I n t . J . E x p . P a t h .

( 1 9 9 5 ) , 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
L e t h a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f r h e s u s m o n ke ys b y
a e r o s o l i z e d E b o l a v i r u s
E . J OHNSON, N. J AAX, J . WHI TE AND P . J AHRL I NG
U n i t e d St a t e Ar m y M e d i c a l Re s e a r c h I n s t i t u t e o f I n f e c t i o u s Di s e a s e s , F r e d e r i c k, M a r yl a n d , U SA
Re c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 3 J a n u a r y 1 9 9 5
Ac c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n 2 4 M a y 1 9 9 5
Su m m a r y. Th e p o t e n t i a l o f a e r o g e n i c i n f e c t i o n b y E b o l a v i r u s wa s e s t a b -
l i s h e d b y u s i n g a h e a d - o n l y e x p o s u r e a e r o s o l s ys t e m . V i r u s - c o n t a i n i n g
d r o p l e t s o f 0 . 8 - 1 . 2 , u m we r e g e n e r a t e d a n d a d m i n i s t e r e d i n t o t h e r e s p i r a -
t o r y t r a c t o f r h e s u s m o n ke ys v i a i n h a l a t i o n . I n h a l a t i o n o f v i r a l d o s e s a s l o w
a s 4 0 0 p l a q u e - f o r m i n g u n i t s o f v i r u s c a u s e d a r a p i d l y f a t a l d i s e a s e i n 4 - 5
d a ys . Th e i l l n e s s wa s c l i n i c a l l y i d e n t i c a l t o t h a t r e p o r t e d f o r p a r e n t e r a l v i r u s
i n o c u l a t i o n , e x c e p t f o r t h e o c c u r r e n c e o f s u b c u t a n e o u s a n d v e n i p u n c t u r e
s i t e b l e e d i n g a n d s e r o s a n g u i n e o u s n a s a l d i s c h a r g e . I m m u n o c yt o c h e m i s t r y
r e v e a l e d c e l l - a s s o c i a t e d E b o l a v i r u s a n t i g e n s p r e s e n t i n a i r wa y e p i t h e l i u m ,
a l v e o l a r p n e u m o c yt e s , a n d I n a c r o p h a g e s i n t h e l u n g a n d p u l m o n a r y l ym p h
n o d e s ; e x t r a c e l l u l a r a n t i g e n wa s p r e s e n t o n m u c o s a l s u r f a c e s o f t h e n o s e ,
o r o p h a r yn x a n d a i r wa ys . Ag g r e g a t e s o f c h a r a c t e r i s t i c f i l a m e n t o u s v i r u s
we r e p r e s e n t wi t h i n t yp e I p n e u m o c yt e s , m a c r o p h a g e s , a n d a i r s p a c e s o f
t h e l u n g b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y. De m o n s t r a t i o n o f f a t a l a e r o s o l t r a n s -
m i s s i o n o f t h i s v i r u s i n m o n ke ys r e i n f o r c e s t h e i m p o r t a n c e o f t a ki n g
a p p r o p r i a t e p r e c a u t i o n s t o p r e v e n t i t s p o t e n t i a l a e r o s o l t r a n s m i s s i o n t o
h u m a n s .
K e ywo r d s : E b o l a v i r u s , a e r o g e n i c i n f e c t i o n , r h e s u s m o n ke y
Th e Af r i c a n f i l o v i r u s e s , E b o l a v i r u s a n d M a r b u r g v i r u s ,
a r e d e a d l y p a t h o g e n s i n p r i m a t e s , ye t t h e i r e c o l o g y
a n d e p i d e m i o l o g y a r e l a r g e l y u n kn o wn ( M a r t i n i e t a / .
1 9 6 8 ; Br e m e n e t a l . 1 9 7 6 ) . Th e e n v i r o n m e n t a l c o n d i -
t i o n s t h a t i n f l u e n c e v i r a l t r a n s m i s s i o n f r o m u n kn o wn
r e s e r v o i r s p e c i e s t o h u m a n s a r e u n d e f i n e d . Th e s e
v i r u s e s a r e t h o u g h t t o c i r c u l a t e u n d e t e c t e d wi t h i n
u n kn o wn r e s e r v o i r s p e c i e s i n s u b - Sa h a r a n Af r i c a ,
p r e s u m a b l y a s e n z o o t i c i n f e c t i o n s , u n t i l c h a n g i n g
e c o l o g i c a l c o n d i t i o n s l e a d t o h u m a n i n f e c t i o n s . I n
h u m a n s , t h e s e p a t h o g e n s c a u s e s p o r a d i c , b u t
d r a m a t i c , o u t b r e a ks o f l e t h a l h a e m o r r h a g i c d i s e a s e
wi t h c a s e f a t a l i t y r a t e s r a n g i n g f r o m 3 0 t o 9 0 % ( M a r t i n i
C o r r e s p o n d e n c e : N. J a a x , U S Ar m y M e d i c a l Re s e a r c h I n s t i t u t e
o f I n f e c t i o u s Di s e a s e s , F r e d e r i c k, M a r yl a n d 2 1 7 0 2 - 5 0 1 1 , U SA.
e t a l . 1 9 6 8 ; Ge a r e t a / . 1 9 7 5 ; F r a n c i s e t a / . 1 9 7 8 ; Sm i t h e t
a / . 1 9 7 8 ; 1 9 8 2 ) .
Th e r o u t e o f i n f e c t i o n f o r n a t u r a l h u m a n e x p o s u r e s
c a n b e i n f e r r e d o n l y f r o m e x t r e m e l y l i m i t e d e p i d e m i o -
l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n s c o n d u c t e d d u r i n g t h e r a r e p e r i o d s
o f v i r a l a c t i v i t y i n h u m a n p o p u l a t i o n s ( Br e m e n e t a / .
1 9 7 6 ) . F r e q u e n t l y, h u m a n t o h u m a n t r a n s m i s s i o n
a p p e a r s t o b e c a u s e d b y d i r e c t c o n t a c t wi t h i n f e c t i o u s
b l o o d o r b o d y f l u i d s . I n h u m a n s , t h e h i g h e s t v i r u s
c o n c e n t r a t i o n s a r e f o u n d i n b l o o d ; l o we r l e v e l s a r e
p r e s e n t i n t h r o a t wa s h i n g s a n d u r i n e ( WHO 1 9 7 8 a , b ;
P e t e r s e t a / . 1 9 9 1 ) . P r e s u m a b l y, t h e v i r u s i n v a d e s t h e
b o d y t h r o u g h t h e c o n j u n c t i v a , g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t , o r
b r e a ks i n t h e s ki n . E x p e r i m e n t a l c o n f i r m a t i o n o f
p a r e n t e r a l i n o c u l a t i o n a s a t r a n s m i s s i o n m e c h a n i s m
h a s b e e n e s t a b l i s h e d b y s t u d i e s o f n o n - h u m a n
1 9 9 5 Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d 2 2 7
2 2 8 E . J o h n s o n e t a / .
p r i m a t e s ( Ba s ke r v i l l e e t a / . 1 9 7 8 ; Bo we n e t a / . 1 9 7 8 ;
F i s h e r - Ho c h e t a / . 1 9 8 5 ) . L i m i t e d e x p e r i m e n t a l a n d
e p i d e m i o l o g i c a l d a t a s u g g e s t t h a t a e r o s o l t r a n s m i s s i o n
o f f i l o v i r u s e s f r o m m o n ke y t o m o n ke y o r f r o m m o n ke y t o
h u m a n m a y a l s o o c c u r . I n a n o u t b r e a k o f E b o l a ( Re s t o n )
wi t h i n a U S n o n - h u m a n p r i m a t e q u a r a n t i n e f a c i l i t y, t h e
v i r u s r e a d i l y s p r e a d wi t h i n a n i m a l r o o m s . Wh i l e i n f e c -
t i o n s i n a d j a c e n t c a g e s m a y h a v e o c c u r r e d b y d r o p l e t
c o n t a c t , i n f e c t i o n s i n d i s t a n t c a g e s s u g g e s t s a e r o s o l
t r a n s m i s s i o n , a s e v i d e n c e o f d i r e c t p h ys i c a l c o n t a c t
wi t h a n i n f e c t e d s o u r c e c o u l d n o t b e e s t a b l i s h e d
( Da l g a r d e t a / . 1 9 9 2 ) . Th e p r o m i n e n t p n e u m o n i c c o m -
p o n e n t o f t h e d i s e a s e i n i n f e c t e d m o n ke ys s u p p o r t s t h i s
c o n c l u s i o n ( Ge i s b e r t 1 9 9 2 ) , a s d o e s a s e r o s u r v e y o f
h u m a n c o n t a c t s . Si x a n i m a l c a r e wo r ke r s i n c l o s e
d a i l y c o n t a c t wi t h i n f e c t e d m o n ke ys we r e s e r o p o s i t i v e
b y i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n t a n t i b o d y a s s a y ( I F A)
( C DC 1 9 9 0 ) . Of t h e s i x , f i v e h a d n o kn o wn h i s t o r y o f
p a r e n t e r a l o r t r a u m a - i n d u c e d e x p o s u r e t o E b o l a v i r u s ,
wh i c h s u g g e s t e d t h e p o s s i b i l i t y o f a e r o s o l t r a n s m i s s i o n .
