Antibakterijska Aktivnost Avarola Avarona I Fitola Sekundarnih Metabolita Prirodnog Porekla

UNIVERZITET U NOVOM SADU
PRIRODNO MATEMATIKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola,
sekundarnih metabolita prirodnog porekla

- Master rad -

Mentor: dr Maja Karaman, docent Student: Tnde Kartali, 242m/12
Komentor: dr Boris Pejin, nauni saradnik

Novi Sad, 2013.

Eksperimentalni deo ovog master rada
uraen je u
Mikrobiolokoj laboratoriji
Departmana za biologiju i ekologiju
Prirodno-matematikog fakulteta
Univerziteta u Novom Sadu.

Zahvaljujem se

mentoru dr Maji Karaman, docentu na Departmanu za biologiju i ekologiju
Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu,
na ukazanom poverenju, ljubaznosti, predloenoj temi i korisnim savetima;

komentoru dr Borisu Pejinu, naunom saradniku Odseka za nauke o ivim sistemima
Instituta za multidisciplinarna istraivanja (IMSI) Univerziteta u Beogradu,
na predloenoj temi i iskrenoj podrci i pomoi u svim fazama izrade ovog rada;

lanovima Komisije, red. prof. dr Milanu Matavulju i doc. dr Petru Kneeviu, sa
Departmana za biologiju i ekologiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u
Novom Sadu, na posveenom vremenu i krajnjoj dobronamernosti;

red. prof. dr Duanu Sladiu (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu) i
naunom saradniku dr Ireni Novakovi (Centar za hemiju, IHTM, Univerzitet u
Beogradu), na iskazanoj dobroj volji i kolegijalnosti oko uzoraka avarola i avarona;

svojoj Porodici, prijateljima i kolegama, na punom razumevanju, veri u mene i ljubavi
koje su mi pruili.

U Novom Sadu, Tnde Kartali, master kandidat
31. oktobra 2013. godine (E-mail: kartalit@gmail.com)

Sadaj
Lista ilustracija u tekstu .......................................................................................................... i
Lista ilustracija u prilogu ....................................................................................................... ii
Lista tabela ............................................................................................................................. iii
Lista grafika ........................................................................................................................... iv
1. Uvod .................................................................................................................................. 1
2. Cilj rada ............................................................................................................................ 3
3. Opti deo ........................................................................................................................... 4
3.1. Patogeni mikroorganizmi............................................................................................ 9
3.1.1. Escherichia coli ............................................................................................................ 9
3.1.2. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................................... 10
3.1.3. Bacillus cereus ............................................................................................................ 10
3.1.4. Clostridium sporogenes .............................................................................................. 11
3.1.5. Sarcina lutea ............................................................................................................... 11
3.1.6. Staphylococcus aureus ................................................................................................ 12
3.1.7. Streptococcus agalactiae ............................................................................................ 13
3.1.8. Enterococcus faecalis ................................................................................................. 13
3.2. Sekundarni metaboliti prirodnog porekla ................................................................. 14
3.2.1. Avarol i avaron ........................................................................................................... 14
3.2.2. Fitol ............................................................................................................................. 18
4 Materijal i metode .......................................................................................................... 21
4.1. Bioloki materijal ...................................................................................................... 21
4.1.1. Suner Dysidea avara ................................................................................................. 21
4.1.1. Test kulture mikroorganizama .................................................................................... 21
4.2.Ispitivane supstance ................................................................................................... 21
4.3. Bakterijske suspenzije i standardizacija inokuluma ................................................. 22
4.4. Minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna (MBC) koncentracija ....... 23
4.5. Procena vrednosti MIC i MBC ................................................................................. 23
4.6. Osetljivost kultura na standardne antibiotike ........................................................... 26
4.7. Priprema serije razreenja gentamicina i ampicilina ................................................ 26
4.8. Odreivanje osetljivosti bakterija na antibiotike ...................................................... 27
5. Rezultati i diskusija ....................................................................................................... 29
5.1. Avarol i avaron ......................................................................................................... 29
5.2. Fitol ........................................................................................................................... 32
6. Zakljuak ........................................................................................................................ 38
7. Literatura ....................................................................................................................... 39
8. Prilog ............................................................................................................................... 47
Izvod ....................................................................................................................................... 52
Abstract .................................................................................................................................. 53

i

Lista ilustracija u tekstu

Slika 1. Strukturne hemijske formule avarola i avarona. 15
Slika 2. Suner Dysidea avara (Schmidt, 1862). 16
Slika 3. Izgled sferularnih elija sunera Dysidea avara pod transmisionim elektronskim
mikroskopom.

17
Slika 4. Mahovina Rhodobryum ontariense.

19
Slika 5. Strukturna hemijska formula fitola. 19
Slika 6. Mikrotitar ploa sa inokulisanin hranljivim bujonom (Meller Hinton), tretiranih
serijom dvostrukih razblaenja avarona (12.50-0.02 g/ml).
50

ii

Lista ilustracija u prilogu

Slika 1. Brojnost kolonija soja Pseudomonas aeruginosa pri razliitim koncentracijama fitola
dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 47
Slika 2. Brojnost kolonija soja Bacillus cereus pri razliitim koncentracijama fitola dobijenih u
postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 47
Slika 3. Brojnost kolonija sojeva a) Bacillus cereus i b) Sarcina lutea pri razliitim
koncentracijama avarona dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti. 48

Slika 4. Brojnost kolonija soja Staphylococcus aureus pri razliitim koncentracijama avarola

Slika 5. Brojnost kolonija soja Enterococcus faecalis pri razliitim koncentracijama avarola

Slika 6. Zone inhibicije rasta nastale delovanjem razliitih antibiotika na bakterijsku kulturu
Staphylococcus aureus 5485: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.
Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklin; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina. 50

Staphylococcus aureus 5485: 10. Imipenem; 11. Tobramicin; 12. Ertapenem. 50

Escherichia coli: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5. Ceftriakson; 6.
Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10. Imipenem; 11.
Tobramicin; 12.Ertapenem.
51

Clostridium sporogenes: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.
Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10. Impenem;
11. Tobramicin; 12. Ertapenem. 51

iii

Lista tabela

Tabela 1. Finalne koncentracije avarola, avarona i fitola u mikrotitar ploama. 26

Tabela 2. Finalne koncentracije referentnih antibiotika u mikrotitar ploama. 27

Tabela 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne
koncentracije (MBC) ispitivanih supstanci. 36

Tabela 4. Osetljivost test mikroorganizama prema konvencionalnim antibioticima. 37

iv

Lista grafika

Grafik 1. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) avarola (MIC AOL), avarona
(MIC AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na
testirane Gram-pozitivne bakterije. 31

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona
(MBC AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na
testirane Gram-pozitivne bakterije. 32

Grafik 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) fitola (MIC FIT) i referentnih antibiotika
gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na testirane bakterije. 34

Grafik 4. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) fitola (MBC FIT) i referentnih
antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane bakterije. 35
v

Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola, sekundarnih metabolita prirodnog porekla

1

1. Uvod

Neracionalna primena antibiotika omoguava nastanak i irenje rezistentnih patogenih
mikroorganizama i kao takva predstavlja ozbiljan problem poslednjih decenija. Zbog ovog
fenomena znaajna panja posveena je pronalaenju novih terapeutika irokog antimikrobnog
dejstva (Jawetz et al., 1998).

Pod sekundarnim metabolizmom uglavnom se podrazumeva sinzteza molekula male
molekulske mase kao to su terpeni, alkaloidi i fenoli. Za razliku od primarnih metabolita koji su
obino ukljueni u vitalne procese poput rasta i razvoja, sekundarni metaboliti (= prirodni
proizvodi) omoguavaju preivljavanje u nepovoljnim uslovima sredine i/ili odbranu organizma
(Petrovi et al., 2007). Ova grupa jedinjenja iz biljaka i evolutivno jednostavnijih organizama
ukljuujui sunere u ii je interesovanja naune javnosti kako kod nas, tako i u svetu.

Poslednjih decenija marinski organizmi postali su jedan od glavnih predmeta istraivanja
u oblasti hemije prirodnih proizvoda, medicinske hemije i farmakologije. U prvom redu,
marinski beskimenjaci i njima pridrueni mikroorganizmi predstavljaju bogat izvor novih
prirodnih organskih jedinjenja koja se razlikuju od sekundarnih metabolita terestrinih vrsta. Po
pravilu, marinski metaboliti odlikuju se visokim farmakolokim potencijalom. Prirodni proizvodi
avarol (sesviterpenoidni hidrohinon) i avaron (odgovarajui hinon) izolovani su iz mediteranskog
sunera Dysidea avara (Schmidt, 1862) (Minale et al., 1974; De Rosa et al., 1976). Radi se o
izrazito bioaktivnim supstancama koje pokazuju antimikrobni potecijal (Seibert et al., 1985;
Gai, 1988; Cozzolino et al., 1990; Pejin et al., 2008; Boi et al., 2010), antiviralnu i
antitumorsku aktivnost (Sladi i Gai, 2006), kao i antiinflamatorni efekat (Ferrndiz et al.,
1993).

Fitol, aciklini nezasieni diterpen, uglavnom se nalazi u biljakama, kao komponenta
hlorofila (Mili, 1997). Ulazi i u sastav etarskih ulja, tj. biljnih produkata bogatih terpenima koji
nastaju u lezdanim dlaicama, kanalima ili sekretornim organima (Novakovi, 2010). I etarska

2

ulja sama za sebe i njihovi pojedinani hemijski konstituenti intenzivno se izuavaju kao mogui
antibakterijski i antifungalni agensi. U stvari, data istraivanja od posebnog su znaaja za
pronalaenje i razvoj novih antimikrobika visoko efikasnih prema rezistentnim patogenim
mikroorganizmima (Inoue et al., 2005).


3

2. Cilj rada

Cilj ovog rada bio je in vitro 'skrining' antibakterijske aktivnosti tri sekundarna metabolita
(avarol, avaron i fitol) na sedam referentnih bakterijskih kultura (ATCC American Type
Culture Collection):
dva Gram-negativna soja (Escherichia coli ATCC
11229
i Pseudomonas aeruginosa ATCC
9027
) i
pet Gram-pozitivnih sojeva (Bacillus cereus ATCC
11778
, Sarcina lutea ATCC
9341
,
Clostridium sporogenes ATCC
19404
, Enterococcus faecalis ATCC
19433
i Staphylococcus
aureus ATCC
25923
),
kao i na
dva humana patoloka izolata poreklom iz vaginalnog brisa (bakterijski sojevi
Staphylococcus aureus 5485 i Streptococcus agalactiae 5492).


4

3. Opti deo

Antibiotici su magini lekovi XX veka koji zavreuju posebnu panju naune javnosti
irom sveta. Zapravo, njihova iroka upotreba u medicini, veterini i poljoprivredi, kao i pojava
sve vee rezistencije bakterija, prua prostor za savremene naune studije i otvorenu diskusiju
(Beovi, 2006).
Ova grupa jedinjenja obino predstavlja produkte sekundarnog metabolizma
mikroorganizama koji nepovoljno deluju na razvoj ili razmnoavanje drugih mikroorganizama.

