikacije, do max. 8 dni; ev.histologija kože
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST / TOLERANCA

TESTIRANJE TOLERANCE PARENTERALNIH PREPARATOV:

Aplikacija: intravensko, intraarterijsko, intramuskularno, intratrahealno,
subkutano, paravenozno; 1x, večkrat (7 dni)
Živali: obrazložitev izbora
Aplicirani volumen: primeren vrsti živali
Dovoljeni maksimalni volumni za aplikacijo živalim (v ml)
Vrsta Tel.teža i.v. i.m
Morski prašiček 250 g do 5 0,25
Kunec 2,5 kg 5-10 0,5
Pes 5 kg 10-20 5,0
Podgana 100 g 1 0,1
Miš 20-30 g 0,5 0,05

Preiskave: spremembe na mestu aplikacije nekajkrat v teku 48-96 h, ev.

histologija
→ reverzibilnost sprememb
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST / TOLERANCA

TESTIRANJE TOLERANCE V REKTUMU:

Aplikacija: 1x ali 2x dnevno min. 7 dni (klinika!)
Živali: kunci, psi
Preiskave: analna regija, sfinkter, klinični znaki, feces (kri, sluz),
žrtvovanje (makroskopski pregled, ev. histologija)

TESTIRANJE TOLERANCE V VAGINI:

Aplikacija: 1x ali 2x dnevno min. 7 dni (klinika!)
Živali: podgane, kunci, psi
Preiskave: vaginalna regija, klinični znaki, vaginalna sekrecija (kri,
sluz), makroskopski in histološki pregled vaginalnog trakta in
reprodukcijskega sistema; ev. učinek na sluznico cerviksa,
spermicidni učinek
Toksikologija LOKALNA TOKSIČNOST / TOLERANCA

TESTIRANJE SENZITIZACIJSKEGA POTENCIALA:

Pripravki: namenjeni za dermalno, rektalno ali vaginalno rabo
Metode:
(i) Test na morskih prašičkih (Guinea pig assay)
OECD Guideline No.406:

(ii)Test na lokalnih limfnih vozlih (Murine local lymph node assay,

LLNA)
Živali: ♀ miši (sev: CBA/Ca ali CBA/J), stare 8-12 tednov
Odmerki: več odmerkov do maksimalne koncentracije, ki še ne povzroča resne sistemske
toksičnosti ali močne lokalne iritacije; pozitivna in negativna kontrola-vehikel
Preiskave: “pooled” limfni vozli/žival; določitev srednjega stimulacijskega indeksa; dose-
response, primerjava tretirane vs. topilo/vehikel
Toksikologija SPECIFIČNE ŠTUDIJE

BIOTEHNOLOŠKA ZDRAVILA
Guidelines:
3BS13a: Pre-clinical biological safety testing on medicinal products
derived from biotechnology (1988)
CPMP/BWP/3088/99: Note for guidance on the quality, preclinical and
clinical aspects of gene transfer medicinal products (2001):
5.4.Pharmacological/toxicological evaluation of gene transfer products
• Toksičnost po enkratnem dajanju
• Toksičnost po večkratnem dajanju
• Imunogenost in imunotoksičnost
• Vpliv na reprodukcijo in razvoj mladičev
• Genotoksičnost/karcinogenost
• Sekundarna farmakodinamika
• Farmakokinetika
• Lokalna toleranca
Toksikologija NEČISTOTE

EMEA/ICH Guidelines:
CPMP/ICH/2737/99; Q3A (R): Impurities testing guideline: impurities in
new drug substances (2002)
CPMP/ICH/2738/99; Q3B (R): Impurities in new drug products (2003)
CPMP/QWP/1529/04: Control of impurities of pharmacopoeial
substances: Compliance with the European Pharmacopoeia
General Monograph “Substances for pharmaceutical use” and
General Chapter “Control of impurities in substances for
pharmaceutical use” (april 2004)
CPMP/SWP/5199/02: Guideline on the limits of genotoxic impurities
(december 2004)
Toksikologija NEČISTOTE
TERMINI:
Impurity = nečistota
Related substances = sorodne snovi
Identified impurity = identificirana nečistota
Unidentifiend impurity = neidentificirana nečistota
Qualified impurity = ovrednotena (kvalificirana) nečistota
Specified impurity = specificirana nečistota
Unspecified impurity = nespecificirana nečistota
Detectable impurities = določljive nečistote
Any other impurities = katerekoli druge nečistote