Nu m e r o u s M a r b u r g d i s e a s e c a s e s o c c u r r e d i n l a b o r a -
t o r y wo r ke r s wh o wo r e g l o v e s wh i l e h a n d l i n g i n f e c t e d
m o n ke y t i s s u e s a n d / o r we r e wi t h o u t v i s i b l e wo u n d s
wh e n a d m i t t e d t o M a r b u r g U n i v e r s i t y M e d i c a l C l i n i c i n
1 9 6 7 ( M a r t i n i 1 9 7 1 ) . E x p e r i m e n t a l t r a n s m i s s i o n o f
M a r b u r g v i r u s b e t we e n m o n ke ys wh o s e o n l y c o n t a c t
wa s b y a n o s e - t o - n o s e a p p a r a t u s h a s a l s o b e e n
r e p o r t e d ( P o kh o d ya e v e t a / . 1 9 9 1 ) . De s p i t e t h i s c i r c u m -
s t a n t i a l e v i d e n c e f o r a e r o s o l s p r e a d o f f i l o v i r u s e s , t h e r e
h a s b e e n n o p r e v i o u s e x p e r i m e n t a l c o n f i r m a t i o n o f t h e i r
a e r o s o l t r a n s m i s s i o n .
Th i s p a p e r r e p o r t s a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f E b o l a
v i r u s t o r h e s u s m o n ke ys . Th e p a t h o p h ys i o l o g i c a l
e v e n t s a n d h i s t o p a t h o l o g i c a l l e s i o n s a s s o c i a t e d wi t h
E b o l a v i r u s i n f e c t i o n s a f t e r a e r o s o l e x p o s u r e s a r e
d e s c r i b e d .
M a t e r i a l s a n d m e t h o d s
Bi o l o g i c c o n t a i n m e n t
I n f e c t i o u s m a t e r i a l a n d a n i m a l s we r e h a n d l e d wi t h i n t h e
m a x i m u m c o n t a i n m e n t ( b i o l o g i c a l s a f e t y l e v e l 4 ) f a c i l i -
t i e s a t t h e U n i t e d St a t e s Ar m y M e d i c a l Re s e a r c h I n s t i -
t u t e o f I n f e c t i o u s Di s e a s e s , F r e d e r i c k, M D. L a b o r a t o r y
p e r s o n n e l wo r e p o s i t i v e p r e s s u r e p r o t e c t i v e s u i t s ( I L C ,
Do v e r , F r e d e r i c a , De l a wa r e ) s u p p l i e d wi t h u m b i l i c a l -
f e d , HE P A- f i l t e r e d a i r .
V i r u s c u l t u r e s a n d i n f e c t i v i t y a s s a ys
V i r u s wa s p r o p a g a t e d i n V e r o c e l l s g r o wn i n E a g l e ' s
m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m ( E M E M ) s u p p l e m e n t e d wi t h
1 0 % h e a t i n a c t i v a t e d f e t a l b o v i n e s e r u m , a n t i b i o t i c s
( 1 0 0 U o f p e n i c i l l i n a n d 1 0 0 l x g o f s t r e p t o m yc i n s u l p h a t e
p e r m l ) , a n d 2 m M L - g l u t a m i n e . St o c ks o f E b o l a v i r u s
( Z a i r e t yp e ) we r e p r e p a r e d a s c l a r i f i e d , i n f e c t e d c e l l -
c u l t u r e f l u i d s , p a s s a g e l e v e l 4 , a n d s t o r e d a t - 7 0 C .
V i r a l t i t r e s we r e d e t e r m i n e d b y p l a q u e a s s a y ( M o e e t a / .
1 9 8 1 ) . Th e s t o c ks r o u t i n e l y c o n t a i n e d 6 - 7 l o g 1 0 p l a q u e -
f o r m i n g u n i t s ( P F U ) o f i n f e c t i o u s v i r u s p e r m l .
St u d y d e s i g n
Si x r h e s u s m o n ke ys ( M a c a c a m u l a t t a ) we r e u s e d t o
e v a l u a t e t h e a e r o s o l i n f e c t i v i t y o f E b o l a v i r u s ( Z a i r e ) .
Rh e s u s m o n ke ys we r e s e l e c t e d f o r a e r o s o l e x p o s u r e t o
E b o l a v i r u s b e c a u s e t h i s s p e c i e s wa s p r e v i o u s l y u s e d t o
d e f i n e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s f o l l o wi n g p a r e n t e r a l l y
i n d u c e d f i l o v i r u s i n f e c t i o n s ( Ba s ke r v i l l e e t a / . 1 9 7 8 ;
Bo we n e t a / . 1 9 7 8 ; F i s h e r - Ho c h e t a / . 1 9 8 5 ) . Al l a n i m a l s
we r e s e r o n e g a t i v e f o r f i l o v i r u s - r e a c t i v e a n t i b o d y b e f o r e
E b o l a v i r u s a e r o s o l c h a l l e n g e .
Th e m o n ke ys we r e h o u s e d i n d i v i d u a l l y i n s t a i n l e s s
s t e e l c a g e s . M o n ke ys we r e g i v e n wa t e r a d l i b i t u m a n d
f e d t wi c e d a i l y wi t h P u r i n a m o n ke y c h o w s u p p l e m e n t e d
wi t h f r e s h f r u i t . Th e a n i m a l s we r e r a n d o m l y a s s i g n e d t o
o n e o f t h r e e a e r o s o l - e x p o s u r e g r o u p s o f t wo a n i m a l s
e a c h . Gr o u p o n e ( m o n ke ys 1 4 6 5 a n d R2 8 0 ) wa s e x p o s e d
t o a l o w i n h a l e d d o s e ( 2 . 6 l o g 1 0 P F U s ) o f E b o l a v i r u s ,
g r o u p t wo ( B6 4 a n d B6 5 ) wa s e x p Q s e d t o a h i g h d o s e
( 4 . 7 l o g 1 0 P F U s ) o f E b o l a v i r u s , a n d g r o u p t h r e e ( c o n t r o l
g r o u p , 1 2 1 , N a n d 5 5 6 A) wa s e x p o s e d t o a e r o s o l i z e d ,
u n i n f e c t e d c e l l c u l t u r e f l u i d .
Al l m o n ke ys we r e c h e c ke d d a i l y f o r c l i n i c a l s i g n s o f
i l l n e s s . M o n ke ys we r e a n a e s t h e t i z e d wi t h i n t r a m u s c u l a r
ke t a m i n e HC I ( 5 m g / kg ) , a n d s t e r i l e f e m o r a l v e n o u s
b l o o d s a m p l e s we r e c o l l e c t e d o n d a ys 4 , 7 , a n d t e r m i n -
a l l y f o r c l i n i c a l c h e m i s t r y a n d h a e m a t o l o g i c a l e v a l u a -
t i o n s . V a l u e s we r e c o m p a r e d wi t h r e s u l t s o b t a i n e d f r o m
s a m p l e s d r a wn b e f o r e e x p o s u r e .
Ae r o s o l e x p o s u r e
M o n ke ys we r e a n a e s t h e t i z e d wi t h ke t a m i n e HC I ( 5 m g /
kg ) f o r t h e a e r o s o l e x p o s u r e p h a s e o f t h e e x p e r i m e n t .
Wh i l e a n a e s t h e t i z e d , e a c h m o n ke y wa s p l a c e d i n d o r s a l
r e c u m b e n c y wi t h i t s h e a d e x t e n d i n g t h r o u g h a r u b b e r
d a m ( d e s i g n e d t o f i t s n u g l y a r o u n d t h e n e c k wi t h o u t
r e s t r i c t i n g v e n t i l a t i o n ) i n t o a 8 0 0 0 - c m 3 e x p o s u r e b o x .