Prema hemijskoj grai, dele se na:
Tetracikline (doksiciklin, oksitetraciklin)
-laktamske antibiotike (penicilini, cefalosporini)
Makrolide (eritromicin, azitromicin, klaritromicin)
Linkozamide (linkomicin i klindamicin)
Aminoglikozide (streptomicin, amikacin, gentamicin, rifampicin, neomicin)
Glikopeptide (vankomicin i teikoplanin)
U uem smislu, antibiotici predstavljaju sekundarne metabolite mikroorganizama
razliite hemijske strukture koji mogu imati baktericidni (ubijaju bakterije) ili bakteriostatski
efekat (inhibiraju rast bakterija). Nema nikakve sumnje da su otkrie i razvoj antibiotika kao
lekova od revolucionarnog znaaja za medicinsku hemiju, kao i mikrobiologiju. Naime,
antibiotska era traje oko 60 godina, a zapoela je 1929. godine pronalaskom penicilina od strane
Aleksandra Fleminga, kotskog naunika. Od tada, pa sve do danas, otkriveno je preko 9000
antibiotika (Petrovi et al., 2007). Idealni antibiotik pokazuje selektivnu toksinost tj. deluje
iskljuivo na patogeni mikroorganizam, a ne i na domaina. Prema mehanizmu delovanja, mogu
se svrstati u etiri grupe (Jawetz et al., 1998; Mihajilov-Krstev, 2009):

5

1. inhibicija sinteze elijskog zida: obuhvata antibiotike koji deluju na neki stadijum sinteze,
nakupljanja ili unakrsnog vezivanja peptidoglikana, to dovodi do inhibicije rasta, a u veini
sluajeva i do smrti bakterija. To su laktami (penicilini, cefalosporini, monobaktami i
karbopenemi) i glikopeptidi;

2. inhibicija funkcije elijske membrane: obuhvata antibiotike koji deluju na elijsku
membranu; usled njihovog nakupljanja u eliji, naruava se funkcionalni integritet
membrane, te makromolekuli i joni 'bee' u vanelijski prostor, to vodi ka njenom
oteenju. U ovu grupu spadaju polimiksini, nistatin i gramicidin;

3. inhibicija sinteza proteina (inhibicija translacije i transkripcije genetskog materijala):
obuhvata antibiotike koji se vezuju za ribozomske subjedinice, spreavajui tako stvaranje
inicijalnog kompleksa ili vezivanje aminoacil-tRNK za ribozom. Radi se o streptomicinima,
tetraciklinu, hloramfenikolu, eritromicinu, linkomicinu i aminoglikozidima;

4. inhibicija sinteze nukleinskih kiselina: obuhvata antibiotike koji deluju na nukleinske
kiseline; svrstane u dve glavne klase - DNK inhibitori i RNK inhibitori:

inhibitori sinteze DNK: ovi antibiotici inhibiraju sintezu i replikaciju DNK vezujui se za
A subjedinicu DNK-giraze, ime direktno blokiraju aktivnost naznaenog enzima
neohodnog za proces replikacije. Predstavnici su kvinoloni i fluorokvinoloni;

inhibitori sinteze RNK: ovi antibiotici vrsto se vezuju za DNK zavisnu RNK-polimerazu
i tako inhibiraju sintezu RNK. Predstavnik je rifampicin.

Generalno, moe se rei da mehanizmi delovanja ove grupe jedinjenja nisu potpunosti
razjanjeni.

Antibiotike nazivaju 'panacejima' medicine XX veka; esto se, meutim, 'napamet'
uzimaju, tj. ne vodi se rauna o prirodi same infekcije. Na bazi svojih istraivanja, Fleming je jo

6

1945. godine ukazao da neodgovarajua upotreba penicilina moe dovesti do selekcije
rezistentnih 'mutantnih formi' bakterije Staphylococcus aureus sa veom infektivnou od
'osnovnih' sojeva. Nakon samo godinu dana, upravo zbog njegove neracionalne primene,
pokazalo se da je Fleming bio u pravu. tavie, trebalo je da proe jo svega par godina, pa da
vie od 50 % datog soja ne pokae osetljivost na penicilin. Naalost, svedoci smo identinog
trenda. Sa razvojem antibiotika poveava im se upotreba, a pojednostavljuje tehnologija
proizvodnje. Shodno tome, iz godine u godinu raste broj bakterija koji pokazuju znaajnu
rezistenciju prema komercijalno dostupnim antibioticima. Da stvar bude gora, pojedini
rezistentni sojevi, poznati po stopi mortaliteta hospitalizovanih bolesnika, 'ire' se van zidova
medicinskih ustanova, to bi trebalo da bude alarmirajui podatak za najiru javnost (Alanis,
2005).
Bakterijska rezistencija moe biti rezultat modifikacije antibiotika, elijskog zida ili
enzima tj. 'ciljnih meta' na koje deluju ovi lekovi deluju. Pojedine bakterije same su po sebi
otporne su na razliite agense (tzv. prirodna ili uroena rezistencija), to podrazumeva prirodnu
karakteristiku koju druge bakterije nemaju, a zbog koje odreeni antibiotik ne moe normalno da
deluje. Kod ostalih bakterija data otpornost je steena. Steena rezistencija sa bakterija na
bakterije prenosi se onom brzinom kojom sojevi uspevaju da razviju otpornost na relevantne
antibiotike. Jedan vid steene rezistencije je fenotipska rezistencija: na primer, L forma bakterija
(na inhibitore sinteze elijskog zida) i rezistencija bakterija u formi endospora (na inhibitore
sinteze proteina); ova rezistencija ne prenosi se na sledeu generaciju. Drugi vid steene
rezistencije, genotipska rezistencija, podrazumeva promenu genetskog materijala: geni koji
obezbeuju rezistenciju (nastali mutacijom) mogu biti smeteni ili na hromozomu ili
ekstrahromozomalno (na plazmidima ili transpozomima) i ire se horizontalnim transferom
(ekstrahromozomske rezistencije veoma se lako prenose na iste ili razliite vrste bakterija).
Pojedine bakterije 'brane' se formiranjem biofilma. Naime, poznato je da su biofilmovi kljuni
faktori virulentnosti mnogih oboljenja, ukljuujui infekcije implantata i urinarnog trakta, kao i
cistinu fibrozu. Faktori koji doprinose ovoj vrsti rezistencije najee su redukcija metabolizma
i brzine rasta, zatita pomou polimernih supstanci (lue se u okviru biofilma) i specifini
mehanizmi na bazi izmenjene fiziologije (Beovi, 2006; Petrovi et al., 2007). Krajnji rezultat
ovih fenomena jeste rezistentencija na antibiotike; u mnogim sluajevima radi se o

7

multirezistenciji, to u mnogome oteava leenje i efikasan izbor antibiotika. Prvi sluaj
antimikrobne rezistencije zabeleen je kasnih 40-ih godina prolog veka, tj. ubrzo po pojavi
sulfonamida i penicilina. Naime, sojevi S. aureus postali su otporni na date antibiotike
rekordnom brzinom. Zabeleen porast broja hospitalizovanih bolesnika sa problemom
bakterijske rezistencije u narednih 25 godina upotrebe ovih lekova ukazao je na dramatinu
situaciju u budunosti. Tada je konstatovano da su posebno ugroeni bolesnici smeteni na
intenzivnoj nezi, sa hroninim tegobama, kojima je prepisana terapija na bazi steroida i sa
oslabljenim imunim sistemom.
Spisak rezistentnih bakterija je impresivan: soj S. aureus rezistentan na sulfonamid i
penicilin ('40-te godine); -laktam produkujui soj Haemophylus influenza ('70-te godine);
meticilin-rezistentan soj S. aureus (MRSA) i multirezistentan soj Mycobacterium tuberculosis
('80-te godine); nekoliko rezistentnih sojeva enterinih i neenterinih Gram-negativnih bakterija
kao to su Shigella sp., Salmonella sp., Vibrio cholera, E. coli, Klebsiella pneumonia,
Acinetobacter baumanii i P. aeruginosa ('80-'90-te godine); sojevi Streptococcus iz grupe A
rezistentni na makrolide, soj S. pneumoniae rezistentnan na razliite klase antibiotika ukljuujui
peniciline i sojevi MRSA i Enterococcus rezistentni na vankomicin (aktuelan period).

Karbapanemi i monobaktami

Pored penicilina i cefalosporina, karbapanemi i monobaktami spadaju u -laktamske
antibiotike. Nastali su iz potrebe da se rei problem sa laktamazama koje proizvode
Gram-negativni bakterije rezistentne na peniciline.
Mehanizam njihovog delovanja isti je kao i kod penicilina: naime, svi -laktamski
antibiotici spreavaju sintezu peptidoglikana bakterijskog elijskog zida. Ovi antibiotici veoma
su stabilni i u prisustvu -laktamaza i u prisustvu penicilinaza i cefalosporinaza. Po vezivanju za
bakteriju, data jedinjenja inhibiraju transpeptidacioni enzim koji unakrsno povezuje peptidne
lance privrene na osnovnu strukturu peptidoglikana. Finalni baktericidni dogaaj, inaktivacija
inhibitora autolitikih enzima u elijskom zidu, dovodi do lize bakterije.

8

Imipenem, intravenozni -laktamski antibiotik, na tritu se pojavio '80-ih godina. Potie
iz jedinjenja tienamicina, prirodnog proizvoda bakterije Streptomyces cattleya. Ima veoma irok
spektar antimikrobne aktivnosti, deluje protiv mnogih aerobnih i anaerobnih Gram-pozitivnih i
Gram-negativnih organizama. Meutim, mnoge meticilin rezistentne stafilokoke (MRSA) manje
su osetljive, a Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus spp. za vreme terapije mogu razviti
rezistenciju (Jawetz et al., 1998).

Aminoglikozidi

Aminoglikozidi predstavljaju grupu antibiotika sa sloenom hemijskom strukturom i
meusobno slinim antimikrobnim dejstvom, farmakokinetikim karakteristikma i toksinou.
Glavni predstavnici su im gentamicin, streptomicin, amikacin, tobramicin, netilmicin i
neomicin. Streptomicin, prvootkriveni lek iz ove grupe (1943. godina), ujedno je bio i prvi
antibiotik koji je mogao da lei tuberkulozu. Premda se isti sve manje upotrebljava u medicini,
ima svoje 'naslednike' (Jawetz et al., 1998). Tobramicin produkuje soj Streptomyces tenebrarius,
a upotrebljava se u leenju razliitih bakterijskih infekcija, preteno uzrokovanih
Gram-pozitivnim bakterijama; posebno je efektivan protiv sojeva Pseudomonas. Ovaj antibiotik
vezuje se za 30S i 50S bakterijski hromozom, spreavajui tako formiranje 70S kompleksa, to
inhibira translaciju, usled ega bakterije umiru (Jawetz et al., 1998).

Na osnovu izloenog moe se zakljuiti da je potreba za novim antibioticima vie nego
opravdana i nuna (Alanis, 2005).


9

3.1. Patogeni mikroorganizmi

U odnosu na ukupan broj do sada opisanih mikroorganizama, relativno malo je onih koji
su uzronici oboljenja ljudi i ivotinja (Mihajilov-Krstev, 2009). Po definiciji, mikroorganizam
je patogen ako moe da uzrokuje oboljenje, a takva njegova sposobnost naziva se patogenost
(Petrovi et al., 2007). U irem smislu, pod patogenou mikroorganizma smatra se njegova
sposobnost da prodire u organizam domaina, da se u njemu odrava, razmnoava i izaziva
bolest. S druge strane, u uem smislu, patogenost predstavlja sposobnost infektivnog agensa da
izaziva oboljenje (Jawetz et al., 1998).

3.1.1. Escherichia coli

Spada a u familiju Enterobacteriaceae. Radi se o sojevima koji su fakultativni anaerobi;
Gram-negativni; asporegeni; sa peritrihalnim flagelama; pravih tapia duine, 2 6 m, ive
pojedinano ili u parovima; dobro rastu na svim jednostavnim podlogama.
Kolonije su im najee srednje veliine, okrugle, ispupene, glatke, sjajne, providne i
bezbojne; pojedini sojevi odlikuju se mukoidnim kolonijama. Na endo- i eozin-
metilenskoplavom agaru imaju metalni sjaj.
Dobro rastu na 37 C. Katalaza pozitivne i oksidaza negativne. Poseduju veliku
fermentativnu sposobnost. Razlau znaajan broj eera, uz produkciju kiseline i gasa. Veina
sojeva fermentie laktozu. Ne hidroliu ureu, ne produkuju vodonik-sulfid i ne obavljaju
likvefakciju elatina. IMViC-formula ovih bakterija je + + - -.
Escherichia coli prilino je otporni soj. Mesecima moe opstati u vodi i zemlji, kao i na
raznim predmetima. Tolerantna je na temperature znatno ispod 0 C, dok je temperatura od 60
C ubija nakon 15-20 min. Veoma je osetljiva na hlor i hlorna jedinjenja. Produkuje vie
toksinih materija ukljuujui endotoksin, enterotoksin i hemolizine.
E.coli javlja se u normalnoj mikroflori crevnog trakta toplokrvnih ivotinja. Kod ljudi
naseljava crevni trakt gde sintetie vitamine (B12) i antibiotike (kolicin); uestvuje i u
transformaciji ugljenih hidrata i proteina. Pri padu imunog sistema moe da izazove crevne
poremeaje (enteritis). Osim toga, glavni je uzronik infekcija urinarnog trakta, septikemije i

10

meningitisa; poznato je da izaziva i pneumonije (u organizam domaina dospeva aspiracijom
orofaringealnog sekreta) (Jawetz et al., 1998; Petrovi et al., 2007; Mihajilov-Krstev, 2011).