(New) Active (Drug) substance = (nova) učinkovina, zdravilna

učinkovina, aktivna substanca
(New) Drug product = (novo) zdravilo
Degradation product = razpadni (razgradni) produkt
Toksikologija NEČISTOTE

TERMINI:
Acceptance criterion = meje sprejemljivosti
Maximum daily dose = največji dnevni odmerek (doza)
REPORTING THRESHOLD = meja navajanja (prag poročanja)
IDENTIFICATION THRESHOLD = meja (prag) identifikacije
QUALIFICATION THRESHOLD = meja (prag) vrednotenja/kvalifikacije

Problematika:
Nečistote v AKTIVNI UČINKOVINI
Nečistote v KONČNEM IZDELKU
Toksikologija NEČISTOTE

UČINKOVINA (ICH Q3A, Ph.Eur.)

Uporaba Največji Meja Meja Meja

dnevni navajanja identifikacije vrednotenja
odmerek (reporting) (identification) (qualification)
Humana + ≤ 2 g/kg > 0,05 % >0,10 % ali >0,15 % ali
Humana in > 1,0 mg/dan > 1,0 mg/dan
veterinarska
Humana + > 2 g/kg > 0,03 % > 0,05 % > 0,05 %
Humana in
veterinarska
Veterinarska - > 0,1 % > 0,2 % > 0,5 %
Toksikologija NEČISTOTE

KONČNI IZDELEK (ICH Q3B, Ph.Eur.)

UPORABA NAJVEČJI DNEVNI ODMEREK Meja navajanja (reporting)
Humana ≤ 1 g/dan > 0,1 %
Humana > 1 g/dan > 0,05 %
Meja identifikacije (identification)
Humana < 1 mg/dan > 1,0 % ali 5 mg SDK*
Humana 1-10 mg/dan > 0,5 % ali 20 mg SDK
Humana >10 mg/dan – 2 g/dan > 0,2 % ali 2 mg SDK
Humana > 2 g/dan > 0,10 %
Meja kvalifikacije (qualification)
Humana < 10 mg/dan > 1,0 % ali 50 µg SDK
Humana 10 – 100 mg/dan > 0,5 % ali 200 µg SDK
Humana > 100 mg/dan – 2 g/dan > 0,2 % ali 3 mg SDK
Humana > 2 g/dan > 0,15 %
Legenda: SDK = skupne dnevne količine zaužite nečistote na dan
Toksikologija NEČISTOTE
Odločitve za identifikacijo in kvalifikacijo nečistot

Nečistota > meje identifikacije ?

DA NE Nič !

Določena struktura Kakršenkoli že znan rizik Znižaj količino na

nečistote ? DA za ljudi ? DA varno mejo !

NE

Ali so nečistote
znižane na ne več kot
(≤) meja identifikacije DA Nič!
NE
?
DA

Ali so nečistote
znižane na ne več kot Nečistote > meja
(≤) meja kvalifikacije ? DA kvalifikacije ? NE Nič!
NE

NE
Upoštevajoč populacijo bolnikov in čas terapije, opraviti:

* in vitro genotoksIčne študije (točkasta mutacija, aberacija kromosomov)

* splošne toksikološke študije (ena vrsta, 14-90 dni)
* druge primerne specifične toksikološke študije

NE

ZNIŽAJ NA Kakršnikoli klinično pomembni nezaželjeni učinki? KVALIFICIRAJ !