Th e m o n ke y wa s p l a c e d i n a g a s t i g h t , e n v i r o n m e n t
c o n t r o l l e d Ha z e l t o n c h a m b e r ( 2 4 0 C a n d < 4 0 % r e l a t i v e
h u m i d i t y) t h a t c o n t a i n e d a m o d i f i e d He n d e r s o n a p p a r a -
t u s a n d a C o l l i s o n n e b u l i z e r ( He n d e r s o n 1 9 5 2 ) . Th e
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
L e t h a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f r h e s u s m o n ke ys b y a e r o s o l i z e d E b o l a v i r u s 2 2 9
n e b u l i z e r , d r i v e n b y c o m p r e s s e d a i r a t 2 0 P SI , g e n e r -
a t e d a n a e r o s o l f l o w r a t e o f 1 6 . 5 I / m i n a n d d i s s e m i n a t e d
t h e 2 5 m l o f t e s t s o l u t i o n a t 0 . 3 5 m l / m i n . Th e m e d i a n
m a s s d i a m e t e r o f t h e g e n e r a t e d a e r o s o l p a r t i c l e s
r a n g e d f r o m 0 . 8 t o 1 . 2 i m . Th e a e r o s o l wa s m i x e d
a u t o m a t i c a l l y wi t h a s e c o n d a r y 8 . 5 I / m i n a i r s u p p l y a n d
c i r c u l a t e d t h r o u g h t h e e x p o s u r e b o x . Th e a e r o s o l
c h a l l e n g e d o s e wa s d e t e r m i n e d b y a m i d - e x p o s u r e
s a m p l e c o l l e c t e d i n a n a l l - g l a s s i m p i n g e r c a l i b r a t e d t o
s a m p l e a t a r a t e o f 1 2 . 5 I / m i n . Th e a e r o s o l s p e c i m e n wa s
i m p i n g e d i n s u p p l e m e n t e d E M E M c o n t a i n i n g a n a n t i -
f o a m e m u l s i o n . Af t e r a 1 0 - m i n u t e e x p o s u r e , t h e Ha z e l -
t o n c h a m b e r wa s f l u s h e d wi t h c l e a n a i r a n d t h e v i r u s
c o n t a m i n a t e d c o n t e n t s e x h a u s t e d t h r o u g h d o u b l e HE P A
f i l t e r s . Th e h e a d a n d n e c k o f t h e e x p o s e d a n i m a l we r e
d e c o n t a m i n a t e d wi t h 1 . 0 % s o d i u m h yp o c h l o r i t e a n d t h e
m o n ke y wa s p l a c e d i n i t s c a g e . Th e v i r a l t i t r e p e r m l o f
i m p i n g e r f l u i d wa s d e t e r m i n e d b y p l a q u e a s s a y. Th e
e x p o s u r e d o s e wa s c a l c u l a t e d b y m u l t i p l yi n g t h e v i r u s
p l a q u e - f o r m i n g u n i t s ( P F U ) p e r l i t r e o f a e r o s o l , t h e
e x p o s u r e p e r i o d i n m i n u t e s , a n d r e s p i r a t o r y v o l u m e ( I /
m i n ) . Re s p i r a t o r y v o l u m e wa s d e t e r m i n e d o n t h e b a s i s
o f b o d y we i g h t a n d Gu yt o n ' s f o r m u l a ( Gu yt o n 1 9 4 7 ) .
Ha e m a t o l o g y, s e r u m e n z ym e a n d c o a g u l a t i o n a s s a ys
To t a l a n d d i f f e r e n t i a l wh i t e b l o o d c e l l s ( WBC ) we r e
c o u n t e d b y u s i n g a l a s e r - b a s e d h a e m a t o l o g i c a l a n a l y-
s e r . L e u c o c yt e d i f f e r e n t i a l s we r e c o n f i r m e d m a n u a l l y o n
a Wr i g h t s t a i n e d b l o o d s m e a r . P l a t e l e t s we r e c o u n t e d
wi t h a C o u l t e r M o d e l Z BI p a r t i c l e c o u n t e r . L a c t i c a c i d
d e h yd r o g e n a s e ( L DH) , s e r u m a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e
( AL T) , b l o o d u r e a n i t r o g e n ( BU N) , c r e a t i n i n e ( C RE ) ,
a l ka l i n e p h o s p h a t a s e ( AL P ) , a n d c r e a t i n i n e p h o s p h o -
ki n a s e ( C K ) l e v e l s we r e m e a s u r e d wi t h a M u l t i St a t I l I l
P l u s c h e m i c a l a n a l ys e r .
Hi s t o p a t h o l o g y a n d i m m u n o c yt o c h e m i s t r y e x a m i n a t i o n
C o m p l e t e n e c r o p s i e s we r e p e r f o r m e d o n a l l v i r u s
e x p o s e d a n i m a l s . On e m o n ke y ( 1 4 6 5 ) d i e d o n d a y 8
p o s t - e x p o s u r e a n d wa s n e c r o p s i e d i m m e d i a t e l y. Th e
o t h e r t h r e e m o n ke ys ( B5 4 , B6 5 , a n d R2 8 0 ) we r e
h u m a n e l y ki l l e d wh e n t h e y b e c a m e m o r i b u n d o n d a ys
7 , 8 a n d 9 p o s t e x p o s u r e , r e s p e c t i v e l y. Th e y we r e
e x s a n g u i n a t e d wh i l e d e e p l y a n a e s t h e t i z e d wi t h i n t r a -
v e n o u s s o d i u m p e n t a b a r b i t o l , a n d p e r f u s e d wi t h a
u n i v e r s a l f i x a t i v e ( n e u t r a l p h o s p h a t e - b u f f e r e d 4 . 0 %
p a r a f o r m a l d e h yd e c o n t a i n i n g 1 . 0 % g l u t a r a l d e h yd e ) f o r
l i g h t a n d u l t r a s t r u c t u r a l m i c r o s c o p y. Re p r e s e n t a t i v e
t i s s u e s p e c i m e n s f r o m t h e n o n - p e r f u s e d a n i m a l t h a t
d i e d n a t u r a l l y we r e s e l e c t e d a n d f i x e d b y i m m e r s i o n i n
1 0 % n e u t r a l b u f f e r e d f o r m a l i n . Th e t i s s u e s we r e p r o -
c e s s e d a n d e m b e d d e d i n p a r a f f i n a c c o r d i n g t o e s t a b -
l i s h e d p r o c e d u r e s ( P r o p h e t e t a / . 1 9 9 2 ) . Hi s t o l o g y
s e c t i o n s we r e c u t a t 5 - 6 , u m o n a r o t a r y m i c r o t o m e ,
m o u n t e d o n g l a s s s l i d e s , a n d s t a i n e d wi t h Ha r r i s ' s
h a e m a t o x yl i n a n d e o s i n i n a St a i n o m a t i c s p e c i m e n
s t a i n e r . P h o s p h o t u n g s t i c a c i d h a e m a t o x yl i n ( P TAH)
s t a i n wa s u s e d t o d e t e c t f i b r i n d e p o s i t s ( P r o p h e t e t a / .
1 9 9 2 ) . F o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g , t h e p a r a f f i n
e m b e d d e d t i s s u e s we r e s e c t i o n e d a t 5 b m a n d m o u n t e d
o n s i l a n e c o a t e d g l a s s s l i d e s . Af t e r d e p a r a f f i n i z a t i o n
a n d h yd r a t i o n , t h e s e c t i o n s we r e d i g e s t e d wi t h p r o t e a s e
a n d t r e a t e d wi t h E b o l a v i r u s r e a c t i v e m o n o c l o n a l a n t i -
b o d i e s ( AE l l , 8 A1 1 a n d Bl i ) p r e p a r e d f r o m h yb r i d o m a
c e l l s p r o v i d e d u n d e r c o n t r a c t b y t h e C e n t e r s f o r Di s e a s e
C o n t r o l , At l a n t a , Ge o r g i a . Bi o t i n yl a t e d h o r s e a n t i - m o u s e
i m m u n o g l o b u l i n wa s r e a c t e d wi t h t h e b o u n d m o n o -
c l o n a l a n t i b o d y a n d t h e r e a c t i v e p r o d u c t v i s u a l i z e d b y
a n a l ka l i n e p h o s p h a t a s e - l a b e l l e d s t r e p t a v i d i n m e t h o d
( J a h r l i n g e t a / . 1 9 9 0 ) . Ar c h i v e d n e c r o p s y m a t e r i a l p r e -
v i o u s l y c o l l e c t e d f r o m f a t a l m o n ke y i n f e c t i o n s i n d u c e d
b y l o w d o s e s ( 1 - 1 0 P F U ) o f p a r e n t e r a l l y i n o c u l a t e d
E b o l a v i r u s ( Z a i r e s t r a i n ) a n d M a r b u r g v i r u s ( M u s o ki
s t r a i n ) we r e p r o c e s s e d i n p a r a l l e l t o s e r v e a s p o s i t i v e
a n d n e g a t i v e c o n t r o l s , r e s p e c t i v e l y, f o r E b o l a v i r u s
a n t i g e n .
E l e c t r o n m i c r o s c o p y
Ti s s u e s we r e f i x e d i n u n i v e r s a l f i x a t i v e a n d s l i c e d i n t o
1 - m m c u b e s , wa s h e d t h r e e t i m e s i n p h o s p h a t e b u f f e r ,
a n d p o s t - f i x e d i n p h o s p h a t e b u f f e r e d 1 . 0 % o s m i u m
t e t r o x i d e . Th e f i x e d t i s s u e s we r e wa s h e d i n d i s t i l l e d
wa t e r , s t a i n e d e n b l o c i n 1 . 0 % u r a n yl a c e t a t e , d e h y-
d r a t e d , a n d e m b e d d e d i n E p o n 8 1 2 . U l t r a t h i n s e c t i o n s ,
c u t o n a n L K B U l t r a t o m e , we r e s t a i n e d wi t h u r a n yl
a c e t a t e a n d l e a d c i t r a t e a n d e x a m i n e d i n a J e o l 1 0 0
C X e l e c t r o n m i c r o s c o p e a t 8 0 kV .