3.1.2. Pseudomonas aeruginosa

Spada u familiju Pseudomonadaceae. Radi se o pokretnim aerobnim Gram-negativnim
sojevima; tapii; dimenzija 0.6 2 m; mogu biti pojedinani, u parovima ili u obliku lanca;
nemaju kapsule, ali poseduju fimbrije i pile.
Striktni su aerobi i rastu na velikom broju hranljivih podloga. Formiraju glatke i okrugle
kolonije fluoroscentno zelene boje. esto produkuju nefluorescentni plaviasti pigment
piocijanin koji difunduje u agar, kao i fruorescentni pigment pioverdin koji agaru daje zelenkastu
boju. Kulture im miriu na cvet lipe.
Dobro rastu u temperaturnom opsegu od 37 C do 42 C. Katalaza i oksidaza pozitivne.
Ne fermentiu ugljene hidrate, ali mnogi sojevi razlau glukozu, uz stvaranje kiseline. Usvajaju
citrat, redukuju nitrate, ne hidroliu ureu.
Lue endotoksine, egzotoksine, enzime i druge bioloki aktivne materije koje poveavaju
njihovu toksinost; za elije domaina privruju se uz pomo pila (fimbrija).
Soj Pseudomonas aeruginosa esto ulazi u sastav normalne flore creva i koe oveka.
iroko je rasprostranjen u prirodi, a obino je prisutan i u bolnicama. Kod zdravih osoba moe da
formira kolonije (saprofit), dok kod pojedinaca sa oslabljenim imunitetom izaziva oboljenja
(Jawetz et al., 1998).

3.1.3. Bacillus cereus

Spada u familiju Bacillaceae. Re je o pokretnim Gram-pozitivnim fakultativnim
aerobima; sporogeni sojevi; tapii; dimenzija 1 3-4 m; rasporeeni su u dugake lance.
Dobro rastu na svim jednostavnim podlogama; optimalna temperatura je izmeu 20C i
40 C. Kolonije su im bele, krupne i glatke sa testerastim ivicama.

11

Veina predstavnika je pokretna; pojedini sojevi stvaraju kapsulu. Formiraju endospore
bacilarnog tipa (sporuliu samo aerobno) smetene centralno ili subterminalno; date endospore
ne deformiu telo bacila, a otporne su prema toploti. Katalaza pozitivne.
Bacillus cereus rasprostranjen je u zemljitu. Premda nije humani patogen, moe da
kontaminira hranu (spore su mu jako otporne na kuvanje) i izazove trovanje. Dato trovanje ima
dva razliita oblika, emetini i dijarealni, i obino se dovodi u vezu sa jelima na bazi mesa i
itarica. Soj B. cereus stvara toksine odgovorne za oboljenja koja bi se pre mogla okarakterisati
kao intoksikacija nego toksikoinfekcija (Jawetz et al., 1998).

3.1.4. Clostridium sporogenes

Spada u familiju Clostridiaceae. Radi se o Gram-pozitivnim anaerobima; sporogeni;
pokretni (peritrihe); bacili.
Formiraju krupne uzdignute kolonije glatkih ivica. Na krvnom agaru uoava se zona
hemolize.
Katalaza negativne. Fermentiu brojne eere, mnogi predstavnici razgrauju proteine.
Veoma su otporni na visoke temperature: u toku 10-15 min preivljavaju kuvanje na 80
C.
iroko su rasprostranjeni u zemljitu, vodi i raspadnom materijalu biljnog i ivotinjskog
porekla (Jawetz et al., 1998).

3.1.5. Sarcina lutea

Spada u familiju Micrococcaceae. Re je o aerobnim Gram-pozitivnim nepokretnim
kokama koje obrazuju sitne i glatke ute kolonije.
Katalaza negativne. Ne fermentiu ugljene hidrate, podnose visoke koncentracije soli.
ive slobodno u prirodi i mogu se nai u zemljitu, praini, vodi i vazduhu; uesnici su
normalne flore koe sisara, a kolonizuju sluzokou usta i gornjih disajnih puteva (Jawetz et al.,
1998).

12

3.1.6. Staphylococcus aureus

Spada u familiju Staphylococcaceae. Radi se o aerobnim Gram-pozitivnim nepokretnim
sojevima loptastog oblika udruenim u nepravilne grozdaste skupine.
Brzo rastu na veini bakteriolokih hranljivih podloga u aerobnim i mikroaerofilnim
uslovima pri temperaturi od 37 C. Na vrstom hranljivom agaru kolonije su im okrugle, glatke,
ispupene i sjajne, od sive do tamno zlatno-ute boje.
Katalaza pozitivne i koagulaza pozitivne. Sporo fermentuju mnoge ugljene hidrate,
produkujui mlenu kiselinu bez gasa.
Soj Staphylococcus aureus otporan je na isuivanje i toplotu. Veina sojeva osetljiva je
na izlaganje temperaturi od 60
C po isteku 1 h, a neki mogu izdrati due vremena i na 80
C.
Tolerantni su prema visokim koncentracijama natrijum-hlorida i eera.
Soj S. aureus produkuje i oslobaa mnoge enzime i toksine; isti sintetie i intracelularne
i ekstracelularne metabolite. Enterotoksini (A-E, H, G i I) nalaze se u pokvarenim namirnicama;
nastaju vrlo brzo i otporni su na toplotu (ne denaturiu se na temperaturi od 100 C ni nakon
vie od 30 min); spadaju u superantigene.
S. aureus esto naseljava kou i sluzokou (pogotovo sluzokou nosa), pre svega kod
obolelih osoba. Bolesti koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne (nastaju prodorom
bakterije u organizam), intoksikacijske (bakterija ne prodire u organizam ve izluuje toksine
koji su odgovorni za nastale poremeaje; na primer, konzumiranje pokvarenih namirnica) ili
predstavljati njihovu kombinaciju.
Meticilin-rezistentni S.aureus posebni je soj ove bakterije nastao zbog uestale i
nekritike primene antibiotika. Soj MRSA izaziva infekcije kod hospitalizovanih bolesnika
oslabljenog imuniteta. Na ovu bakteriju deluje svega par antibiotika, tako da se strogo mora
voditi rauna o njihovoj upotrebi. MRSA pozitivni pacijenti trebalo bi da se izoluju i na taj nain
spree dalje irenje ove bakterije unutar bolnice (Jawetz et al., 1998; Mihajilov-Krestev, 2009).


13

3.1.7. Streptococcus agalactiae

Spada u familiju Streptococcaceae koja obuhvata aerobne Gram-pozitivne nepokretne
koke kraih ili duih lanaca.
Soj Streptococcus agalactiae pripada grupi B streptokoka. Predstavnik je normalne flore
genitalnog trakta ena i znaajan je uzronik neonatalne sepse i meningitisa. Tipino je -
hemolitian i stvara zone hemolize koje su malo vee od prenika kolonija. S. agalactiae
hidrolizuje natrijum hipurat i daje pozitivan CAMP test (Jawetz et al., 1998).

3.1.8. Enterococcus faecalis

Spada u familiju Enterococcaceae koja obuhvata fakultativno anaerobne Gram-pozitivne
nepokretne koke; soj Enterococcus faecalis pripada grupi D streptokoka.
Katalaza negativne. Fermentiu glukozu bez produkcije gasa. Rastu u temperaturnom
opsegu od 10 C do 45 C; obino su nehemolitine ili stvaraju zonu -hemolize; daju pozitivan
PYR test.
Rastu u prisustvu ui i 6.5 % natrijum-hlorida; hidrolizuju eskulin. Izrazito su rezistentne
na penicillin G. Preivljavaju temperaturu od 60 C preko 30 min.
Normalno nastanjuju enski genitalni trakt i crevni trakt ljudi i toplokrvnih ivotinja. Uzrokuju
urinarne infekcije, upalu une kese i endokarditis (Jawetz et al., 1998).


14

3.2. Sekundarni metaboliti prirodnog porekla
3.2.1. Avarol i avaron

U poslednjih est decenija iz morskih sunera izolovan je vei broj jedinjenja neobinih
hemijskih struktura koja nisu naena kod terestrinih organizama, meu kojima se istiu steroli
sa vrlo raznovrstnim bonim nizovima i seskviterpeniodni hidrohinoni i hinoni drimanskog i
preureenog drimanskog tipa (Sladi i Gai, 2006).
Filum Porifera (lat. porus pora, fini orvor; ferre nositi) odnosno Spongia (= suneri)
predstavlja najprimitivniju grupu ivotinja. Ime filuma u vezi je sa injenicom da je telo ovih
acelomatnih oblika ivotinja perforirano velikim brojem finih otvora pora, kroz koje
neprekidno tee voda (Radovi i Petrov, 2003). Suneri su preteno marinske sesilne ivotinje:
naime, samo mali broj vrsta ivi u slatkim vodama (Kruni, 1992). Radi se o sesilnim
beskimenjacima koji ive privreni za stene, ljuture raznih ivotinja ili neke druge objekte u
vodi, pojedinano ili u kolonijama. Karakteristini su za iste vode bez estica koje bi mogle da
zatrpaju ili zapue njihove pore; stoga se smatraju dobrim biomonitorima u morskom ekosistemu
(Radovi i Petrov, 2003). Fosilni ostaci pokazuju da su se svi tipovi sunera javili u toku
kambrijskog perioda, uz mogui izuzetak klase Calcarea (Bergquist, 1978). Veoma su
rasprostranjeni; zapravo, procenjuje se da ima oko 8000 vrsta svrstanih u etiri klase (Calcarea,
Hexactinellida, Sclerospongiae i Demospongiae); osnovne kriterijume u klasifikaciji sunera
ine hemijski sastav i struktura skeleta (Thakur i Mller, 2004). Njihova uspena evolutivna
istorija sunera u velikoj meri posledica je hemijske odbrane od predatora i konkurentskih
sesilnih organizama, kao to su korali (Radovi i Petrov, 2003).
Sesviterpenoidni hidrohinon avarol (do 1.5 % teine suve materije sunera, odnosno 2.7
g na kg svee materije; Slika 1) i odgovarajui hinon avaron (u manjoj koliini; Slika 1)
izolovani su iz mediteranskog sunera Dysidea avara (Schmidt, 1862) (Slika 2) (Minale et al.,
1974; De Rosa et al., 1976; Mller et al., 1986).


15

Avarol Avaron
Slika 1. Strukturne hemijske formule avarola i avarona. (Pejin, 2011).

Suner D.avara Schmidt pripada klasi Demonspongiae, redu Dictyoceratida i familiji
Dysideidae (Slika 2). Predstavnici ove vrste su ruiaste do ljubiaste boje; masivni ali meki;
povrina skeleta je gruba na dodir; pinakocite su veih dimenzija i meusobno su udanjene;
imaju leukonski tip grae. D. avara mediteranska je vrsta, a moe se nai i na razliitim
lokalitetima du obale zapadne Evrope. Dimenzije su im oko 25 x 15 x 5 cm. Povrina im je
obloena pinakocitima, veliine oko 4 mm sa razmacima od 2 5 mm. Ovakva graa daje im
mreast izgled. Prenik oskuluma na vrhu tela sunera iznosi 1 3 mm. Nemaju spikule. Polno
se razmnoavaju. Najee rastu na izolovanim mestima i bez makroskopskih simbionata
(Carballo et al., 1994).
Bioloka aktivnost avarola i avarona prouava se u paru jer je usled lakoe redoks
konverzije mogue prisustvo oba oblika. Utvreno je da ova jedinjenja pokazuju umerenu ali
selektivnu antibakterijsku (na Gram-pozitivne bakterije), antifungalnu, antiviralnu, citotoksinu i
antileukemijsku aktivnost in vitro i in vivo (Sladi i Gai, 2006). Avarol i avaron bili su
predmet opsenih studija zbog sposobnosti da efikasno inhibiraju replikaciju HIV virusa u in
vitro uslovima (Sarin et al., 1987). Meutim kod pacijenata obolelih od AIDS-a izostali su
rezultati koji bi upuivali na njihovu upotrebu u klinikoj praksi. U tzv. SAR studijama (od engl.
Structure-Activity Relationship studies) zapaeno je da nijedan od semisintetikih derivata

16

avarola i avarona nije pokazao veu anti-HIV aktivnost od poetnih jedinjenja tj. navedenih
sekundarnih metabolita (De Giulio et al., 1991). Meutim, veina njih pokazala je selektivnu
inhibiciju multiplikacije polio virusa (takoe RNK virusi), to prua mogunost za dalja
istraivanja. Kada je o ovoj grupi jedinjenja re, smatra se da je za inhibiciju aktivnosti HIV1
reverzne transkriptaze neophodno prisustvo hidroksilne grupe u orto poloaju prema karbonilnoj
grupi na hinonskom prstenu (Loya i Hizi, 1990).
Ovaj hidrohinonski/hinonski par poseduje i antiinflamatornu aktivnost; pretpostavlja se
da interferira sa arahidonskom kiselinom (Ferrndiz et al., 1994). Novija istraivanja ukazala su
na znaaj avarola, avarona i/ili njihovih derivata za psorijazu (De Rosa et al., 2008) i
Alchajmerovu bolest (Pejin et al., 2008; Pejin, 2011; Pejin, 2012e). Nijedan od ova dva
sekundarna metabolita vrste D. avara nije neurotoksian (Sladi i Gai, 2006).

