Professional Documents
Culture Documents
lsteli
proteominiai
tyrimai
Dr. A. Pivorinas,
VU Eksperimentins ir klinikins
medicinos
institutas
Paskaitos
planas
Embrionins ir suaugusio mogaus kamienins
lstels. Bendra apvalga.
Embrionini
kamienini
lsteli
(EKL)
pliuripotentikum
kontroliuojantys mechanizmai.
Naujausi duomenys.
Proteominiai
metodai. Bendra apvalga.
Proteominiai
EKL ir suaugusio mogaus
kamienini
lsteli
(SKL)
tyrimai. Pavyzdiai.
Kuo kamienins lstels yra ypatingos ?
Kamienin
Kamienin
s l
s l
stel
stel
stel
stel
ms neb
ms neb
dingus po
dingus po
ymius:
ymius:
Kamienini
Kamienini
l
l
steli
steli
populiacija atsinaujina viso
populiacija atsinaujina viso
gyvenimo metu
gyvenimo metu
(
(
SKL
SKL
)
)
Kamienin
Kamienin
s l
s l
stel
stel
s yra nespecializuotos
s yra nespecializuotos
ios l
ios l
stel
stel
s
s
geba virsti (diferencijuoti)
geba virsti (diferencijuoti)
vairi
vairi
audini
audini
tip
tip
l
l
stel
stel
mis
mis
Pagal kilms altin
skiriami du
kamienini
lsteli
tipai
Embrionin
Embrionin
s kamienin
s kamienin
s l
s l
stel
stel
s
s
Suaugusio organizmo kamienin
Suaugusio organizmo kamienin
s l
s l
stel
stel
s
s
Blastocistos formavimasis
Blastocistos formavimasis
Blastocista
Blastocista
ICM
Kryptinga EKL diferenciacija
Kryptinga EKL diferenciacija
in vitro
in vitro
Etikos
problemos
!
Nuo 2001 met
JAV vyriausyb
neberemia
tyrim, kuri
metu yra kuriamos naujos EKL
linijos
EKL linijos (iki
2006. 01. 01)
SKL sudaro labai nedidel
specializuot
audini
lsteli
populiacijos dal. Pavyzdiui, kaul iulpuose kamienins
lstels aptinkamos daniu 1:10000
SKL slygoja audini
atsinaujinim
viso gyvenimo metu
SKL yra grieiau specializuotos, t.y. jos lengviau virsta
to audinio tipo lstelmis i
kurio buvo iskirtos
SKL gyvenimo trukm
laboratorijos slygomis yra ribota,
tuo tarpu sukrus specifines slygas,
EKL galima kultivuoti praktikai
neribot
laik
Suaugusio organizmo kamienins lstels (SKL)
SKL PANAUDOJIMAS TYRIM
IR GYDYMO TIKSLAMS NEKELIA
GRSMS VISUOTINAI PRIIMTOMS ETIKOS NORMOMS !