Re s u l t s
C l i n i c a l d i s e a s e
C l i n i c a l d i s e a s e o c c u r r e d i n a l l f o u r E b o l a v i r u s e x p o s e d
m o n ke ys , b u t n o t i n e i t h e r o f t h e c o n t r o l m o n ke ys . Th e
c l i n i c a l d i s e a s e i n t h e a e r o s o l c h a l l e n g e d m o n ke ys wa s
s i m i l a r t o t h e s yn d r o m e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d i n p a r e n t -
e r a l l y i n o c u l a t e d r h e s u s m o n ke ys ( Ba s ke r v i l l e e t a i .
1 9 7 8 ; Bo we n e t a / . 1 9 7 8 ; F i s c h e r - Ho c h e t a / . 1 9 8 5 ) .
Ho we v e r , we o b s e r v e d s e r o s a n g u i n e o u s n a s a l d i s -
c h a r g e , s u b c u t a n e o u s h a e m o r r h a g e , a n d p r o l o n g e d
b l e e d i n g a f t e r v e n i p u n c t u r e i n t h e s e a e r o s o l i n f e c t e d
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
2 3 0 E . J o h n s o n e t a / .
m o n ke ys , wh i c h wa s n o t r e p o r t e d i n p r e v i o u s s t u d i e s
( Ba s ke r v i l l e e t a l . 1 9 7 8 ; Bo we n e t a l . 1 9 7 8 ; F i s h e r - Ho c h
e t a / . 1 9 8 5 ) . Th e m o n ke ys r e m a i n e d a c t i v e a n d c l i n i c a l l y
n o r m a l u n t i l t h e o n s e t o f f e v e r ( 3 9 . 9 - 4 0 . 2 o C ) b e t we e n 4
a n d 6 d a ys p o s t e x p o s u r e . Th e f e v e r wa s a c c o m p a n i e d
b y a n o r e x i a , l e t h a r g y a n d d e v e l o p m e n t o f a c u t a n e o u s
r a s h i n v o l v i n g t h e f a c e , t r u n k a n d p r o x i m a l l i m b s . On e
h i g h - d o s e a n i m a l ( 1 4 6 5 ) d i e d wi t h i n 3 d a ys o f t h e o n s e t
o f c l i n i c a l s i g n s ( 8 d a ys p o s t e x p o s u r e ) . Th e o t h e r t h r e e
we r e h u m a n e l y ki l l e d wh e n t h e y b e c a m e m o r i b u n d o n
d a ys 7 , 8 a n d 9 p o s t - e x p o s u r e .
Ha e m o t o l o g i c a l p a r a m e t e r s we r e a l t e r e d i n t h r e e o f
f o u r E b o l a v i r u s e x p o s e d r h e s u s m o n ke ys ( F i g u r e 1 ) .
Th e s e t h r e e a n i m a l s d e v e l o p e d a l e u c o c yt o s i s b y d a y 4
wi t h wh i t e b l o o d c e l l c o u n t s r a n g i n g f r o m 8 7 0 0 t o 1 5 2 0 0
c e l I S/ M M 3 . Th e l e u c o c yt o s i s wa s d u e t o a n a b s o l u t e
n e u t r o p h i l i a t h a t r a n g e d f r o m 9 4 0 0 t o 1 2 4 0 0 g r a n u l o -
c yt e s p e r m m 3 o n d a y 7 ( e x c l u d i n g m o n ke y B6 5 ) , wh i c h
i s c o n s i s t e n t wi t h o t h e r r e p o r t s ( F i s h e r - Ho c h e t a / . 1 9 8 3 ;
F i s h e r - Ho c h 1 9 8 5 ) . Th e r e wa s a c o n c o i m i t a n t a b s o l u t e
l ym p h o p e n i a . Th e m e a n p l a t e l e t c o u n t f e l l f r o m a p r e -
e x p o s u r e l e v e l o f 2 8 8 x i 0 3 t o 1 2 4 x 1 0 3 p e r m m 3 d a y 7
p o s t e x p o s u r e .
C l i n i c a l l y s i g n i f i c a n t e l e v a t e d c l i n i c a l c h e m i s t r y
v a l u e s we r e o b s e r v e d i n a l l f o u r m o n ke ys a f t e r E b o l a
v i r u s a e r o s o l e x p o s u r e . Al l b i o c h e m i s t r y p a r a m e t e r s
4 )
As
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j
F i g u r e 1 . Ha e m a t o l o g i c a l v a l u e s i n E b o l a v i r u s a e r o s o l e x p o s e d r h e s u s m o n ke ys . a , WBC ; b , SE GS; c , l ym p h s ; d , P L T. M o n ke y 0 ,
B6 5 ; 0 , B5 4 ; A, 1 4 6 5 ; A,
R2 8 0 . x , Av e r a g e .
) Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
. . - I - - . I . - ; . . . . . , . k - . I j , - . - 1 - z - . 3 ' - - T- . . - 4 '
E .
, - V I
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x I - . .
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1 . : . - 7 ' . ' . . i - .
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1 - : d i * %, '
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L e t h a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f r h e s u s m o n ke ys b y a e r o s o i i z e d E b o l a v i r u s 2 3 1
0
A
K
A
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1 0 0
4 0 ? * . t f . . : K : 4 A. L : 4 '
0 . 4 . K
F i g u r e 2 . Bl o o d c h e m i s t r y v a l u e s i n E b o l a v i r u s a e r o s o l e x p o s e d r h e s u s m o n ke ys . a , L DH; b , AL T; c , AL P ; d , C K ; e , BU N; f , ORE .
M o n ke y@ *,
B6 5 ; 0 , B5 4 ; A, 1 4 6 5 ; A,
R2 8 0 . x , Av e r a g e .
) Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
a c e .
. 1 0 0 0
( c )
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. .
. 7
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: . : . p
. . .
2 3 2 E . J o h n s o n e t a l .
m e a s u r e d we r e n o r m a l o n d a y 4 p o s t e x p o s u r e . On d a y
7 p o s t e x p o s u r e , 1 1 - 1 6 - f o l d i n c r e a s e s i n L DH l e v e l s ,
a c c o m p a n i e d b y a f i v e f o l d i n c r e a s e i n AL T, we r e p r e -
s e n t i n a l l a n i m a l s ( F i g u r e 2 ) . Te r m i n a l v a l u e s o f AL P
a n d C K we r e m a r ke d l y e l e v a t e d . C RE a n d BU N l e v e l s
we r e o n l y m i l d l y e l e v a t e d i n t h e i n f e c t e d a n i m a l s o n d a y
7 p o s t e x p o s u r e . Ne a r d e a t h , h o we v e r , t h e s e l e v e l s
we r e m a r ke d l y e l e v a t e d .