Izvor:
http://www.natuurlijkmooi.net/adriatische_zee/sponzen
/dysidea_avara.htm

Izvor:
http://doris.ffessm.fr/fiche2.asp?fiche_
numero=790

Slika 2. Suner Dysidea avara (Schmidt, 1862).


17

Opte je poznato da suneri ive u obligatnoj simbiozi sa razliitim vrstama algi, gljiva,
briozoa i bakterija (Bergquist, 1978). Mller i saradnici (1986) utvrdili su, meutim, tano mesto
sinteze avarola i time ukazali da se radi o sekundarnom mebolitu datog sunera.
Pomou transmisione elektronske mikroskopije pokazali su da se u citoplazmatinim
vezikulama sferularnih elija nalaze granule koje upravo predstavljaju parakristalizovani avarol
(Slika 3). Naime, tenom hromatografijom utveno je da je avarol supstanca koja se nalazi u
sferularnim elijama; kvantitativnim metodama dolo se do podataka da 10
6
sferularnih elija
sadri 3.2 g avarola. Pored toga, avarol nije detektovan ni kod jednog bakterijskog soja
izolovanog iz vrste D. avara. Najverovatnije je da ovo jedinjenje ima funkciju u regulaciji
bakterijske flore u ekstracelularnom prostoru sunera, budui da poseduje antibakterijsku i
antifungalnu aktivnost. injenica da se pokazalo citotoksinim u in vitro skriningu mogla bi da
objasni podatak zbog ega je intracelularni avarol funkcionalno inaktiviran i smeten u posebnim
vakuolama.

Slika 3. Izgled sferularnih elija sunera Dysidea avara pod transmisionim elektronskim
mikroskopom. (Mller et al., 1986)

p parakristalizovani
avarol
n nukleus

- oslobaanje
parakristalnih materija

18

3.2.2. Fitol

Odreeni sastojci etarskih ulja razliitog biljnog porekla privukli su veliku panju kao
potencijalni antimikrobni agensi. Premda se ova ulja tradicionalno upotrebljavaju, njihov
antimikrobni potencijal i mehanizmi delovanja jo uvek nisu sasvim razjanjeni (Inoue et al.,
2005; Nikoli et al., 2013).
Etarska ulja predstavljaju kompleksne prirodne smee lako isparljivih produkata
sekundarnog metabolizma biljaka karakteristinog mirisa i ukusa. Ova prirodna organska
jedinjenja iz aromatinih delova biljaka obino se izoluju destilacijom pomou vodene pare
(Kovaevi, 2004), dok im se identifikacija zasniva na instrumentalnim metodama, gasnoj
hromatografiji i gasnoj hromatografiji-masenoj spektrometriji.
Mogu se nai u razliitim delovima biljaka (korenu, rizomu, stablu, semenu, listovima,
cvetovima i plodovima) u koliini koja zavisi od same vrste; u najveem procentu obino su
zastupljeni u listu i cvetu. U pojedinim etarskim uljima identifikovano je i preko 200
komponenti, dok neke sadre praktino samo jedno jedinjenje. Po pravilu, u slobodnom su
obliku i nalaze se u lezdama, lezdanim ljuspama i dlakama, kao i u sekretornim elijama
(Mihajilov-Krstev, 2009).
Preliminarna analize etarskog ulja mahovine Rhodobryum ontariense (Kindb.) (Slika 4)
ukazala je na prisustvo diterpenskog alkohola fitola (Slika 5) kao glavnog sastojaka (Pejin et al.,
2011). Ova biljna vrsta pripada klasi Bryopsida, redu Bryales i familiji Bryaceae. iroko je
rasprostranjena i najee raste na suvim, toplim i krenjakim zemljitima; poto je ujedno i
retka vrsta, moe se rei da joj je areal veliki ali ratrkan (Pejin, 2011).

19

Slika 4. Mahovina Rhodobryum ontariense. Na kineskom jeziku Hui Xin Cao .
Izvor: Pejin et al., 2011.

Kao biljni lek iz tradicionalne medicine, mahovine iz roda Rhodobryum prvenstveno se
sakupljaju i koriste u Junanu (provincija jugozapadne Kine) za srane i neuroloke probleme
(Pejin, 2011). Pored isparljivih komponenti, za vrstu R. ontariense utvreno je prisustvo ugljenih
hidrata (Pejin et al., 2012a,b), masnih kiselina (Pejin et al., 2012c), minerala (Pejin et al., 2013) i
tekih metala (Pejin et al., 2012d).

Prema hemijskoj strukturi, fitol (molekulska formula C
20
H
40
O), se ubraja u acikline
nezasiene diterpenske alkohole (Petrovi et al., 2005).
Aktivni je sastojak patenata koji sniavaju nivo triglicerida i/ili holesterola (Olofsson et
al., 2009); smatra se i da povoljno utie na odravanje normalnog nivoa holesterola kod zdravih
osoba. Pored toga, odlikuje se antiradikalskom aktivnou u in vitro uslovima (Santos et al.,
2013).
Slika 5. Strukturna hemijska formula fitola.
(Izvor: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phytol_Formulae.png)


20

Malo je podataka u literaturi za antimikrobnu aktivnost fitola. Rajab i saradnici (1998)
ukazali su na vrednost minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) od 2 g/ml spram soja
Mycobacterium tuberculosis za (E)-fitol, (Z)-fitol i komercijalno dostupnu smeu (E) i (Z)-fitola
u odnosu 2:1, respektivno. Derivati (E)-fitol acetata, smea (2S,3S)- i (2R,3R)-izomera (E)-fitol
epoksida i (3R,S,7R,11R)-fitanska kiselina pokazali su bolju antimikrobnu aktivnost sa
vrednostima za MIC od 8 g/ml, 16 g/ml i >128 g/ml, respektivno. Zapaeno je da je
aktivnost (E)-fitola i (Z)-fitola bila uporediva sa aktivnou etambutola, leka u klinikoj upotrebi.
Pored toga, vredno je pomena da se novi estar (E)-fitol-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-eicosapentaenoat
prirodnog porekla odlikuje antibakterijskom aktivnou prema soju Staphylococcus aureus (zona
inhibicije >4 mm), Staphylococcus epidermidis (zona inhibicije >2 mm), Salmonella
typhimurium (zona inhibicije >2 mm) i Proteus vulgaris (primetna zona inhibicije) (Findlay i
Patil, 1984).


21

4 Materijal i metode

4.1. Bioloki materijal

4.1.1. Suner Dysidea avara

Suner Dysidea avara sakupljen je u Bokokotorskom zalivu (Crna Gora), ronjenjem na
dubini od 5 m do 15 m. Vauer primerak date vrste uva se u Institutu za biologiju mora u
Kotoru.

4.1.1. Test kulture mikroorganizama

Od referentnih bakterijskih kultura (ATCC American Type Culture Collection) koriene su
dve Gram-negativne (Escherichia coli ATCC
11229
i Pseudomonas aeruginosa ATCC
9027
) i pet
Gram-pozitivnih (Bacillus cereus ATCC
11778
, Sarcina lutea ATCC
9341
, Clostridium sporogenes
ATCC
19404
, Enterococcus faecalis ATCC
19433
i Staphylococcus aureus ATCC
25923
) iz kolekcije
kultura Mikrobioloke laboratorije Departmana za biologiju i ekologiju Prirodno-matematikog
fakulteta Univerziteta u Novom Sadu. Od izolata, koriena su dva humana patoloka bakterijska
soja poreklom iz vaginalnog brisa (Staphylococcus aureus 5485 i Streptococcus agalactiae
5492), poreklom iz Medicinske laboratorije BIOTEST, Novi Sad.

4.2. Ispitivane supstance

Avarol je izolovan iz morskog sunera D. avara, dok je avaron dobijen oksidacijom
avarola pomou A
g2
O u etanolu (Minale et al., 1974; De Rosa et al., 1976). Po 1 mg obe
supstance (u kristalnom obliku) rastvoren je u 1 ml 97 % etanola, kako bi se dobila poetna
koncentracija (1 mg/ml).
Diterpenski alkohol fitol nabavljen je u tenom stanju od komercijalnog proizvoaa
(Sigma-Aldrich, Nemaka).


22

4.3. Bakterijske suspenzije i standardizacija inokuluma

Skrining antibakterijske aktivnosti uraen je po standardnoj Kirbi-Bauer-ovoj
proceduri. Priprema bakterijskih suspenzije uraena je na 0.5 po McFarland-u. Prethodno su
bakterijske stock kulture osveene presejavanjem referentnih sojeva na hranljive podloge
Meller Hinton agara u Perti ploama.
Iz sveih bakterijskih kultura (18-24), inkubiranih na 37 C preko noi, uzet je deo
bakterijske kolonije pomou prethodno sterilisane bakterioloke eze. Izrasla bakterijska kultura
zatim je suspendovana u epruvetama sa 0.9 % NaCl (fiziolokim rastvorom). Homogeni rastvor
suspenzije dobijen je upotrebom vorteksa (IKA, Nemaka). Suspenzija je napravljena po
McFarland standardu 0.5; aproksimativna brojnost bakterija procenjuje se iz njene gustine (CFU
- 1.5 10
8
/ml) (Norell i Messley, 1997). Gustina suspenzije odreena je kolorimetrijski
uporeujui svee napravljenu bakterijsku suspenziju i McFarland 0.5 standard koji odgovara
zamuenju nastalom u reakciji izmeu 99.5 ml 0.1 M rastvora H
2
SO
4
i 5ml rastvora 0.2 M
barijum-hlorida dihidrata (BaCl
2
2H
2
O). U ovom sluaju zamuenje je podeavano
fotoelektrinim fotometrom pri emu je korien crveni filter (KOLORIMETER MA 9504
Metrix). Ovako dobijena bakterijska suspenzija omoguava semikonfluentan rast
mikroorganizama na hranljivoj podlozi. elije rastu u formi kontinuiranog tepiha u Petri ploi.

Fotoelektrina fotometrija spada u najprimenjenije optike apsorpcione tehnike. Ova
metoda slui za kvantitativno odreivanje i zasniva se na merenju intenziteta proputene
svetlosti, odnosno apsorbancije (A) ili transmisije (T), uz prethodno eksperimentalno definisanu
funkcionalnu vezu ovih veliina od koncentracije (Krsti i Marjanovi, 1998).

Potom je po 100 l pripremljene bakterijske suspenzije sterilnom automatskom pipetom
preneeno u epruvete sa 9.9 ml dvostruko koncentrovanog Meller Hinton bujona, prethodno
sterilisanog u autoklavu (121 C, 20 min). Na ovaj nain dobijen je odnos od 1:100, koji
odgovara finalnoj gustini bakterijske suspenzije od 2 10
6
CFU/ml.


23

4.4. Minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna (MBC) koncentracija

Za odreivanje minimalne inhibitorne (MIC) i minimalne baktericidne (MBC)
koncentracije antimikrobnog agensa uraen je antimikrobni skrining pomou mikro-dilucione
metode, koja podrazumeva meanje serije dvostrukih razblaenja testiranih uzoraka sa podlogom
koja je prethodno inokulisana test organizmom (Berghe i Vlietinck, 1991).
Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) predstavlja najniu koncentraciju ispitivane
supstance pri kojoj dolazi do inhibicije vidljivog rasta testiranih sojeva mikroorganizama
(oitavanjem suspenzije koja nema zamuenja u hranljivom bujonu Meller Hinton). Minimalna
baktericidna koncentracija (MBC) predstavlja koncentraciju agensa koja ubija vie od 99.9 %
elija poetnog inokuluma ispitivanog mikroorganizma (dobija se po zasejavanju radnih proba
na nove ploe hranljivog agara, a na osnovu broja izraslih kolonija nakon subkultivacije od
vrednosti MIC pa nanie) (Clinical Laboratory Standards CLSI, 2005).