SKL altiniai
Kaul iulpai
Kraujas
Oda
Smegenys
Riebalinis audinys
arnyno epitelis
Skersaruoiai raumenys
Kepenys
Kasa
Krties liaukos
Ragena ir tinklain
Dant
pulpa
Mezenchimin
Mezenchimin
s kamienin
s kamienin
s l
s l
stel
stel
s
s
MKL
Riebalinis Riebalinis
audinys audinys
Kremzlinis audinys Kremzlinis audinys
Kaulinis audinys Kaulinis audinys
Mezenchimin
Mezenchimin
s kamienin
s kamienin
s l
s l
stel
stel
s
s
(
(
MKL
MKL
)
)
MKL
MKL
Osteogenin
Osteogenin
MKL
MKL
diferenciacija
diferenciacija
Embrionini
kamienini
lsteli
(EKL)
pliuripotentikum
kontroliuojantys
mechanizmai
In vitro, sukurus
specifines
slygas, galima
palaikyti EKL
pliuripotentikum
neribot
laik
Embrionins kamienins lstels (EKL)
pasiymi pliuripotentikumu, t.y. jos gali
virsti bet kurio tipo lstelmis
Vis
individualaus organizmo lsteli
genotipas
yra identikas
Skirting
Skirting
tip
tip
l
l
stel
stel
se yra aktyv
se yra aktyv
s skirtingi
s skirtingi
gen
gen
rinkiniai
rinkiniai
Skirting
tip
lstelse veikia skirtingos
transkripcijos faktori
kombinacijos
Skirting
tip
lstelse skirtingai
reguliuojamas transkripcijos faktori
aktyvumas
Skirtingo tipo lstelms bdinga skirtinga
chromatino
organizacija
Transkripcijos faktoriai yra baltymai
Transkripcijos faktorius turi maiausiai du domenus
(sritis): DNR jungimo domen
ir aktyvacijos domen
Transkripcijos faktoriai jungiasi prie specifini
promotoriaus proksimalini
element
srii
Prie vieno promotoriaus jungiasi vairs transkripcijos
faktoriai
Specifins transkripcijos faktori
kombinacijos nulemia,
ar bus aktyvuota konkretaus geno transkripcija
Manoma, kad 5-10
% vis
mogaus genomo gen
koduoja
transkripcijos faktorius
Transkripcijos faktoriai
Apskaiiuota, kad vienos lstels DNR ilgis yra 2
metrai
Kaip i DNR sutelpa
10 M
skersmens branduol
?
Struktrinis chromatino vienetas-nukleosoma
Nukleosomos erd
sudaro histon
baltym
oktameras
DNR spiral
apsisuka aplink nukleosomos erd
1,65 karto
Chromatinas
Nukleosomos
Atvira
chromatino konformacija yra palankesn
transkripcijos iniciavimui
Kaip geno transkripcijos iniciavimui reikalingi
baltymai pasiekia promotori?
Transkripcikai aktyviose DNR srityse
chromatino
kondensacijos laipsnis yra maesnis
Chromatino kondensacijos laipsnis lstelse yra
reguliuojamas
Chromatino kompaktikumo laipsn
reguliuoja dvi
baltym
grups:
Baltymai modifikuojantys nukleosom
struktr
(nuo ATP priklausomi chromatin
remodeliuojantys
baltymai Swi/Snif)
Baltymai modifikuojantys erdinius histonus
(histon
acetilazs, histon
deacetilazs, metilazs,
kinazs)
Potransliacins histon
modifikacijos
(histon
kodas)
Histon
acetilinimas/deacetilinimas
KLAUSIMAI:
Kokie gen
(transkripcijos faktori) rinkiniai
nulemia ir palaiko EKL pliuripotentikum
? Kokie
yra
i
transkripcijos faktori
genai-taikiniai ?
Kokie lokals specifiniai chromatino
struktros ypatumai yra svarbs EKL
pliuripotentikumo
palaikymui ?
Transkripcijos faktoriai Nanog, Oct4 ir Sox2
palaiko nediferencijuotas EKL lsteles in vitro
Sutrikdius i
transkripcijos faktori
ekspresij,
stebima nepilnavertika EKL diferenciacija
Atsakymas
pirm
klausim
i
dalies buvo
inomas :
Kompleksikai itirta, prie koki
gen-taikini
EKL
lstelse jungiasi transkripcijos faktoriai Nanog,
Oct4 ir Sox2
Tyrimams naudotas kombinuotas chromatino
imunoprecipitacijos
ir DNR mikrogardeli
metodas
(ChiP-Chip)
DNR ir baltym
suriimas
DNR/baltym
kompleks
suskaidymas
fragmentus (sonikavimas)
Imunoprecipitacija
DNR fragment
atskyrimas nuo
baltym
DNR fragment
ymjimas ir
hibridizavimas
su DNR mikrogardelmis
Viso
tirtos
18 000 gen
promotori
sekos
Oct4 asocijavo su 623 gen
promotoriais
(3
%)
Nanog-1687
(9
%)
Sox2-1271 (7
%)
Nanog, Oct4 ir Sox2 transkripcijos
faktoriai kartu jungiasi prie gen-
taikini
promotori
Nanog+Oct4+Sox2 Nanog+Oct4+Sox2
Aktyvs
Genai koduojantys transkripcijos
faktorius ir signalini
keli
komponentus svarbius EKL
pliuripotentikumo
palaikymui
(Oct4, Sox2, Nanog, STAT3, ZIC3, TGF
ir
Wnt
signalini
keli
komponentai)
Neaktyvs
Transkripcijos faktoriai svarbs
EKL diferenciacijai vairiomis
kryptimis
(HOXB1, PAX6, MEIS1, MYF5 ir kt.).