VARNO MEJO !
DA NE
Toksikologija NEČISTOTE

KAKO IN KDAJ PRISTOPITI K KVALIFIKACIJI NEČISTOT?

“PRIMER DO PRIMERA” (“CASE BY CASE”): nečistota je:

a) identificirana, izolirana, opisana:
-literatura (originator!)
-ocena rizika
b) identificirana, izolirana, ni opisana:
-QSTR (podatkovna baza!)
-študije* (izolirana nečistota)
-literatura (originator! “čista” substanca?)
-ocena rizika
c) identificirana, ni izolirana, ni opisana:
-QSTR (podatkovna baza!)
-študije (substanca z nečistoto)
-literatura (originator! “čista” substanca?)
-ocena rizika
d) ni identificirana, ni izolirana, ni opisana:
-študije (substanca z nečistoto)
-literatura (originator! “čista” substanca?)
-ocena rizika
Toksikologija
QSAR, QSTR
Quantitative structure-activity/toxicity relationship
= povezava med strukturo/fizikalno-kemijskimi lastnosti
substance in njenim (toksičnim) učinkom

* alternativna metoda (3R: reduce, refine, replace!)

* ne more v popolnosti zamenjati biološke študije potrebne
za določanje varnosti
* številni pristopi: najpogostejše je računalniško-podprto
modeliranje (podatkovne baze: kombinacija bioloških
podatkov in kemijskih struktur): TOPKAT; DEREK;
METEOR; MULTICASE, META
Toksikologija
QSAR, QSTR
Cilj:
*določiti meje variacij v molekulski strukturi,
ki so povezane s specifičnim toksičnim
učinkom,
*definirati poti zaradi katerih spremembe v
strukturi (in s tem v zvezi spremembe
lastnosti substance) vplivajo na
učinkovitost
Toksikologija
QSAR, QSTR
DOLOČITI:
-meje uporabe: tako, da ocenimo kateri tip
molekule (“molecular domain”) in obseg
znanih opisanih vrednoti (“descriptor
domain”) povzročajo toksičnost, ki jo lahko
predvidimo z veliko verjetnostjo.
-statistična meritev: kot dokaz ustreznosti,
pomembnosti in robustnosti.
Toksikologija
QSAR, QSTR
Uporaba:
*razvoj bolj učinkovitih substanc
*napoved nezaželjenih učinkov pri določanju
rizika (“risk assessment”)
MODELI: validirani! Bazirani na znanimi ali
hipotetičnimi mehanizmih (toksičnega)
delovanja
Toksikologija
QSAR, QSTR

Toksični učinki:
(a)reakcije s receptorjem* (“receptor-mediated”)
-nekovalentni mehanizem: ligand (substanca)-receptor interakcija (specifična
tri-dimenzionalna struktura (stereoelekronske molekularne lastnosti!!!)
-direktna reakcija s receptorjem (agonist, antagonist)
-vpliv na nivo endogenih hormonov
-vpliv na odzivnost tkiva na hormone (spremembe nivoja/funkcije
receptorjev)
(b)akutna reakcija ni povezana s receptorjem (“non-receptor-mediated”)
-kovalentni mehanizem (učinek ireverzibilne kemijske reakcije)
-nekovalentni mehanizem: (reverzibilna reakcija, npr.narkoza)
(c)vpliv na zdravje ljudi (“human health effect”)
-spekter različnih toksičnosti: od kronične do specifične (iritacije, alergije)

*receptor = protein, ki reagira z signalno molekulo (npr.hormon) ter povzroči

fiziološke/funkcionalne spremembe v organizmu
Toksikologija
QSAR, QSTR

(c)vpliv na zdravje ljudi (“human health effect”)

-tradicionalne metode (razvoj modelov in poročanja na osnovi linearne
regresije in diskriminatorne analize)
-uporaba “ekspertnih” sistemov: DEREK, HazardExpert, Oncologic,
TOPKAT, MULTICASE, COMPACT
*mutagenost
*karcinogenost