4.5. Procena vrednosti MIC i MBC

Procena vrednosti MIC i MBC utvrena je u sterilnim polipropilenskim mikrotitar
ploama sa 96 bunaria zapremine od 350 l (Spektar, aak, Srbija) u dva ponavljanja, za
svaki bakterijski soj.
U svaki prvi vel (bunari) doda se po 90 l dH
2
O dok se u ostale, osim poslednjeg, doda
po 50 l. Potom se u prvi vel doda po 10 l ispitivane supstance poetne koncentracije 1mg/ml
(osnovni rastvor), a zatim su pravi serija dvostrukih razblaenja, tako to se sterilnom
automatskom pipetom iz prethodnog vela uzima po 50 l prvog razblaenja i prenosi se u sledei
vel u nizu, sve do desetog vela, odakle se izbaci koliina od 50 l kako bi zapremina bila jednaka
u svim bunariima. U svaki vel zatim se dodaje po 50 l MHB inokulisanog prethodno
pripremljenom standardnom suspenzijom testirane kulture (Slika 6). Na ovaj nain u prvom velu
dobija se finalna koncentracija od 12.5 l/ml, dok se u drugom velu u nizu zbog dvostrukog
razblaenja podloge, koncentracija ispitivane supstance dvostruko smanjuje to u finalnoj
koncentraciji iznosi 6.25 l/ml i tako redom, sve do desetog vela, gde se nalazi najnia
koncentracija ispitivane supstance, koja je iznosila 0.02 l/ml (Tabela 1).


24

Pored radnih proba, u kojima su testirana antibakterijska dejstva ispitivanih supstanci, raene su i
tri kontrole: kontrola rasta test organizma, kontrola ispitivane supstance i kontrola rastvaraa
(kontrola etanola).

1. Kontrola rasta test organizma: sadri 50 l MHB inokulisanog sa odgovarajuim test
organizmom i 50 l dH
2
O, sa ciljem kontrole rasta i vitalnosti bakterijskog soja. Ne
sadri ispitivanu supstancu.

2. Kontrola ispitivane supstance: sadri 50 l MHB bez bakterijske kulture, 40 l dH
2
O i
10l ispitivane supstance iz osnovnog rastvora. Predstavlja kontrolu uticaja supstance
(antibakterijskog agensa) na podlogu i ne sadri bakterije.

3. Kontrola rastvaraa: sadri 50 l MHB inokulisanog sa odgovarajuim test
organizmom, 45 l dH
2
O i 5 l 97 % etanola. Predstavlja kontrolu uticaja rastvaraa na
rast test organizama.

U svim velovima, radne probe ili kontrolne probe, ukupna zapremina smee u
bunariima iznosila je 100 l. Mikrotitar ploe zatim su poklopljene inkubirane u termostatu na
37 C u trajanju od 24 h.


25

Slika 6. Mikrotitar ploa sa inokulisanin hranljivim bujonom (Meller
Hinton), tretiranih serijom duplih razblaenja avarona (12.50-0.02 g/ml).

Nakon isteka inkubacije od 24 h oitani su rezultati. MIC vrednost utvruje se vizuelno
uporeivanjem sa kontrolom rasta test organizma i predstavlja prvu koncentraciju ispitivane
supstance u bunariu pri kojoj nema zamuenja odnosno precipitacije (uoljivog rasta). Za
procenu MBC potrebno je iz komorica, u kojima je procenjeno odsustvo rasta bakterija, prebaciti
sadraj, u ovom sluaju po 100 l, na Petri ploe sa Meller Hinton agarom. Zasejane Petri ploe
zatim se odloe u termostat na 37 C tokom naredna 24 h. Nakon inkubacije prebroje se kolonije
izraslih bakterija na Petri ploama.


26

Tabela 1. Finalne koncentracije avarola, avarona i fitola u mikrotitar ploama.

Oznake radnih
koncentracija
Finalne koncentracije ispitivanih
supstanci (g/ml)
C1 12.50
C2 6.25
C3 3.12
C4 1.56
C5 0.78
C6 0.39
C7 0.19
C8 0.10
C9 0.05
C10 0.02

4.6. Osetljivost kultura na standardne antibiotike

U cilju odreivanja osetljivosti kultura na standardne antibiotike i poreenja vrednosti
ispitivanih supstanci za MIC i MBC sa odgovarajuim vrednostima komercijalnih tj. standardnih
antibiotika gentamicina i ampicilina, naknadno su testirane kulture standardnom Kirby-Bauer-
ovom metodom u Petri ploama, kao i mikro/dilucionom metodom, za svaki bakterijski soj u dva
ponavljanja.

4.7. Priprema serije razreenja gentamicina i ampicilina

Serije dvostrukih razblaenja standardnih antibiotika napravljena su u opsegu koncentracija
od 20 - 0.16 g/ml i 128 - 1 g/ml za gentamicin i ampicilin, respektivno (za oba antibiotika,
ukupno po 8 koncentracija) (Tabela 2).
Za pripremu odgovarajuih koncentracija antibiotika koriene su sterilne mikrokivete
('ependorfice') od 1 ml u kojima je, pri sterilnim uslovima, dodato po 500 l sterilne dH
2
O. Kod
oba antibiotika u prvoj ependorfici zapremina sterilne dH
2
O iznosila je 900 l da bi pri
dodavanju 100 l odgovarajueg antibiotika iz osnovnog rastvora (njegova koncentracija bila je

27

256 mg/ml i 40 mg/ml za ampicilin i gentamicin, respektivno) dobili eljenu poetnu
koncentraciju u odnosu 1:10. Pomou serije dvostrukih razblaenja napravljene su ostale finalne
radne koncentracije standardnih antibiotika. Iz ependorfice sa odgovarajuim koncentracijama
antibiotika zatim je preneena potrebna zaprremina radne probe od 100 l i implicirana u velove
mikrotitar ploa sa po 100 l MHB inokulisanim test bakterijama. Prva radna koncentracija kod
gentamicina bila je 20 g/ml, a kod ampicilina 128 g/ml.

Tabela 2. Finalne koncentracije referentnih antibiotika u mikrotitar ploama.

Radne koncentracije
antibiotika
Gentamicin (g/ml) Ampicilin (g/ml)
C1 20 128
C2 10 64
C3 5 32
C4 2.50 16
C5 1.25 8
C6 0.62 4
C7 0.31 2
C8 0.16 1

4.8. Odreivanje osetljivosti bakterija na antibiotike

Zbog odreivanja osetljivosti bakterija na standardne antibiotike primenjena je disk-
difuziona Kirby-Bauer-ova metoda, koja se bazira na primeni diskova sa odreenim
koncentracijama antibiotika (najee 10-40 g) na agarizovanoj hranljivoj podlozi Meller
Hinton prethodno zasejanoj sa odreenom test bakterijom.
Nakon inkubacije u termostatu (37 C, 24 h), izmeri se prenik zone inhibicije
(oitavanjem zone oko diska sa postavljenim antibiotikom); isti se smatra merom inhibitorne
aktivnosti antibiotika tj. osetljivosti bakterije na odreeni antibiotik.
Prilikom odreivanja osetljivosti bakterija standardnom disk-difuzionom metodom, u
veini sluajeva koriste se diskovi sa antibiotikom odreene koncentracije, koje variraju u

28

zavisnosti od antibiotika. U ovom radu upotrebljeni su standardni diskovi (Torlak, Beograd), kao
i diskovi sa imipenemom (APP Pharmaceuticals, LLC) i tobramicinom (Akorn - Strides, LLC).
Upotreba diskova sa antibiotikom, uz standardizaciju uslova izvoenja testa, omoguuje
da se proceni da li je mikroorganizam osetljiv ili rezistentan na odgovarajui antibiotik
poreenjem veliina inhibitorne zone sa referentnim vrednostima u specifikaciji proizvoaa
(Jawetz et al., 1998).
Prethodno pripremljene i sterilisane Petri ploe sa Meller Hinton agarom inokulisane su
ispitivanim bakterijskim sojevima, a zatim je uraena inokulacija sa po 200 l pripremljenih
suspenzija test mikroorganizama (bakterijska suspenzija turbiditeta 0.5 McFarland-a koja sadri
1.5 10
6
CFU/ml) i razmazano je sterilnim staklenim tapiem. Po postavljenju diskova sa
antibioticima, Petri ploe odloene su u inkubator na 37 C, u trajanju od 18-24 h. Nakon isteka
vremena inkubacije rezultati su oitavani merenjem prenika zone inhibicije rasta bakterija i
izraeni su u mm.


29

5. Rezultati i diskusija

U ovom master radu uraen je in vitro 'skrining' antibakterijske aktivnosti tri odabrana
terpena koja se javljaju u prirodi (avarol, avaron i fitol) na devet bakterijskih sojeva (dva
Gram-negativna i sedam Gram-pozitivnih) razliitog porekla. Naime, datim 'skriningom'
obuhvaeno je sedam referentnih bakterijskih kultura (ATCC), kao i dva humana patoloka
izolata.
Sve tri ispitivane supstance pokazale su se aktivnim prema Gram-pozitivnim bakterijama,
ali u razliitoj meri (Tabela 3).

5.1. Avarol i avaron

Moe se uoiti da su avarol i avaron pokazali visoku antibakterijsku aktivnost na
Gram-pozitivne bakterije inhibirajui rast bakterija (u zavisnosti od karakteristika samih kultura)
ve pri koncentracijama od 0.78 g/ml (B. cereus i S. lutea) preko koncentracije 1.56 g/ml
(Cl. sporogenes, E. faecalis, S. aureus) do 12.5 g/ml za humane patoloke kulture koje su,
inae, pokazale najveu rezistenciju prema njima (Tabela 3), kao i prema standardnim
antibioticima (Tabela 4). Posebno je znaajno uoiti da su sve MIC vrednosti koncentracija
prema atestiranim kulturama analiziranih Gram-pozitivnih bakterija bile za dva do etiri puta
nie od vrednosti dobijenih za referentne antibiotike (ampicilin i gentamicin), to upuuje na
eventualnu mogunost njihove primene kao antibiotika u budunosti. Pri tome, sve testirane
Gram-pozitivne bakterije bile su osetljivije na ampicilin (u poreenju sa gentamicinom), sem u
sluaju humanog izolata S. aureus koji je ispoljio multirezistenciju i u standardnom antibiogram
testu (Tabela 4).
Takoe je primeeno da su testirane Gram-negativne bakterije E. coli i P. aeruginosa bile
neosetljive na uticaj ispitivanih supstanci, to je u skladu sa rezultatima prethodnih istraivaa.
Naime, antibakterijska aktivnost avarola i avarona bila je predmet dosadanjih istraivanja koja

30

su ukazala na njihovu umerenu, ali selektivnu aktivnost prema Gram-pozitivnim bakterijama
(Gai, 1988; Cozzolino et al., 1990; Pejin et al., 2008; Boi et al., 2010). Isto se potvrdilo i u
eksperimentu obuhvaenim ovim radom.

Prema Boi i saradnicima (2010), u sluaju soja S. aureus vrednost MIC za avarol iznosi
12.50 g/ml, a za avaron 6.25 g/ml. Pejin i saradnici (2008) istakli su da avarol i avaron
inhibitorno deluju na B. subtilis i M. luteus (25 g/ml i 10 g/ml & 10 g/ml i 1 g/ml,
respektivno). U ranijoj studiji na temu antimikrobne aktivnosti ovog redoks para (Seibert et al,
1985), izmeu ostalog, dolo se do zakljuka da je najvea antibakterijska aktivnost uoena
prema sojevima Streptococcus pneumoniae i Erysipelothrix rhusiopathiae (MIC 0.781 mg/l), kao
i to da je avaron bio aktivniji od avarola prema testiranim Gram-pozitivnim sojevima.

Generalno, avarol i avaron pokazali su veu antibakterijsku aktivnost od fitola: vrednosti za
MIC u opsegu su im od 0.78 g/ml do 3.12 g/ml, a za MBC od 3.12 g/ml do 12.50 g/ml.
Trebalo bi istai da su date vrednosti u sluaju referentnih bakterijskih kultura praktino
identine, to se moe objasniti lakoom konverzije avarona u avarol. S druge strane, uoljiva je
razlika u delovanju ovih marinskih prirodnih proizvoda na referentne i patoloke bakterijske
sojeve. Naime, rast S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492 inhibiran je tek pri koncentraciji od
12.50 g/ml, dok su relevantne MBC vrednosti iznad 12.50 g/ml, tj. najvee radne
koncentracije (Grafik 1 i Grafik 2). Naime, bakterijski sojevi iz patolokog materijala
vaginalnog brisa pokazali su se rezistentnijim od referentnih elijskih kultura, tj. manje
osetljivim na supstance sa antibiotskom aktivnou. Konkretno, u ovom master radu soj
S. aureus 5485 pokazao se rezistentnim prema svim testiranim antibioticima (Tabela 4).
Vrednosti avarola i avarona za MIC ukazuju da bi njihovi derivati mogli inspirisati razvoj novih
bioaktivnih agenasa na rezistentne sojeve ukljuujui S. aureus 5485, ukoliko bi imali vei
terapeutski indeks tj. bolju antibakterijsku aktivnost od datog redoks para.