Nanog, Oct4 ir Sox2 transkripcijos faktoriai
veikia pagal teigiamo grtamojo ryio princip
Transkripcijos faktori
reguliacinis tinklas
palaikantis EKL pliuripotentikum
(modelis)
Chromatin
remodeliuojantys
Polycomb
baltymai yra svarbs EKL pliuripotentikumo
palaikymui
Potransliacins histon
modifikacijos
(histon
kodas)
Polycomb
represori
kompleksas (PRC) slopina
gen-taikini
ekspresij
PRC2 komponentas EZH2
katalizuoja
histono
3 lizino-
27 (H3K27) metilinim
KLAUSIMAS:
Ar Polycomb
represori
kompleksai yra svarbs
EKL pliuripotentikumo
palaikymui ?
Kompleksikai itirta, prie koki
gen-taikini
EKL
lstelse jungiasi Polycomb
represijos kompleksai
Tyrimams naudotas kombinuotas chromatino
imunoprecipitacijos
ir DNR mikrogardeli
metodas
(ChiP-Chip)
DNR ir baltym
suriimas
DNR/baltym
kompleks
suskaidymas
fragmentus (sonikavimas)
Imunoprecipitacija
DNR fragment
atskyrimas nuo
baltym
DNR fragment
ymjimas ir
hibridizavimas
su DNR mikrogardelmis
Tirta, kaip PRC2 subvienetas
SUZ12 jungiasi prie
EKL gen-taikini
Viso tirtos 22 500 gen
sekos
SUZ12 asocijavo su 1893 gen
promotoriais
(~ 8 %)
Ar
prie
gen-taikini
prisijungs SUZ12 yra
asocijuotas
su
aktyviu
PRC2?
iuo tikslu ChiP-Chip
metodu analogikai itirtas
PRC2 subvieneto
EED ir H3K27me3 pasiskirstymas
SUZ12 jungiasi prie diferenciacij
reguliuojani
gen
(daugiausiai koduojani
transkripcijos
faktorius), kurie EKL yra slopinami
Transkripcikai
neaktyvs genai, prie kuri
promotori
jungsi Nanog+Oct4+Sox2
transkripcijos faktoriai taip pat asocijavo su PRC2
kompleksais
Transkripcijos faktori
ir Polycomb
represori
reguliacinis tinklas palaikantis EKL
pliuripotentikum
(modelis)
Proteominiai
metodai
Bendra apvalga
Baltymai atskiriami gelyje pagal j
krv
ir mas
Baltymai atskiriami gelyje pagal j
krv
ir mas
Dvikryptis gelis
Baltymo
ekspresijos
palyginimas
dvikrypiame
gelyje
Baltymo
ekspresijos
palyginimas
dvikrypiame
gelyje
Baltymo potransliacini
modifikacij vertinimas
gelyje
Baltymai i
karto suskaidomi
peptidus
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Mass spektrometrija
Peptidai ant kieto paviriaus jonizuojami lazerio
pagalba (matrix-assisted
laser
desorption-
ionisation,
MALDI)
Peptidai jonizuojami tirpale, ipurkiant juos per
elektrint
adat
(electrospray
ionization)
Peptid
mas
nustatoma pagal jon
skriejimo
laik
(ion
time
of
flight, TOF)
Gauti duomenys lyginami su esaniais duomen
bazse
MS/MS
Proteominiai
EKL ir SKL tyrimai
Pavyzdiai
EKL pliuripotentikum
palaikani
baltym
sveikos tyrimai
KLAUSIMAS:
Su kokiais baltymais transkripcijos faktorius
Nanog
asocijuoja pels EKL ?