Hi s t o p a t h o l o g y
L u n g s a n d p u l m o n a r y l ym p h n o d e s . Al l E b o l a v i r u s
a e r o s o l e x p o s e d m o n ke ys h a d a m i l d t o m o d e r a t e ,
p a t c h y, i n t e r s t i t i a l p n e u m o n i a , c l e a r l y o r i e n t e d a r o u n d
t e r m i n a l b r o n c h i o l e s ( b r o n c h o c e n t r i c p a t t e r n ) . Ad d i -
t i o n a l p u l m o n a r y l e s i o n s i n c l u d e d d i f f u s e l e u c o c yt o s i s ,
v a s c u l i t i s , m u l t i f o c a l s e p t a l n e c r o s i s , t h r o m b o s i s , h a e -
m o r r h a g e , o e d e m a , a n d i n c r e a s e d n u m b e r s o f a l v e o l a r
m a c r o p h a g e s . L a r g e , a m o r p h o u s , p l e o m o r p h i c , a c i d o -
p h i l i c i n t r a c yt o p l a s m i c i n c l u s i o n s o f 5 - 2 0 - i m we r e p r e s -
e n t i n c i r c u l a t i n g a n d a l v e o l a r m a c r o p h a g e s o f t h e
l u n g s . Wi t h t h e e x c e p t i o n o f t h e b r o n c h o c e n t r i c p a t t e r n
e v i d e n t i n t h i s s t u d y, a l l l e s i o n s we r e c o n s i s t e n t wi t h
t h o s e d e s c r i b e d i n p r e v i o u s l y p u b l i s h e d r e p o r t s
( Ba s ke r v i l l e e t a / . 1 9 7 8 ; Bo we n 1 9 7 8 ) ; t h e b r o n c h o -
c e n t r i c p a t t e r n wa s c o n s i s t e n t wi t h a n i n h a l a t i o n m o d e
o f i n f e c t i o n . Wh e n e x a m i n e d b y i m m u n o c yt o c h e m i s t r y,
t h e s t r o n g e s t v i r a l a n t i g e n r e a c t i v i t y i n t h e l u n g s o f
a e r o s o l e x p o s e d m o n ke ys a l s o o c c u r r e d i n a b r o n c h o -
c e n t r i c p a t t e r n , wi t h t h e h e a v i e s t a n t i g e n c o n c e n t r a t i o n
o c c u r r i n g a d j a c e n t t o t e r m i n a l b r o n c h i o l e s . Br o n c h i a l
a n d b r o n c h i o l a r e p i t h e l i u m , a l v e o l a r p n e u m o c yt e s , a n d
a l v e o l a r m a c r o p h a g e s s h o we d p o s i t i v e E b o l a v i r u s
a n t i g e n s t a i n i n g ( F i g u r e 3 ) . C o p i o u s e x t r a c e l l u l a r
E b o l a v i r u s a n t i g e n wa s a l s o p r e s e n t i n s e c r e t i o n s o n
t h e m u c o s a l s u r f a c e s o f t h e n o s e , o r o p h a r yn x a n d
a i r wa ys . Se v e r e l ym p h o i d d e p l e t i o n , n e c r o s i s , v a s c u -
l i t i s , t h r o m b o s i s a n d v a r i a b l e d e g r e e s o f h a e m o r r h a g e ,
f r o m m i l d t o s e v e r e , we r e p r e s e n t i n t h e t r a c h e o -
b r o n c h i a l ( TBL ) l ym p h n o d e s o f a e r o s o l e x p o s e d
m o n ke ys ; i n t r a c yt o p l a s m i c i n c l u s i o n s we r e p r e s e n t i n
c i r c u l a t i n g a n d f i x e d m a c r o p h a g e s . Th e l e s i o n s i n t h e
TBL n o d e s we r e c o n s i s t e n t wi t h m e s e n t e r i c l ym p h n o d e
l e s i o n s r e p o r t e d i n o t h e r s t u d i e s ( Ba s ke r v i l l e e t a t . 1 9 7 8 ;
Bo we n e t a l . 1 9 7 8 ) . I m m u n o c yt o c h e m i c a l s t a i n i n g o f TBL
l ym p h n o d e s o f a e r o s o l i n f e c t e d m o n ke ys r e v e a l e d
c o p i o u s e x t r a c e l l u l a r a n d i n t r a c e l l u l a r ( wi t h i n m a c r o -
p h a g e s ) E b o l a v i r u s a n t i g e n a c c u m u l a t i o n .
E x t r a p u l m o n a r y l e s i o n s i n t h e s e a e r o s o l e x p o s e d
m o n ke ys d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e p r e -
v i o u s l y r e p o r t e d ( Ba s ke r v i l l e e t a t . 1 9 7 8 ; Bo we n e t a t .
1 9 7 8 ) . Th e p r i n c i p a l e x t r a p u l m o n a r y h i s t o l o g i c a l l e s i o n s
we r e m i l d t o m o d e r a t e r a n d o m l y p a t t e r n e d n e c r o s i s i n
t h e l i v e r , p a n c r e a s , i n t e s t i n e s , a d r e n a l g l a n d a n d b o n e
m a r r o w; m o d e r a t e t o s e v e r e n e c r o s i s o f b o t h t h e r e d
a n d wh i t e p u l p o f t h e s p l e e n , m e s e n t e r i c , p e r i p h e r a l
l ym p h n o d e s a n d g u t - a s s o c i a t e d l ym p h o i d t i s s u e
( GAL T) ; a n d f i b r i n d e p o s i t i o n a n d t h r o m b i t h r o u g h o u t
t h e v a s c u l a r s ys t e m i n a l l o r g a n s . L a r g e , a m o r p h o u s ,
p l e o m o r p h i c , a c i d o p h i l i c i n t r a c yt o p l a s m i c i n c l u s i o n s - o f
5 - 2 0 p L m we r e p r e s e n t i n c i r c u l a t i n g m a c r o p h a g e s o f
v a r i o u s o r g a n s , h e p a t o c yt e s a n d a d r e n o c o r t i c a l c e l l s ,
a s we l l a s t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d l o c a t i o n s .
A d e t a i l e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l e x a m i n a t i o n o f
e x t r a p u l m o n a r y n e c r o p s y t i s s u e s wa s p e r f o r m e d a n d
wi l l b e a d d r e s s e d i n a s e p a r a t e p u b l i c a t i o n . Br i e f l y,
c o p i o u s e x t r a c e l l u l a r a n d i n t r a c e l l u l a r E b o l a v i r u s a n t i -
g e n wa s p r e s e n t i n t h e l i v e r , a d r e n a l g l a n d , b o n e
m a r r o w, s p l e e n , t e s t e s a n d ki d n e y. L a r g e a n t i g e n
d e p o s i t s we r e a l s o p r e s e n t i n p h a g o c yt i c c e l l s ( s u c h
a s K u p f f e r c e l l s a n d s p l e n i c m a c r o p h a g e s ) , c e l l u l a r
t h r o m b i a n d i n f l a m m a t o r y f o c i .
Th e p r e s e n c e o f v i r i o n s i n t h e t i s s u e s o f a e r o s o l
i n f e c t e d m o n ke ys wa s c o n f i r m e d b y e l e c t r o n m i c r o -
s c o p y. E x t r a c e l l u l a r f i l a m e n t o u s v i r i o n s we r e a b u n d -
a n t , a n d we r e p r e s e n t i n l u n g a l v e o l i ( F i g u r e 4 ) , t h e
i n t e r s t i t i u m o f p a r e n c h ym a l o r g a n s , t h e s p a c e o f Di s s e
a n d b i l e c a n a l i c u l i o f t h e l i v e r , a n d we r e a s s o c i a t e d wi t h
f i b r i n t h r o m b i i n n u m e r o u s o r g a n s . Typ e 1 a l v e o l a r
p n e u m o c yt e s c o n t a i n e d n u c l e o c a p s i d i n c l u s i o n s wi t h
c h a r a c t e r i s t i c v i r a l p a r t i c l e s b u d d i n g t h r o u g h p l a s m a
m e m b r a n e s i n t o t h e a i r s p a c e ( F i g u r e 5 ) . Nu c l e o c a p s i d
i n c l u s i o n s a n d b u d d i n g v i r a l p a r t i c l e s we r e a l s o s e e n i n
m o n o n u c l e a r c e l l s wi t h i n t h e i n t e r s t i t i a l c o m p o n e n t o f
t h e a d r e n a l g l a n d s , s p l e e n a n d l ym p h n o d e s ; a l v e o l a r
s e p t a a n d a l v e o l a r m a c r o p h a g e s o f t h e l u n g s ; a n d i n
h e p a t o c yt e s .
Di s c u s s i o n
Th i s s t u d y d e m o n s t r a t e s a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f E b o l a
v i r u s t o n o n - h u m a n p r i m a t e s . I n h a l a t i o n d o s e s a s l o w a s
4 0 0 P F U o f v i r u s c a u s e d a f a t a l i l l n e s s c l i n i c a l l y s i m i l a r
t o t h a t p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r m o n ke ys i n f e c t e d b y
p a r e n t e r a l i n o c u l a t i o n ( Ba s ke r v i l l e e t a / . 1 9 7 8 ; Bo we n
e t a t . 1 9 7 8 ; F i s h e r - Ho c h e t a / . 1 9 8 5 ) . Th e i l l n e s s wa s
c h a r a c t e r i z e d b y f e v e r , a n o r e x i a a n d a p e t e c h i a l r a s h .
F i b r i n d e p o s i t i o n a n d f i b r i n t h r o m b i t h r o u g h o u t t h e
v a s c u l a r s ys t e m i n a l l m o n ke ys s u g g e s t e d t h a t
d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( DI C ) m a y
h a v e a l s o p l a ye d a r o l e i n t h e c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s
o f E b o l a v i r u s i n f e c t i o n .
Ou r a e r o s o l i n f e c t i v i t y f i n d i n g s f o r E b o l a v i r u s s u p p o r t
Da l g a r d ' s a n d P o kh o d ya e v ' s o b s e r v a t i o n s t h a t s u g g e s t e d
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
L e t h a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f r h e s u s m o n ke ys b y a e r o s o l i z e d E b o l a v i r u s 2 3 3
F i g u r e 3 . L u n g f r o m a n E b o l a v i r u s a e r o s o l e x p o s e d r h e s u s
m o n ke y s t a i n e d wi t h a m i x t u r e o f E b o l a v i r u s r e a c t i v e
m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . An t i g e n r e a c t i v i t y o c c u r r e d i n a
b r o n c h o c e n t r i c p a t t e r n o r i e n t e d a r o u n d t e r m i n a l b r o n c h i o l e s .