31

Grafik 1. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) avarola (MIC AOL), avarona (MIC AON) i
referentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) na testirane Gram-pozitivne
bakterije.
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
MIC AOL
MIC AON
MIC GEN
MIC AMP

32

5.2. Fitol

U poreenju sa sekundarnim metabolitima sunera D. avara (avaronom i avarolom), fitol
se pokazao manje efikasnim i spram standardnih bakterijskih kultura i spram klinikih izolata
(Tabela 3). Najvea inhibitorna aktivnost uoena je na sojeve E. faecalis i S. aureus (MIC 1.56
g/ml), a najmanja na sojeve S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492 (MIC 12.50 g/ml) (Grafik 3).
Kada je o odgovarajuim vrednostima za MBC re, one su ili 12.50 g/ml (sojevi B. cereus, S.
aureus, E. coli i P. aeruginosa) ili iznad date vrednosti (sojevi S. lutea, S. sporogenes,
E. faecalis, S. aureus 5485 i S. agalactiae 5492), to ukazuje na podatak da maksimalna radna
koncentacija (12.50 g/ml) prema naznaenim bakterijama nije imala baktericidnu aktivnost
(Grafik 4).

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona (MBC
AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane
Gram-pozitivne bakterije.

Grafik 2. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) avarola (MBC AOL), avarona (MBC
AON) i referentnih antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane
Gram-pozitivne bakterije.
1
2
4
8
16
32
64
128
MBC AOL
MBC AON
MBC GEN
MBC AMP
1
2
4
8
16
32
64
128
MBC AOL
MBC AON
MBC GEN
MBC AMP

33

Za razliku od pomenutih seskviterpena, diterpen fitol bio je aktivan prema
Gram-negativnim bakterijama: dok su mu vrednosti MBC jednake za oba soja (12.50 g/ml),
odgovarajue vrednosti za MIC identine (12.50 g/ml i 6.25 g/ml, respektivno).
U Japanu Inoue i saradnici (2005) ispitivali su aktivnost odreenih diterpena
(geranilgeraniola, terpenona i fitola) na rast soja S. aureus. Utvrdili su da fitol pokazuje
bakteriostatsku aktivnost u opsegu od 1.25 g/ml do 40 g/ml, a baktericidnu aktivnost od 10 do
80 g/ml. U ovom radu utvreno je da se njegova minimalna inhibitorna vrednost na rast soja
S. aureus ispoljava pri koncentraciji od 1.56 g/ml, dok mu odgovarajua vrednost za MBC
iznosi 12.50 g/ml.

Veliki broj studija ukazuje da razliiti bakterijski sojevi uzrokuju infektivni endokarditis
(IE), zapaljenski proces na sranim zaliscima i drugim strukturama srca izazvan infektivnim
agensima. Meu najee uzronike IE ubraja se soj S. aureus (Yeaman i Bayer, 2000). Izmeu
ostalog, konstatovano je da ovaj zapaljenski proces mogu izazvati i sojevi B. cereus (Steen et al.,
1992), Clostridium sp. (Koch i Estrella, 1999), E. faecalis (Dahl et al., 2013), E. coli (Lauridsen
et al., 2011) i P. aeruginosa (Dawson et al., 2011). Uzimajui u obzir upotrebu mahovine
R. ontariense u etno medicini moe se pretpostaviti da je fitol jedan od njenih kardioprotektivnih
hemijskih konstituenata, delom i zbog svoje umerene antibakterijske aktivnosti.
U nedavnom skriningu antimikrobne aktivnosti dimetil-sulfoksidnog ekstrakta biljne
vrste R. ontariense (osam bakterijskih sojeva; modifikovana mikrodiluciona tehnika) naeno je
da se vrednosti za MIC i MBC kreu u opsegu od 1 mg/ml do 3 mg/ml (Pejin et al., 2012). Dalja
ispitivanja odnosila su se na aj od pomenute mahovine tj. liofilizovani vodeni ekstrakt; dobijene
vrednosti za MIC (0.62 - 6.00 mg/ml) i MBC (2.50 - 8.00 mg/ml) vie su od odreenih za njen
dimetil-sulfoksidni ekstrakt (Pejin et al., 2013). Fitol je, meutim, pokazao znatno veu
antibakterijsku aktivnost od oba ekstrakta, to je podatak koji ne iznenauje, s obzirom da se
iste supstance, po pravilu, odlikuju potentnijom biolokom aktivnou od ekstrakata i / ili
njihovih frakcija.

34

Grafik 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (g/ml) fitola (MIC FIT) i r
eferentnih antibiotika gentamicina (MIC GEN) i ampicilina (MIC AMP) n
a testirane bakterije.

1
2
4
8
16
32
64
128
MIC FIT
MIC GEN
MIC AMP


35

Grafik 4. Minimalne baktericidne koncentracije (g/ml) fitola (MBC FIT) i referentnih
antibiotika gentamicina (MBC GEN) i ampicilina (MBC AMP) na testirane bakterije.
1
2
4
8
16
32
64
128
MBC FIT
MBC GEN
MBC AMP

36

Tabela 3. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne koncentracije (MBC) ispitivanih supstanci

Test organizmi
Ispitivane supstance Referentna vrednost antibiotika
Avarol Avaron Fitol Gentamicin Ampicilin

MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml) MIC(g/ml) MBC(g/ml)
B.cereus
ATCC11778

0.78 3.12 0.78 3.12 6.25 12.50 2.50 10 2 4
S.lutea
ATCC9341
0.78 6.25 0.78 6.25 6.25 12.50 2.50 20 2 2
Cl.sporogenes
ATCC19404 1.56 12.50 1.56 12.50 3.12 12.50 2.50 20 64 128
E.faecalis
ATCC19433
1.56 6.25 3.12 12.50 1.56 12.50 5 20 16 128
S.aureus
ATCC25923
1.56 12.50 1.56 6.25 1.56 12.50 2.50 10 8 128
S.aureus 5485
12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 20 20 ND ND
S.agalactiae

5492
12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 12.50 20 20 32 128
E.coli
ATCC11229 ND ND ND ND 12.50 12.50 2.50 10 64 128
P.aeruginosa
ATCC 9027

ND ND ND ND 6.25 12.50 NT NT NT NT
Legenda: ND: ne deluje; NT: nije testiran; : vie od.


37

Tabela 4. Osetljivost test mikroorganizama prema konvencionalnim antibioticima.

Testirani bakterijski
sojevi
Ispitivani antibiotici
Cef.
(30 g)
Kan.
(30 g)
Met.
(10 g)
Azit.
(15 g)
Ceft.
(30 g)
Cefta.
(30 g)
Tet.
(30 g)
Cefa.
(30 g)
N.K
(30 g)
Imip.
(10 g)
Tob.
(10 g)

B.cereus
ATCC11778
R S S NT R R S I S S S
S.lutea
ATCC9341
R R R R R R R R R S R
Cl.sporogenes
ATCC19404
R R R NT R R R R R S S
E.faecalis
ATCC19433
R I R S R R S R R S S
S.aureus
ATCC25923
S S S NT S R S S R S S
S.aureus 5485 R R R R R R R R R R R
S.agalactiae 5492 I R R R R R R R R S R
E.coli
ATCC11229
S I R R S I R R R S S
Legenda: Cef.-Cefotaksim ( 23 S; 18-22 I; 17 R); Kan.-Kanamicin ( 26 S; 23-25 I; 22 R); Met.-Meticilin ( 21S; 20-17 I; 16 R); Azit.-Azitromicin ( 19; 18-15 I; 14);
Ceft.-Ceftriakson ( 16 S; 13-15 I; 12 R); Cefta.-Ceftazidim ( 19 S; 18-17 I; 16 R); Tet.-Tetraciklin ( 26S; 23-25 I; 22 R); Cefa.-Cefahlor ( 20 S; 19-15 I; 14 R); N.K.-
Nalidiksinska kiselina ( 26 S; 25-23 I; 22 R); Imip.-Imipenem ( 20 S; 19-17 I; 16 R); Tob.-Tobramicin ( 15 S; 13-14 I; 12 R).
NT nije testirano.

38

6. Zakljuak

Avarol i avaron glavni su sekundarni metaboliti sunera D. avara (Minale et al., 1974;
De Rosa et al., 1976). Njihova raznolika bioaktivnost (Gai, 1988; Sladi i Gai, 2006; Pejin
et al., 2008), niska toksinost na mieve (20 % smrtnosti pri dozi od 1g / kg)
(De Pasquale et al., 1991) i odsustvo sporednih efekata kod ljudi pri dozi od 3 mg/kg (Mller
et al., 1987) ini ih dobrim kandidatima za razvoj novih terapeutskih agenasa. Datu tvrdnju
podupiru i podaci da ova jedinjenja nisu ni direktni mutageni ni promutageni ve ih, naprotiv,
karakterie antimutagena aktivnost (Kurelec et al., 1985), kao i penetracija kroz krvno-
modanu barijeru (Mller et al., 1986).
Rezultati proistekli iz ovog rada ukazuju na njihov znaajan antibakterijski potencijal, u
prvom redu na soj B. cereus, koji je vei od pozitivnih kontrola, antibiotika gentamicina i
ampicilina. Identine vrednosti ovih jedinjenja za MIC i MBC prema datoj bakteriji verovatno
potiu od lake konverzije avarona u avarol. Dalja istraivanja mogla bi da obuhvate
semisinteze novih derivata avarola i avarona i testiranje njihove antibakterijske aktivnosti kako
bi se pomou SAR studija dolo do vanih zakljuaka o odnosu izmeu hemijske strukture i
odreene bioaktivnosti. Takoe, in vitro antibakterijski skrining ovih marinskih prirodnih
proizvoda mogao bi se proiriti (na do sada neobuhvaene sojeve), a bilo bi koristno testirati ih
i u in vivo uslovima.
Fitol se smatra najrasprostranjenijim aciklinim izoprenoidnim jedinjenjem u prirodi
(Daines et al., 2003), a novija istraivanja istiu njegov medicinski potencijal i znaaj (Santos
et al., 2013). Eksperimentalni podaci do kojih se dolo u ovom radu predstavljaju doprinos
izuavanjima ne samo njegove antimikrobne aktivnosti, ve i kardioprotektivnog efekta.
Naime, fitol je pokazao relevantnu antibakterijsku aktivnost na sojeve koji mogu biti ukljueni
u patologiju infektivnog miokarditisa, na prvom mestu prema bakterijama S. aureus i E.
faecalis. Izmeu ostalog, dalja istraivanja trebalo bi usmeriti ka ispitivanju mehanizma
njegovog dejstva na pomenute sojeve i antibakterijskom skriningu u in vivo uslovima.


39

7. Literatura

Alanis, J.A. (2005). Resistance to antibiotics: are we in the post antibiotic era? Archieves of
Medical Research, 36: 697705.

Beovi, B. (2006). The issue of antimicrobial resistance in human medicine. International
Journal of Food Microbiology, 112: 280287.

Berghe, A.D. & Vlietnick, A.J. (1991). Screening methods for antimicrobial and antiviral
agents from higher plants. Methods in Plant Biochemistry, 6: 4769.

Bergquist, P.R. (1978). Sponges. University of California Press.

Boi, T., Novakovi, I., Gai, M.J., Jurani, Z., Stanojkovi, T., Tufegdi, S., Kljaji, Z. &
Sladi, D. (2010). Synthesis and biological activity of derivatives of the marine quinone
avarone. European Journal of Medicinal Chemistry, 45: 923929.

Carballo, J.L., Snchez-Moyano, J.E. & Garca-Gmez, J.C. (1994). Esponjas del Estrecho de
Gibraltar. I. Esponjas crneas. Graellsia, 50: 3556.

Cozzolino, B., De Giulio, A., De Rosa, S., Strazzullo, G., Gai, M.J., Sladi, D. & Zlatovi,
M. (1990). Biological activities of avarol derivatives, 1. amino derivatives. Journal of Natural
Products, 53: 699702.

Dahl, A., Rasmussen, R.V., Bundgaard, H., Hassager, C., Bruun, L.E., Lauridsen, T.K., Moser,
C., Sogaard, P., Arpi, M. & Bruun, N.E. (2013). Enterococcus faecalis infective endocarditis: a
pilot study of the relationship between duration of gentamicin treatment and outcome.
Circulation, 127: 18101817.