Eksperimento planas
Generuoti Nanog
konstruktai, turintys FLAG
ym
ir trump
amino rgi
sek
(23), kuri
in
vivo yra biotilinama
Generuoti EKL klonai
stabiliai ekspresuojantys
biotino
ligaz
BirA
(E. coli)
Atlikta
Nanog
konstrukt
transfekcija
EKL
ekspresuojanias
BirA
EKL branduoli
ekstraktai inkubuoti
su
streptavidino-agarozs
granulm
(arba
prie
tai
vykdyta imunoprecipitacija
su anti-FLAG
antikniu)
Frakcionuota
10 % SDS poliakrilamidiniame
gelyje
Sekvenuota
LC-MS/MS
Realiausi kandidatai
Sveika su Nanog
patvirtinta
koimunoprecipitacijos
eksperimentais
Eksperimentai su si RNR
Su Nanog
asocijuojantys baltymai itirti pagal
t
pai
metodik
Baltym
sveikos emlapis
PDGF ir EGF signalini
keli
proteominiai
tyrimai suaugusio mogaus mezenchiminse
kamieninse lstelse (MKL)
KLAUSIMAS:
Kaip augimo faktoriai EGF ir PDGF veikia
osteogenin
MKL diferenciacij
?
EGF indukuoja osteogenin
MKL
diferenciacij, o PDGF-ne
Palyginta kokie baltymai yra tirozinfosforilinti
MKL veiktose EGF ir PDGF
Eksperimento planas
Lstels in vitro inkubuotos
su amino rgtimis,
turiniomis izotop
(Arg). Stable
isotope
labeling
by amino acids
in
cell
culture
(SILAC)
Trys MKL populiacijos augintos terpse su
skirtingu Arg. Arg
0
-normalus argininas;
Arg
6
-
izotopas; Arg
10
-kitoks izotopo
variantas
(10
dalton
sunkesnis)
MKL Arg
0
kontrolins
MKL Arg
6
veiktos
EGF
MKL Arg
10
veiktos
PDGF
Lstels
lizuotos. Lizatai
sumaiyti lygiu santykiu
Imunoprecipitacija
su anti-fosfo
Tyr
antikniu
Baltym
identifikavimas su LC-MS
Po SDS-PAGE baltymai suskaidyti
proteolitikai
~
90 %
tirozinfosforilint
baltym
buvo identiki PDGF
ir EGF veiktose MKL
PI-3 kinazs signalinio kelio
komponentai buvo
tirozinfosforilinti
tik PDGF
veiktose lstelse
PI-3 kinazs signalinio kelio inhibicija
sustiprino
PDGF veikt
MKL osteogenin
diferenciacij
Proteominiai
mezenchimini
kamienini
lsteli
heterogenikumo
tyrimai
KLAUSIMAS:
Kaip skirtingos kultivavimo slygos (rutinikai
naudojamos, taiau skirtingos sudties terps)
veikia MKL proteom
Eksperimento planas:
I
to paties donoro kaul iulp
pagal t
pat
protokol
iskirtos MKL (tas pats punktatas)
Lstels augintos terpse, rutinikai
naudojamose
MKL kultivavimui (Poietics
human
mesenchymal
stem
cell
medium, Cambrex;
ir terpje, kurios
sudtis aprayta Blood
2001; 98: 2615-2625)
Tirtas
MKL proteomas
(MALDI-TOF)
Abiej
kontrolini
grupi
MKL in vitro proliferavo
ir diferenciavo
vienodai
Skyrsi skirting
grupi
MKL morfologija
Skyrsi 241 baltymo
ekspresija