P u l m o n a r y m a c r o p h a g e s wi t h i n a l v e o l i we r e a l s o p o s i t i v e l y
s t a i n e d . x l Q O.
a r o l e f o r a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f f i l o v i r u s e s i n
m o n ke ys . E p i d e m i o l o g y s t u d i e s o f h u m a n d i s e a s e o u t -
b r e a ks i n s u b - Sa h a r a n Af r i c a d i d n o t s u g g e s t t h a t
a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f f i l o v i r u s e s wa s l i ke l y i n t h a t
s e t t i n g . V i r u s d i d n o t s p r e a d e a s i l y f r o m p e r s o n t o
p e r s o n d u r i n g t h e E b o l a v i r u s e p i d e m i c s i n Af r i c a , a n d
a t t a c k r a t e s we r e h i g h e s t i n i n d i v i d u a l s wh o we r e i n
d i r e c t p h ys i c a l c o n t a c t wi t h a p r i m a r y c a s e ( Br e s 1 9 7 8 ) .
Th e r a t e s we r e 3 . 5 t i m e s h i g h e r i n p e o p l e wh o p r o v i d e d
n u r s i n g c a r e t h a n i n t h o s e wh o we r e i n c a s u a l c o n t a c t
wi t h a p r i m a r y c a s e ; n o c a s e s o c c u r r e d i n c h i l d r e n
wh o s e o n l y kn o wn e x p o s u r e t o t h e v i r u s wa s s l e e p i n g
i n t h e h u t s o c c u p i e d b y t h e i r f a t a l l y i l l p a r e n t s . Al t h o u g h
c o u g h i n g wa s c o m m o n a m o n g t h e h u m a n E b o l a h a e -
m o r r h a g i c f e v e r c a s e s i n Af r i c a , t h e r e wa s n o d i r e c t
e v i d e n c e f o r a e r o g e n i c s p r e a d o f E b o l a v i r u s i n h u m a n
p o p u l a t i o n s . Se v e r a l p o t e n t i a l e x p l a n a t i o n s m i g h t
a c c o u n t f o r t h i s s i t u a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e q u a n t i t y
a n d d i "s t r i b u t i o n o f v i r u s wi t h i n m o s t p a t i e n t s ' r e s p i r a t o r y
t r a c t s m a y h a v e b e e n b e l o w t h e l e v e l n e e d e d t o e s t a b -
l i s h e f f e c t i v e a e r o s o l t r a n s m i s s i o n . Th i s p o s s i b i l i t y i s
s u p p o r t e d b y h i s t o l o g i c e x a m i n a t i o n o f a r c h i v e d t i s s u e s
f r o m o n e h u m a n r e f e r e n c e c a s e o f M a r b u r g o n f i l e i n
t h i s i n s t i t u t e ; e x a m i n a t i o n b y i m m u n o c yt o c h e m i s t r y a n d
e l e c t r o n m i c r o s c o p y r e v e a l e d n o p o s i t i v e M a r b u r g v i r a l
a n t i g e n s t a i n i n g o r a n y u l t r a s t r u c t u r a l e v i d e n c e o f v i r u s
i n t h e l u n g t i s s u e o f t h a t c a s e ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ,
N. J a a x ) . We a l s o d e m o n s t r a t e d a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f
E b o l a v i r u s a t l o we r t e m p e r a t u r e a n d h u m i d i t y t h a n t h a t
n o r m a l l y p r e s e n t i n s u b - Sa h a r a n Af r i c a . E b o l a v i r u s
s e n s i t i v i t y t o t h e h i g h t e m p e r a t u r e s a n d h u m i d i t y i n
t h e t h a t c h e d , m u d , a n d wa t t e l h u t s s h a r e d b y i n f e c t e d
f a m i l y m e m b e r s i n s o u t h e r n Su d a n a n d n o r t h e r n Z a i r e
m a y h a v e b e e n a f a c t o r l i m i t i n g a e r o s o l t r a n s m i s s i o n o f
E b o l a v i r u s i n t h e Af r i c a n e p i d e m i c s . Bo t h e l e v a t e d
t e m p e r a t u r e a n d r e l a t i v e h u m i d i t y ( RH) h a v e b e e n
s h o wn t o r e d u c e t h e a e r o s o l s t a b i l i t y o f v i r u s e s
( So n g e r 1 9 6 7 ) . Ou r e x p e r i m e n t s we r e c o n d u c t e d a t
2 4 0 C a n d < 4 0 % RH, c o n d i t i o n s wh i c h a r e kn o wn t o
f a v o u r t h e a e r o s o l s t a b i l i t y o f a t l e a s t t wo o t h e r Af r i c a n
h a e m o r r h a g i c f e v e r v i r u s e s , Ri f t V a l l e y f e v e r a n d L a s s a
( St e p h e n s o n e t a / . 1 9 8 4 ; An d e r s o n e t a / . 1 9 9 1 ) . I f t h e
s a m e h o l d s t r u e f o r f i l o v i r u s e s , a e r o s o l t r a n s m i s s i o n i s
a g r e a t e r t h r e a t i n m o d e r n h o s p i t a l o r l a b o r a t o r y
s e t t i n g s t h a n i t i s i n t h e n a t u r a l c l i m a t i c r a n g e s o f
v i r u s e s . Th e r o u t e o f i n f e c t i o n o r t h e d e g r e e o f p u l -
m o n a r y i n v o l v e m e n t o f t h e p r i m a r y c a s e s m a y a l s o b e
a n i m p o r t a n t f a c t o r t o c o n s i d e r wh e n e v a l u a t i n g t h e
n a t u r a l a e r o s o l t r a n s m i s s i b i l i t y o f t h e f i l o v i r u s e s .
Wh i l e b o t h p a r e n t e r a l a n d a e r o s o l e x p o s u r e t o E b o l a
v i r u s c a u s e a s ys t e m i c d i s e a s e i n v o l v i n g a l l o r g a n s ,
m o n ke ys e x p o s e d t o v i r a l a e r o s o l s d u r i n g o u r s t u d y
d e v e l o p e d s t r o n g i m m u n o r e a c t i v i t y f o r E b o l a v i r u s a n t i -
g e n i n a i r wa y e p i t h e l i u m , i n o r a l a n d n a s a l s e c r e t i o n s ,
a n d i n b r o n c h i a l a n d t r a c h e o b r o n c h i a l l ym p h o i d t i s s u e .
By e l e c t r o n m i c r o s c o p y, v i r a l r e p l i c a t i o n a f t e r a e r o s o l
e x p o s u r e o c c u r r e d i n t h e l u n g s a n d t r a c h e o b r o n c h i a l
l ym p h n o d e s , a n d e x t r a c e l l u l a r v i r u s a c c u m u l a t e d i n
a l v e o l i o f t h e l u n g . C o p i o u s e x t r a c e l l u l a r E b o l a v i r u s
a n t i g e n wa s p r e s e n t i n s e c r e t i o n s o n t h e m u c o s a l
s u r f a c e s o f t h e n o s e , o r a l c a v i t y a n d p u l m o n a r y a i r wa ys
o f a e r o s o l e x p o s e d m o n ke ys , s t r o n g e v i d e n c e t o s u p p o r t
t h e p o t e n t i a l f o r s e c o n d a r y s p r e a d o f E b o l a v i r u s b y
a e r o s o l . As p r e v i o u s l y s t a t e d , a e r o s o l s p r e a d wa s
i m p l i c a t e d i n t h e s p r e a d o f d i s e a s e a m o n g t h e m o n ke ys
a t Re s t o n ( Da l g a r d e t a / . 1 9 9 2 ; Ge i s b e r t 1 9 9 2 ) , a n d m a y
h a v e o c c u r r e d b e t we e n m o n ke ys a n d a n i m a l h a n d l e r s
wh o we r e i n c l o s e c o n t a c t wi t h i n f e c t e d m o n ke ys ( C DC
1 9 9 0 ) . F i n a l l y, h o s t s e n s i t i v i t y t o f i l o v i r u s i n f e c t i o n s m a y
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
2 3 4 E . J o h n s o n e t a / .
F i g u r e 4 . E x t r a c e l l u l a r m a t u r e v i r i o n s
( V ) i n t h e a l v e o l a r s a c ( AS) a n d i n a n
i n t e r s t i t i a l s p a c e ( I S) b e t we e n e p i t h e l i a l
c e l l s Typ e I o r 1 1 ( E p o r 1 1 ) a n d t h e
b a s a l l a m i n a . No t e t h e v i r a l
n u c l e o c a p s i d s i n t h e c yt o p l a s m o f
e p i t h e l i a l c e l l s ( s i n g l e a r r o w) a n d a
p o r t i o n o f a s e p t a l c e l l ( d o u b l e a r r o w) .