40

Daines, A.M., Payne, R.J., Humphries, M.E. & Abell, A.D. (2003). The synthesis of naturally
occurring vitamin K and vitamin K analogues. Current Organic Chemistry, 7: 16251634.

Dawson, N.L., Brumble, L.M., Pritt, B.S., Yao, J.D., Echols, J.D. & Alvarez, S. (2011). Left-
sided Pseudomonas aeruginosa endocarditis in patients without injection drug use. Medicine
(Baltimore), 90: 250255.

De Giulio, A., De Rosa, S., Strazzullo, G., Diliberto, L., Obino, P., Marongiu, M.E., Pani, A. &
La Colla, P. (1991). Synthesis and evaluation of cytostatic and antiviral activities of 3' and 4'-
avarone derivatives. Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 2: 223227.

De Pasquale, R., Circosta, C., Occhiuto, S., De Rosa, S. & De Stefano, S. (1991).
Pharmacological studies on terpenoids from marine sponges: analgesic and muscle relaxant
effects. Phytotherapy Research, 5: 4953.

De Rosa, S., Minale, L., Riccio, R. & Sodano, G. (1976). The absolute configuration of avarol,
a rearranged sesquiterpenoid hydroquinone from a marine sponge. Journal of the Chemical
Society, Perkin Transactions 1, 1: 14081414.

De Rosa, S., Pejin, B. & Tommonaro, G. (2008). Anti-inflammatory marine natural products
with antipsoriatic effects, 4
th
International Conference on Oxidative Stress in Skin Medicine
and Biology, Andros, Greece, September 11-14, Book of Abstracts, p. 53.

Ferrndiz, M.L., Sanz, M.J., Bustos, G., Pay, M., Alcaraz, M.J. & De Rosa S. (1994). Avarol
and avarone, two new anti-inflammatory agents of marine origin. European Journal of
Pharmacology, 253: 7582.

Findlay, J.A. & Patil, A.D. (1984). Antibacterial constituents of the diatom Navicula delognei.
Journal of Natural Products, 47: 815818.


41

Gai, M.J. (1988). Biologically active compounds from marine sponges: an approach to
chemical and biochemical characterization of the avarol/avarone redox couple. Journal of the
Serbian Chemical Society, 53: 229249.

Inoue, Y., Hada, T., Shiraiski, A., Hirose, K., Hamashima, H. & Kobayashi, S. (2005).
Biphasic effects of geranylgeraniol, teprenone and phytol on the growth of Staphylococcus
aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49: 17701774.

Jawetz, E., Melnick, J.L. & Adelberg, E.A. (1998). Medicinska mikrobioloija. Savremena
administracija, Beograd.

Kovaevi, N. (2004). Osnovi farmakognozije. Srpska kolska knjiga, Beograd.

Koch, F. & Estrella, C. (1999). Features of infectious endocarditis by Clostridium sp. in the
elderly population of a general hospital. Anaerobe, 5: 381383.

Krsti, B. & Marjanovi, N. (1988). Instrumentalne metode u biolokim istraivanjima.
Univerzitet u Novom Sadu.

Kruni, M. (1992). Zoologija invertebrata. Univerzitet u Beogradu.

Kurelec, B., Zahn, R.K., Gasic, M.J., Britvic, S., Lucic, D. & Mller, W.E.G. (1985).
Antimutagenic activity of the novel anti-leukemic agents, avarone and avarol. Mutation
Research, 144: 6366.

Lauridsen, T.K., Arpi, M., Fritz-Hansen, T., Frimodt-Moller, N. & Bruun, N.E. (2011).
Infectious endocarditis caused by Escherichia coli. Scandinavian Journal of Infectious
Diseases, 43: 545546.


42

Loya, S. & Hizi, A. (1990). The inhibition of human immunodeficiency virus type 1 reverse
transcriptase by avarol and avarone derivatives. FEBS Letters, 269: 131134.
MihajilovKrstev, T. (2009). Doktorska disertacija. Hemijski sastav i antimikrobna aktivnost
etarskih ulja biljnih vrsta roda Satureja L. Prirodno-matematiki fakultet. Univerzitet u
Novom Sadu.

Mili, B.Lj. (1997). Terpeni. Tehnoloki fakultet. Univerzitet u Novom Sadu.

Minale, L., Riccio, R. & Sodano, G. (1974). Avarol, a novel sesquiterpenoid hydroquinone
with a rearranged drimane skeleton from the sponge Dysidea avara. Tetrahedron Letters, 15:
34013404.

Mller, W.E.G., Diehl-Seifert, B., Sobel, C., Bechtold, A., Kljajic, Z. & Dorn, A. (1986).
Sponge secondary metabolties: biochemical and ultrastructural localization of the antimitotic
agent avarol in Dysidea avara. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 34: 16871690.

Mller, W.E.G., Maidhof, A., Zahn R.K., Schrder, H.C, Gai, M.J., ... & Seibert, G. (1985).
Potent antileukemic activity of the novel cytostatic agent avarone and its analogues in vitro and
in vivo. Cancer Research, 45: 48224826.

Mller, W.E.G., Sarin, A., Kuchino, Y., Dorn, A., Hess, G., Meyer zum Bschenfelde, K-H.,
Rottmann, M. & Schrder, H.C.M. (1987). Avarol, a novel anti-HIV compound,
which modulates posttranscriptional control systems. In: W. Vettermann and M. Schauzu
(Eds.), AIDS. Bonn: Bundesministeriums fr Forschung und Technologie, p. 354378.

Nikoli, M., Markovi, T., Mojovi, M., Pejin, B., Savi, A., Peri ,T., Markovi, D.,
Stevi, T. & Sokovi, M. (2013). Chemical composition and biological activity of Gaultheria
procumbens L. essential oil. Industrial Crops and Products 49: 561567.


43

Norell, S.A. & Messley K.E. (1997). Microbiology laboratory manual. Principles and
applications. Prentice Hall, New Jersey.

Novakovi, A. (2010). Master rad. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja vrsta Carum carvi L.,
Coriandrum sativum L. i Pimpinella anisum L. (Apiaceae Juss.). Prirodno-matematiki
fakultet. Univerzitet u Novom Sadu.

Olofsson, P., Hultqvist, M. & Holmdahl, R. (2011). Phytol as a cholesterol lowering
agent. United States Patent Application Publication, Appl. No. 12/921,169.

Pejin, B. (2011). Doktorska disertacija. Hemijski sastav i medicinski potencijal odabranih vrsta
liajeva, briofita i sunera. Hemijski fakultet. Univerzitet u Beogradu.

Pejin, B. (2012e). Thio-avarol derivatives and Alzheimer's disease, Serbia Italia Status and
Perspectives of the Scientific and Technological Bilateral Cooperation, Belgrade, Serbia, June
25-26, AIS
3
Proceedings, p. 131134.

Pejin B., Belic, D., Vuckovic, G., Kien-Thai, Y. & Stanimirovic, B. (2013). Mineral content of
a moss tea hypertension. Italian Journal of Food Science, 25: 235237.

Pejin, B., Bianco, A., Newmaster, S., Sabovljevic, M., Vujisic, Lj., Tesevic, V., Vajs, V. & De
Rosa, S. (2012c). Fatty acids of Rhodobryum ontariense (Bryaceae). Natural Product
Research, 26: 696702.

Pejin, B., Glamoclija, J., Ciric, A., Kien-Thai, Y. & Sokovic, M. (2013). The moss
Rhodobryum ontariense tea, a good source of natural antifungals against Candida albicans.
Revista de Chimie 64: 552554.

Pejin, B., Iodice, C., Tommonaro, G. & De Rosa, S. (2008). Synthesis and biological activities
of thio-avarol derivates. Journal of Natural Products, 7: 18501853.

44

Pejin, B., Iodice, C., Tommonaro, G., Sabovljevic, M., Bianco, A., Tesevic, V., Vajs, V. & De
Rosa, S. (2012a). Sugar composition of the moss Rhodobryum ontariense (Kindb.) Kindb.
Natural Product Research, 26: 209215.

Pejin, B., Kien-Thai, Y., Stanimirovic, B., Vuckovic, G., Belic, D. & Sabovljevic, M. (2012d).
Heavy metal content of a medicinal moss tea for hypertension. Natural Product Research, 26:
22392242.

Pejin, B., Sabovljevi, A., Sokovi, M., Glamolija, J., iri, A., Vujii, M. & Sabovljevi,
M. (2012). Antimicrobial activity of Rhodobryum ontariense. Hemijska industrija (Chemical
Industry), 66: 381384.

Pejin, B., Sabovljevic, M., Tesevic, V. & Vajs., V. (2012b). Further study on
fructooligosaccharides of Rhodobryum ontariense. Cryptogamie Bryologie, 33: 191196.

Pejin, B., Vujisic, Lj., Sabovljevic, M., Tesevic, V. & Vajs.,V. (2011). Preliminary data on
essential oil composition of the moss Rhodobryum ontariense (Kindb.) Kindb. Cryptogamie
Bryologie, 32: 113117.

Petrovi, O., Kneevi, P. & Simeunovi, J. (2007). Mikrobiologija (skripta za studente
biologije). Prirodno-matematiki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Petrovi, S.D., Mijin, D.. & Stojanovi, N.D. (2005). Hemija prirodnih organskih jedinjenja.
Tehnoloko-metalurki fakultet, Univerzitet u Beogradu.

Rajab, M.S., Cantrell, C.L., Franzblau, S.G. & Fischer, N.H. (1998). Antimycobacterial
activity of (E)-phytol and derivatives: a preliminary structure-activity study. Planta Medica,
64: 24.


45

Radovi, I. & Petrov, B. (2003). Raznovrsnost ivota. Struktura i funkcija. Bioloki fakultet,
Univerzitet u Beogradu.

Santos, C.C.M.P., Salvadori, M.S., Mota, V.M, Costa, L.M., de Almeida, A.A.C., de Oliviera,
G.A.L., ... & de Almeida, R.N. (2013). Antinociceptive and antioxidant activities of phytol in
vivo and in vitro models. Neuroscience Journal, doi:10.1155/2013/949452.

Sarin, P.S., Sun, D., Thornton, A. & Muller, W.E.G. (1987). Inhibition of replication of the
etiological agent of acquired immune deficiency syndrome (human T-lymphotropic
retrovirus/lymphadenopathy-associated virus) by avarol and avarone. Journal of the National
Cancer Institute, 78: 663666.

Seibert, G., Raether, W., Dogovi, N., Gai, M.J., Zahn, R.K. & Mller, W.E.G. (1985).
Antibacterial and antifungal activity of avarol and avarone. Zentralblatt fr Bakteriologie,
Mikrobiologie und Hygiene A, 260: 379386.

Sladi, D. & Gai, M.J. (2006). Reactivity and biological activity of the marine sesquiterpene
hydroquinone avarol and related compounds from sponges of the order Dictyoceratida.
Molecules, 11: 13.

Steen, M.K., Bruno-Murtha, L.A., Chaux, G., Lazar, H., Bernard, S. & Sulis, C. (1992).
Bacillus cereus endocarditis: report of a case and review. Clinical Infectious Diseases, 14:
945946.

Thakur, N.L. & Mller, W.E.G. (2004). Biotechnological potential of marine sponges. Current
Science, 38: 15061512.

Yeaman, M.R. & Bayer, A.S. (2000). Staphylococcus aureus, platelets, and the heart. Current
Infectious Disease, 2: 281298.


46

World Health Organization. (2013). http://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/
(23th September 2013).


47

8. Prilog

Slika 1. Brojnost kolonija soja Pseudomonas aeruginosa pri razliitim koncentracijama
fitola dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti.

Slika 2. Brojnost kolonija soja Bacillus cereus pri razliitim koncentracijama fitola dobijenih u postupku
odreivanja MIC i MBC vrednosti.


48

a b
Slika 3. Brojnost kolonija sojeva a) Bacillus cereus i b) Sarcina lutea pri razliitim
koncentracijama avarona dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti.

49

Slika 4. Brojnost kolonija soja Staphylococcus aureus pri razliitim koncentracijama avarola dobijenih u
postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti.
Slika 5. Brojnost soja kolonija Enterococcus faecalis pri razliitim koncentracijama
avarola dobijenih u postupku odreivanja MIC i MBC vrednosti.

50

Staphylococcus aureus 5485: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.
Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina.

Staphylococcus aureus 5485: 10. Imipenem; 11. Tobramicin; 12. Ertapenem.


51

Escherichia coli: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5. Ceftriakson; 6.
Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10. Imipenem; 11.
Tobramicin; 12. Ertapenem.

Clostridium sporogenes: 1. Cefotaksim; 2. Kanamicin; 3. Meticilin; 4. Azitromicin; 5.
Ceftriakson; 6. Ceftazidim; 7. Tetraciklini; 8. Cefahlor; 9. Nalidiksinska kiselina; 10.
Imipenem; 11. Tobramicin; 12. Ertapenem.

52

Izvod

Cilj ovog rada bio je in vitro skrining antibakterijske aktivnosti tri sekundarna
metabolita (avarol, avaron i fitol) na devet bakterijskih sojeva (dva Gram-negativna i sedam
Gram-pozitivnih) razliitog porekla (atestirane kulture /ATCC, sedam sojeva i humani
patoloki izolati /dva soja/).
Sve ispitivane supstance pokazale su se aktivnim na Gram-pozitivne bakterijske
kulture, ali u razliitoj meri.
Vrednosti avarola i avarona za MIC kreu se u opsegu od 0.78 g/ml do 3.12 g/ml, a
za MBC od 3.12 g/ml do 12.50 g/ml. Trebalo bi istai da su date vrednosti u sluaju
atestiranih kultura praktino identine, to se moe objasniti lakoom konverzije avarona u
avarol. Najosetljiviji sojevi bili su Bacillus cereus ATCC
11778
i Sarcina lutea ATCC
9341
.
Uoljiva je razlika u delovanju ovih marinskih prirodnih proizvoda na sojeve atestiranih
kultura i humanih patolokih izolata. Naime, rast sojeva Staphylococcus aureus 5485 i
Streptococcus agalactiae 5492 iz vaginalnog brisa inhibiran je tek pri najveoj radnoj
koncentraciji (12.50 g/ml), dok su relevantne MBC vrednosti kao vie od nje ostale
neodreene.
Fitol se pokazao manje efikasnim u datom skriningu: vrednosti za MIC kreu se u
opsegu od 1.56 g/ml do 12.50 g/ml, a za MBC od 12.50 g/ml pa navie. Najosetljiviji soj
bio je Staphylococcus aureus ATCC
25923
.
Na osnovu dobijenih rezultata moe se zakljuiti da je antibakterijski potencijal odabranih
jedinjenja vredan panje i daljeg istraivanja.


53

Abstract

This work aimed to screen antibacterial activity of three secondary metabolites (avarol,
avarone and phytol) on nine bacterial strains (two Gram-negative and seven Gram-positive) of
different origin (Tested Culture Collection /ATCC, seven strains/ and human pathological
isolates /two strains/) in in vitro conditions.
All examined substances showed to be active on the Gram-positive bacterial cultures,
but to a varying degree.
MIC values of avarol and avarone are in the range of 0.78 g/ml to 3.12 g/ml, while
their MBC values ranks from 3.12 g/ml to 12.50 g/ml. It is noteworthy that the
corresponding values against the ATCC strains are practically identical which can be explained
with the easy conversion of avarone into avarol. The most sensitive strains were Bacillus
cereus ATCC
11778
and Sarcina lutea ATCC
9341
. There is a significant difference in activity of
these marine natural products against the ATCC and human pathological strains. Indeed, the
growth of Staphylococcus aureus 5485 and Streptococcus agalactiae 5492 isolated from
vaginal swab were inhibited only at the highest working concentration (12.50 g/ml), while the
relevant MBC values were not determined.
Phytol proved to be less effective in a given screening: MIC values are in the range of
1.56 g/ml to 12.50 g/ml, while MBC values ranks from 12.50 g/ml to above. The most
sensitive strain was Staphylococcus aureus ATCC
25923
.
Based on the results obtained it can be concluded that the antibacterial potential of
selected compounds is worthy of attention and further investigation.


54


55

Biografija

Tnde Kartali roena je 23. avgusta 1987. godine u Subotici gde je zavrila osnovnu i
srednju (medicinsku) kolu.
kolske 2007/'08. godine upisuje se na osnovne akademske studije Biologije na
Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Novom
Sadu, smer Diplomirani biolog. Date studije privela je kraju 19. aprila 2012. godine.
kolske 2012/'13. godine upisuje se na diplomske akademske - master studije na istom
Departmanu Prirodno-matematikog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu, modul Biolog-
mikrobiolog. Predviene ispite nastavnim planom i programom poloila je sa prosenom
ocenom 9.40.


56

UNIVERZITET U NOVOM SADU
PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET
KLjUNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Redni broj:
RDB
Identifikacioni broj:
IBR
Tip dokumentacije: Monografska
TD
Tip zapisa: Tekstualni tampani materijal
TZ
Vrsta rada: Master rad
VR
Autor: Tnde Kartali
AU
Mentor: dr Maja Karaman, docent
dr Boris Pejin, nauni saradnik
MN
Naslov rada: Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola,

NR
Jezik (i pismo) publikacije: srpski (latinica)
Jezik izvoda: srpski i engleski
JI
Zemlja publikovanja: Republika Srbija
ZP
Ue geografsko podruje: Autonomna PokrajinaVojvodina
UGP
Godina: 2013.
GO
Izdava: Autorski reprint
IZ
Mesto i adresa: Departman za biologiju i ekologiju, PMF, Univerzitet u
Novom Sadu, Trg Dositeja Obradovia 2, 21000 Novi
Sad
MA
Fiziki opis rada: (broj poglavlja/strana/tabela/slika/grafikona)
( 8 / 51 / 4 / 15 / 4)
FO
Nauna oblast: Biologija
NO
Nauna disciplina: Mikrobiologija

57

ND
Kljune rei: Gram-pozitivne bakterije, Gram-negativne bakterije,
minimalna inhibitorna koncentracija, minimalna
baktericidna koncentracija, prirodni proizvodi,
Dysidea avara
KR
Univerzalna decimalna klasifikacija
UDK
uva se: Biblioteka Departmana za biologiju i ekologiju, PMF,
Univerzitet u Novom Sadu.
U
Vana napomena: Nema
VN
Izvod: Cilj ovog rada bio je in vitro skrining
antibakterijske aktivnosti tri sekundarna metabolita
(avarol, avaron i fitol) na devet bakterijskih sojeva (dva
Gram-negativna i sedam Gram-pozitivnih) razliitog
porekla (atestirane kulture /ATCC, sedam sojeva i
humani patoloki izolati /dva soja/).
Sve ispitivane supstance pokazale su se
aktivnim na Gram-pozitivne bakterijske kulture, ali u
razliitoj meri.
Vrednosti avarola i avarona za MIC kreu se u
opsegu od 0.78 g/ml do 3.12 g/ml, a za MBC od
3.12 g/ml do 12.50 g/ml. Trebalo bi istai da su date
vrednosti u sluaju atestiranih kultura praktino
identine, to se moe objasniti lakoom konverzije
avarona u avarol. Najosetljiviji sojevi bili su Bacillus
cereus ATCC
11778
i Sarcina lutea ATCC
9341
. Uoljiva
je razlika u delovanju ovih marinskih prirodnih
proizvoda na sojeve atestiranih kultura i humanih
patolokih izolata. Naime, rast sojeva Staphylococcus
aureus 5485 i Streptococcus agalactiae 5492 iz
vaginalnog brisa inhibiran je tek pri najveoj radnoj
koncentraciji (12.50 g/ml), dok su relevantne MBC
vrednosti kao vie od nje ostale neodreene.
Fitol se pokazao manje efikasnim u datom
skriningu: vrednosti za MIC kreu se u opsegu od 1.56
g/ml do 12.50 g/ml, a za MBC od 12.50 g/ml pa
navie. Najosetljiviji soj bio je Staphylococcus aureus
ATCC
25923
.

58

Na osnovu dobijenih rezultata moe se
zakljuiti da je antibakterijski potencijal odabranih
jedinjenja vredan panje i daljeg istraivanja.

IZ
Datum prihvatanja teme od strane
NN vea:
20.05.2013.
DP
Datum odbrane: 31.10.2013.
DO

lanovi komisije: (navesti zvanje i organizaciju gde rade)
KO
Predsednik: dr Milan Matavulj, redovni profesor, PMF, Univerzitet u Novom Sadu
Mentor: dr Maja Karaman, docent, PMF, Univerzitet u Novom Sadu
dr Boris Pejin, nauni saradnik, IMSI, Univerzitet u Beogradu
lan: dr Petar Kneevi, docent, PMF, Univerzitet u Novom Sad


59

UNIVERSITY OF NOVI SAD
FACULTY OF SCIENCES
KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number:
ANO
Identification number:
INO
Document type: Monograph type
DT
Type of record: Printed text
TR
Contents code: Master Thesis
CC
Author: Tnde Kartali
AU
Mentor: Dr. Maja Karaman, assistant professor
Dr. Boris Pejin, research assistant professor

Title: Antibacterial activity of avarol, avarone and phytol,
secondary metabolites of natural origin
TL
Language of text: Serbian
LT
Language of abstract: Serbian and English
LA
Country of publication: Republic of Serbia
CP
Locality of publication Autonomous Province of Vojvodina
LP
Publication year: 2013
PY
Publisher: Author's reprint
PU
Publ. Place: Department of Biology and Ecology, Faculty of
Sciences, University of Novi Sad, Trg Dositeja
Obradovia 2, 21000 Novi Sad
PP
Physical description chapters/pages/tables/pictures/figures/additional lists/
(8 / 51 / 4 / 15 / 4)
PD
Scientific field: Biology
SE
Scientific discipline: Microbiology

60

SD
Key words: Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria,
minimal inhibitory concentration, minimal
bactericidal concentration, natural products, Dysidea
avara
KW
Universal decimal classification:
UDC
Holding data: Library of Department of Biology and Ecology,
Faculty of Sciences, University of Novi Sad
HD

Note: No
N
Abstract:
This work aimed to screen antibacterial
activity of three secondary metabolites (avarol,
avarone and phytol) on nine bacterial strains (two
Gram-negative and seven Gram-positive) of different
origin (Tested Culture Collection /ATCC, seven
strains/ and human pathological isolates /two strains/)
in in vitro conditions.
All examined substances showed to be active
on the Gram-positive bacterial cultures, but to a
varying degree.
MIC values of avarol and avarone are in the
range of 0.78 g/ml to 3.12 g/ml, while their MBC
values ranks from 3.12 g/ml to 12.50 g/ml. It is
noteworthy that the corresponding values against the
ATCC strains are practically identical which can be
explained with the easy conversion of avarone into
avarol. The most sensitive strains were Bacillus
cereus ATCC
11778
and Sarcina lutea ATCC
9341
.
There is a significant difference in activity of these
marine natural products against the ATCC and human
pathological strains. Indeed, the growth of
Staphylococcus aureus 5485 and Streptococcus
agalactiae 5492 isolated from vaginal swab were
inhibited only at the highest working concentration
(12.50 g/ml), while the relevant MBC values were
not determined.

61

Phytol proved to be less effective in a given
screening: MIC values are in the range of 1.56 g/ml
to 12.50 g/ml, while MBC values ranks from 12.50
g/ml to above. The most sensitive strain was
Staphylococcus aureus ATCC
25923
.
Based on the results obtained it can be
concluded that the antibacterial potential of selected
compounds is worthy of attention and further
investigation.

AB
Accepted by the Scientific Board on: 20.05.2013
ASB
Defended: 31.10.2013
DE

Thesis defend board:
DB
President: Dr. Milan Matavulj, full professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad

Mentor Dr. Maja Karaman, assistant professor, Faculty of Sciences, University of Novi
.. Sad
Dr. Boris Pejin, research assistant professor, IMSI, University of Belgrade
Member: Dr. Petar Kneevi, assistant professor, Faculty of Sciences, University of Novi
. Sad

62

ZAPISNIK

Sa javne odbrane master rada kandidata Tnde Kartali,
Studenta master studija biologije Prirodno-matematikog fakulteta u Novom Sadu.

Master rad pod naslovom:

Antibakterijska aktivnost avarola, avarona i fitola,

Ocenjen je ocenom _____________________( )
Odbrana rada je ocenjena ocenom _____________________( )
Konana ocena _____________________( )

lanovi komisije:

1.___________________________

2.___________________________

3.___________________________

Antibakterijska Aktivnost Avarola Avarona I Fitola Sekundarnih Metabolita Prirodnog Porekla

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Antibakterijska Aktivnost Avarola Avarona I Fitola Sekundarnih Metabolita Prirodnog Porekla

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERZITET U NOVOM SADU

PRIRODNO MATEMATIKI FAKULTET

C po isteku 1 h, a neki mogu izdrati due vremena i na 80

You might also like