An e r yt h r o c yt e ( E ) i s a l s o a p p a r e n t i n
t h i s f i e l d . E n , E n d o t h e l i a l c e l l . x 1 5 0 0 0 .
a l s o b e a s i g n i f i c a n t f a c t o r i n f l u e n c i n g t h e d e g r e e o f
a e r o s o l t r a n s m i s s i b i l i t y. As i a n ( M a c a c a f a s c i c u l a r i s )
a n d Af r i c a n ( C e r c o p i t h e c u s a e t h i o p s ) m o n ke ys a r e
kn o wn t o b e d i s s e m i n a t i n g h o s t s f o r f i l o v i r u s e s ( Ge a r
e t a l . 1 9 7 5 ; C DC 1 9 9 0 ) . V i r u s r e p l i c a t e s e x t e n s i v e l y i n
E b o l a v i r u s i n f e c t e d n o n - h u m a n p r i m a t e s , r e a c h i n g h i g h
c o n c e n t r a t i o n s i n t i s s u e s ( c o n s i s t e n t l y g r e a t e r t h a n
6 l o g 1 0 / g o f t i s s u e o r s e r u m f o r Re s t o n v i r u s ; P . J a h r l i n g
u n p u b l i s h e d ) . Q u a n t i t a t i v e d a t a f o r v i r a e m i a l e v e l s i n
h u m a n s a r e l a c ki n g , a s a r e e s t i m a t e s o f m i n i m a l i n f e c -
t i o u s a e r o s o l d o s e s . C e r t a i n l y, f i l o v i r u s e s h a v e i n f e c t e d
h u m a n s wi t h n o kn o wn h i s t o r y o f p a r e n t e r a l o r o c u l a r
i n o c u l a t i o n o f t h e v i r u s ( M a r t i n i 1 9 7 1 ; C DC 1 9 9 0 ) , a n d a
r e s p i r a t o r y r o u t e o f i n f e c t i o n c a n n o t b e r u l e d o u t
( Si m p s o n 1 9 7 7 ) . Th o s e c a s e m a y h a v e r e s u l t e d f r o m
e x p o s u r e s t o u n u s u a l c o n c e n t r a t i o n s o f a e r o s o l i z e d
v i r u s n o t o f t e n e n c o u n t e r e d n a t u r a l l y. I n t h a t r e g a r d ,
r e t r o s p e c t i v e e x a m i n a t i o n o f a n y a v a i l a b l e a r c h i v e d
h u m a n t i s s u e s b y i m m u n o c yt o c h e m i s t r y c o u l d p r o v e t o
b e h e l p f u l .
Re g a r d l e s s , we h a v e s h o wn t h a t E b o l a v i r u s ( Z a i r e
s t r a i n ) c a n b e t r a n s m i t t e d b y a e r o s o l i n a n e x p e r i m e n t a l
p r i m a t e m o d e l . I n l i g h t o f t h e p a t h o g e n i c i t y o f h u m a n
f i l o v i r u s i n f e c t i o n s , h e a l t h c a r e p e r s o n n e l a t r i s k o f
e x p o s u r e s h o u l d u s e p r e c a u t i o n s t o m i n i m i z e t h e r i s k
o f a e r o s o l e x p o s u r e wh i l e m a n a g i n g a c u t e l y i l l h a e m o -
r r h a g i c f e v e r c a s e s o f u n kn o wn o r f i l o v i r a l a e t i o l o g y.
Th e r i s k c a n b e m a r ke d l y r e d u c e d b y a d h e r i n g t o s o u n d
a n d p r a c t i c a l i n f e c t i o u s d i s e a s e m a n a g e m e n t p r o c e -
d u r e s . Th i s r e q u i r e s c u r t a i l i n g a e r o s o l g e n e r a t i n g p r o -
c e d u r e s ; u s i n g p r o t e c t i v e c l o t h i n g , i n c l u d i n g g l o v e s a n d
m a s ks ; a d e q u a t e l y d e c o n t a m i n a t i n g p o t e n t i a l l y i n f e c -
t i o u s m a t e r i a l ; a n d c o n d u c t i n g v i r u s d i a g n o s t i c p r o c e -
d u r e s i n r e g i o n a l c o n t a i n m e n t f a c i l i t i e s c a p a b l e o f s a f e l y
h a n d l i n g h i g h l y h a z a r d o u s i n f e c t i o u s a g e n t s ( C o m p e r t s
e t a / . 1 9 7 8 ; C DC 1 9 8 8 ) .
I n c o n d u c t i n g t h i s r e s e a r c h , t h e i n v e s t i g a t o r s a d h e r e d
t o t h e Gu i d e f o r t h e C a r e a n d U s e o f L a b o r a t o r y An i m a l s ,
p r e p a r e d b y t h e C o m m i t t e e o n t h e C a r e a n d U s e o f
L a b o r a t o r y An i m a l s o f t h e I n s t i t u t e o f L a b o r a t o r y An i m a l
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
L e t h a l e x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n s o f r h e s u s m o n ke ys b y a e r o s o l i z e d E b o l a v i r u s 2 3 5
A
F i g u r e
5 . No t e e x t r a c e l l u l a r m a t u r e
v i r i o n s ( V ) i n a l v e o l a r s a c ( AS) a n d a
l a r g e c yt o p l a s m i c i n c l u s i o n ( d o u b l e
a r r o w) c o n t a i n i n g v i r a l n u c l e o c a p s i d s i n
a t yp e e p i t h e l i a l c e l l ( E p ) .
Nu c l e o c a p s i d f i l a m e n t s ( s i n g l e a r r o w)
a r e a l s o s e e n i n t h e c yt o p l a s m o f t h e
p i t h e l i a l c e l l t h a t e x t e n d s
o v e r a t yp e 1 1
ep n e u m o c yt e . E n , E n d o t h e l i a l c e l l .
x 3 0 0 0 0 .
Re s o u r c e s , Na t i o n a l Re s e a r c h C o u n c i l ( NI H P u b l i c a t i o n
No . 8 6 - 2 3 , r e v i s e d 1 9 8 5 ) .
Th e v i e ws , o p i n i o n s , a n d / o r f i n d i n g s c o n t a i n e d i n t h i s
r e p o r t a r e t h o s e o f t h e a u t h o r s a n d s h o u l d n o t b e
c o n s t r u e d a s a n o f f i c i a l De p a r t m e n t o f t h e Ar m y p o s i -
t i o n , p o l i c y, o r d e c i s i o n u n l e s s s o d e s i g n a t e d b y o t h e r
d o c u m e n t a t i o n .
Re f e r e n c e s
ANDE RSON G. W. , L E E J . O. , ANDE RSON A. O. , P OWE L L N. , M AGNI AF I C O
J . A. & M E ADORS G. ( 1 9 9 1 ) E f f i c a c y o f a Ri f t V a l l e y F e v e r
v i r u s v a c c i n e a g a i n s t a e r o s o l i n f e c t i o n i n r a t s . V a c c i n e 9 ,
7 1 0 - 7 1 4 .
BASK E RV I L L E A. , BOWE N E . T. W. , P L ATT G. S. , M C ARDE L L & SI M P SON
D. I . H. ( 1 9 7 8 ) Th e p a t h o l o g y o f e x p e r i m e n t a l E b o l a v i r u s
i n f e c t i o n i n m o n ke ys . J . P a t h . 1 2 5 , 1 3 1 - 1 3 8 .
BOWE N E . T. W. , P L ATT G. S. , SI M P SON D. I . H. & M c ARDE L L L . B. ( 1 9 7 8 )
E b o l a h e m o r r h a g i c f e v e r : E x p e r i m e n t a l i n f e c t i o n o f m o n ke ys .
Tr a n s . R. So c . Tr o p . M e d . Hyg . 7 2 , 1 8 8 - 1 9 1 .
BRE M E N J . G. , P I OT P . , J OHNSON K . M . , WHI TE M . K . , M BU Y I M . , SU RE AU
P . , HE Y M AN D. L . , V AN NI E U WE NHOV E S. , M C C ORM I C K J . B. , RU P P OL
J . P . , K I NTOK I V . , I SAAC SON M . , V AN DE R GROE N G. , WE BB P . A. &
NGV E TTE K . ( 1 9 7 6 ) Th e e p i d e m i o l o g y o f E b o l a h e m o r r h a g i c
f e v e r i n Z a i r e . I n E b o l a V i r u s He m o r r h a g i c F e v e r , E d . S. R.
P a t t yn . Ne w Y o r k, E l s e v i e r / No r t h - Ho l l a n d Bi o m e d i c a l P r e s s .
p p . 1 0 3 - 1 2 2 .
BRE S P . ( 1 9 7 8 ) Th e e p i d e m i c o f E b o l a h a e m o r r h a g i c f e v e r i n
Su d a n a n d Z a i r e , 1 9 7 6 : An i n t r o d u c t o r y n o t e . Bu l l . WHO 5 6 ,
2 4 5 - 2 7 0 .
C DC ( 1 9 8 8 ) M a n a g e m e n t o f p a t i e n t s wi t h s u s p e c t e d v i r a l
h e m o r r h a g i c f e v e r . M M WR 3 7 , 1 - 1 6 .
C DC ( 1 9 9 0 ) U p d a t e : F i l o v i r u s i n f e c t i o n s a m o n g p e r s o n s wi t h
o c c u p a t i o n a l e x p o s u r e t o n o n h u m a n p r i m a t e s . M M WR 3 9 ,
2 6 6 - 2 6 7 .
C OM P E RTS E . D. , I SAAC SON M . , K OORHOF H. J . , M I TZ J . , GE AR J . H. S. ,
SC HOU K B. D. , M C I NTOSH B. & P ROZ E SK Y O. W. ( 1 9 7 8 ) Ha n d l i n g
o f h i g h l y i n f e c t i o u s m a t e r i a l i n a c l i n i c a l p a t h o l o g y l a b o r a -
t o r y a n d i n a v i r a l d i a g n o s t i c u n i t . S. Af r . M e d . J . 5 3 , 2 4 3 -
2 4 8 .
DAL GARD D. W. , HARDY R. J . , P E ARSON S. L . , P U C AK G. J . , Q U ANDE R R. V . ,
Z AC K P . M . , P E TE RS C . J . & J AHRL I NG P . B. ( 1 9 9 2 ) C o m b i n e d s i m i a n
h e m o r r h a g i c f e v e r a n d E b o l a v i r u s i n f e c t i o n i n c yn o m o l g u s
m o n ke ys . L a b . An . Sc i . 4 2 , 1 5 2 - 1 5 7 .
c D Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6
2 3 6 E . J o h n s o n e t a / .
F I SHE R- HOC H S. P . , L L OY D G. , P L AI T G. S. , SI M P SON D. I . H. , WI L D G. H. &
BARRE TT A. J . ( 1 9 8 3 ) He m a t o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l m o n i t o r -
i n g o f E b o l a i n f e c t i o n i n r h e s u s m o n ke ys : I m p l i c a t i o n s f o r
p a t i e n t m a n a g e m e n t . L a n c e t i l , 1 0 5 5 - 1 0 5 8 .
F I SHE R- HOC H S. P . , P L ATT G. S. , NE I L D G. H. , SOU THE E , T. , BASK E RV I L L E
A. , RAY M OND R. T. , L L OY D G. & SI M P SON, D. l . H. ( 1 9 8 5 ) P a t h o p h y-
s i o l o g y o f s h o c k a n d h e m o r r h a g e i n a f u l m i n a t i n g v i r a l
i n f e c t i o n . J . I n f e c t . Di s . 1 5 2 , 8 8 7 - 9 4 .
F RANC I S D. P . , SM I TH D. H. , HI GHTON R. B. , SI M P SON D. I . H. , L OL I K P . ,
DE NG I . M . , GI L L O A. L . , I DRI s A. A. & TAHI R B. E . ( 1 9 7 8 ) E b o l a f e v e r
i n t h e Su d a n 1 9 7 6 : e p i d e m i o l o g i c a l a s p e c t s o f t h e d i s e a s e . I n
E b o l a V i r u s He m o r r h a g i c F e v e r . E d . S. R. P a t t yn . Ne w Y o r k,
E l s e v i e r / No r t h - Ho l l a n d Bi o m e d i c a l P r e s s . p p . 1 2 9 - 1 3 6 .
GE AR J . S. S. , C ASSE L G. A. , GE AR A. J . , TRAP P L E R B. , C L AU SE N L . ,
M E Y E RS A. M . , K E W K . C . , BOTHWE L L T. H. , SHE R R. , M I L L E R G. B. ,
SC HNE I DE R J . , K OOM HOF H. J . , C OM P E TS E . D. , I SM C SON M . &
GE AR J . H. S. ( 1 9 7 5 ) . Ou t b r e a k o f M a r b u r g V i r u s d i s e a s e i n
J o h a n n e s b u r g . Br . M e d . J . 4 , 4 8 9 - 4 9 3 .
GE I SBE RT T. W. ( 1 9 9 2 ) As s o c i a t i o n o f E b o l a r e l a t e d Re s t o n
v i r u s p a r t i c l e s a n d a n t i g e n wi t h t i s s u e l e s i o n s o f
m o n ke ys i m p o r t e d t o t h e U n i t e d St a t e s . J . C o m p . P a t h . 1 0 6 ,
1 3 7 - 1 5 2 .
GU Y TON A. C . ( 1 9 4 7 ) M e a s u r e m e n t o f t h e r e s p i r a t o r y v o l u m e s o f
l a b o r a t o r y a n i m a l s . Am . J . P h ys . 1 5 0 , 7 0 - 7 7 .
HE NDE RSON D. H. ( 1 9 5 2 ) An a p p a r a t u s f o r t h e s t u d y o f a i r b o r n
i n f e c t i o n . J . Hyg . 5 0 , 5 3 - 6 8 .
J AHRL I NG P . B. , GE I SBE RT T. W. , DAL GARD D. W. , J OHNSON E . D. , K SI AZ E K
T. G. , HAL L W. C . a n d P E TE RS C . J . ( 1 9 9 0 ) . P r e l i m i n a r y r e p o r t :
I s o l a t i o n o f E b o l a v i r u s f r o m m o n ke ys i m p o r t e d t o U SA.
L a n c e t 3 3 5 , 5 0 2 - 5 0 5 .
M ARTI NI G. A. ( 1 9 7 1 ) M a r b u r g V i r u s Di s e a s e : C l i n i c a l Syn d r o m e .
Ne w Y o r k, Sp r i n g e r V e r l a g .
M ARTI NI G. A. , K NOU F F H. G. , SC HM I DT H. A. , M AY E R G. & BAL TZ E R G.
( 1 9 6 8 ) A h i t h e r t o u n kn o wn i n f e c t i o u s d i s e a s e c o n t r a c t e d f r o m
m o n ke ys . Ge r m a n M e d . M o n t h . 1 3 , 4 5 7 - 4 7 0 .
M OE J . B. , L AM BE RT R. D. & L U P TON L . W. ( 1 9 8 1 ) P l a q u e a s s a y o f
E b o l a v i r u s . J . C l i n . M i c r o . 1 3 , 7 9 1 - 7 9 3 .
P E TE RS C . J . , J OHNSON E . D. & M c K E E K . T. ( 1 9 9 1 ) F i l o v i r u s e s a n d
m a n a g e m e n t o f v i r a l h e m o r r h a g i c f e v e r s . I n Th e Te x t b o o k o f
Hu m a n V i r o l o g y, E d . R. B. Be l s h e . St . L o u i s , M o s b y. p p . 6 9 9 -
7 1 2 .
P OK HODY AE V V . A. , GONC HAR N. I . & P SHE NI C HOV V . A. ( 1 9 9 1 ) E x p e r i -
m e n t a l s t u d y o f M a r b u g v i r u s c o n t a c t t r a n s m i s s i o n . V o p r o .
V i r . 3 6 , 5 0 6 - 5 0 8 .
P ROP HE T E . B. , ARRI NGTON J . B. & SU BI N L . H. ( E d s ) ( 1 9 9 2 ) L a b o r a t o r y
m e t h o d s i n h i s t o t e c h n o l o g y. Ar m e d F o r c e s I n s t i t u t e o f
P a t h o l o g y.
SI M P SON D. I . H. ( 1 9 7 7 ) M a r b u r g a n d E b o l a v i r u s i n f e c t i o n s : A
g u i d e f o r t h e i r d i a g n o s i s , m a n a g e m e n t , a n d c o n t r o l . Wo r l d
He a l t h Or g a n i z a t i o n .
SM I TH D. H. , F RANC I S D. , SI M P SON D. I . H. & HI GHTON R. B. ( 1 9 7 8 ) Th e
Nz a r a o u t b r e a k o f v i r a l h e m o r r h a g i c f e v e r . I n E b o l a V i r u s
He m o r r h a g i c F e v e r . E d . S. R. P a t t yn . Ne w Y o r k, E l s e v i e r /
No r t h Ho l l a n d Bi o m e d i c a l P r e s s . p p . 1 3 7 - 1 4 1 .
SM I TH D. H. , I SAAC SON M . , J OHNSON K . M . , BAGSHOWE A. , J OHNSON B. K . ,
SWANAP OE L R. , K I L E Y M . , SC ANJ OK T. , & K OI NAGE K . ( 1 9 8 2 ) M a r b u r g
v i r u s d i s e a s e i n K e n ya . L a n c e t 1 , 8 1 6 - 8 2 0 .
SONGE R J . R. ( 1 9 6 7 ) I n f l u e n c e o f r e l a t i v e h u m i d i t y o n t h e s u r v i v a l
o f s o m e a i r b o r n e v i r u s e s . Ap p l . M i c r o b i o l . 1 5 , 3 5 - 4 2 .
STE P HE NSON E . H. , L ARSON J . W. & DOM I NI K J . W. ( 1 9 8 4 ) E f f e c t o f
e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s o n a e r o s o l - i n d u c e d L a s s a v i r u s i n f e c -
t i o n . J . M e d . V i r o l . 1 4 , 2 9 5 - 3 0 3 .
WHO ( 1 9 7 8 a ) E b o l a h a e m o r r h a g i c f e v e r i n Su d a n . Bu l l . WHO 5 6 ,
2 4 7 - 2 7 0 .
WHO ( 1 9 7 8 b ) E b o l a h a e m o r r h a g i c f e v e r i n Z a i r e , 1 9 7 6 . Bu l l .
WHO 5 6 , 2 7 1 - 2 9 3 .
Bl a c kwe l l Sc i e n c e L t d , I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l P a t h o l o g y, 7 6 , 2 2 7 - 2 3 6