BAB III

METODE PERCOBAAN
III.1 Alat
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Alat sentrifugasi
Microlab 300
Spuit 3 cc
Setrifugasi
Pipet piston
tabung reaksi,

7. Tabung Appendorf
8. Tip kuning/biru
9. Mikropipet, lanset steril, mikropipet,
10. Lanset steril
11. Rak tabung reaksi
12. Kapas

III.2 Bahan
III.2.1 Bahan Uji Kadar Kolesterol
1. Aquadest
2. Plasma
3. Reagensia yang mengandung:
Buffer fosfat pH 6,7
70 mM
Fenol
6 mM
3,5-Diklorofenol
0,2 mM
4-Aminoantipirin
0,5 mM
Kolesterol esterase
500 kU/L
Kolesterol oksidase
300 kU/L
Peroksidase
1200 kU/L
Stabilizers
4. Standar Kolesterol 200 mg/dL
III.2.2 Bahan Uji Kadar Trigliserida
1. Alkohol 70%
2. Serum, Plasma, Heparin atau EDTA
3. Reagensia:
Tris buffer 0,15 mol/L, pH 7,6
Magnesium 17,5 %
Natrium Kholat 0,15 %
K-heksacyanoferrat(II) 6 mikro mol/L
Hidroksi polietoksin-alkana 0,12 %

ATP 0,5 mMol/L

4 amino fenazon 0,35 mmol/L
Lipase 3 U/mL
Gliserol phosphat oksidase 2,5 U/mL
Gliserol kinase 0,2 U/mL

 Peroksidase 0,15 U/mL

4-klorofenol 3,5 mmol/L
III.2.3 Bahan Uji Kadar Glukosa Darah
1. Serum, Plasma
2. Reagen mengandung:
Tris/buffer fosfat
Fenol
3,4 diklorofenol
Fatty-alcohol-polyglycol ether
4-aminofenazon
Peroksidase
Glukosa oksidase

180 mmol/L, pH 7,8

11 mmol/L
2,1 mmol/L
0,24 %
0,8 mmol/L
0,9 U/mL
15 U/mL

III.2.4 Bahan Uji Kadar Asam Urat

1.
2.
3.
4.

Alkohol 70 %
EDTA Plasma
Urin
Reagen I:
Buffer Phosfat pH 7,0
TBHBA
5. Reagen II:
Buffer Phosphat pH 7,0
4-Aminoantipyrine
K4[Fe(CN)6]
POD
Uricase

100 mmol/L
1 mmol/L
100 mmol/L
0,3 mmol/L
10 mol/L
> 2kU/L
> 30 U/L

III.2.5 Bahan Uji Kadar Urea

1. Plasma, Urin
2. Akohol 70 %
3. Reagensia I:
Baffer Tns pH 7,8
2-Oxoglutarate
ADOP
Urease
Glutamanate dehidrogenase
4. Reagensia II : NADH

120 mmol/L
7 mmol/L
0,06 mmol/L
6 KU/L
1 KU/L
0,25 mmol/L

III.2.6 Bahan Uji Kadar Kreatinin

1. Urin, Plasma
2. Reagensia terdiri dari larutan A dan Larutan B yang mengandung :
Asam pikrat
55 mM

 Natrium bikarbonat
Natrium hidroksida
Penstabil dan pengawet

50 mM
50 mM

III.2.7 Bahan Uji Kadar Bilirubin

1. Serum, darah
2. Reagen yang terdiri dari : Reagen I dan Reagen II
III.2.8 Bahan Uji Kadar SGOT dan SGPT
1. Serum
2. Reagen untuk penentuan GPT:
- Reagen I (Cairan substrat)
- Reagen II (Larutan Enzim)
Tris HCL buffer pH 7,8
L-alanin
Asam -ketoglutarat
NADH
LDH
3. Reagen untuk penentuan GOT :
- Reagen I (Cairan substrat)
- Ragen II (Larutan enzim)
Tris HCL buffer pH 7,8
L-asam aspartat
Asam -ketoglutarat
NADH
MDH
LDH
Penstabil dan pengawet

90 mM
240 mM
15 mM
0,18 mM
> 1400 U/L

90 mM
240 mM
12 mM
0,18 mM
600 U/L
800 U/L

III.3 Prosedur Percobaan

III.3.1 Uji Kadar Kolesterol
1. Disiiapkan sampel darah volunteer, mula-mula diambil darah dan dimasukkan ke
dalam tabung Appendorf (masih berupa Whole Blood)
2. Disentrifugasi Whole Blood yang diperoleh selama 15 dengan kecepatan 3000 rpm
untuk memisahkan plasma.
3. Diipet bagian plasma dan dimasukkan kedalam 3 Appendorf, masingmasing
digunakan untuk blanko, standar, dan sampel
4. Untuk blanko, dipipet 10 L aquadest, dimasukkan ke dalam Appendorf kemudian
tambahkan reagen kolesterol 1000 L
5. Untuk standar, dipipet 10 L standar Kolesterol ke dalam Appendorf ke-2, kemudian
ditambahkan reagen kolesterol 1000 L

6. Untuk sampel, dipipet 10 L plasma darah, dimasukkan kedalam Appendorf ke-3,

kemudian ditambahkan reagen kolesterol 1000 L
7. Dihomogenkan masing-masing campuran, diinkubasi ketiga tabung Appendorf
selama 20 menit pada suhu kamar (25C) dan diukur serapan masing-masing
campuran pada panjang gelombang max 546 nm atau 510 nm. Warna stabil dalam 1
jam bila terlindung dari sinar matahari.
III.3.2 Uji Kadar Trigliserida
1. Diambil sampel darah (Whole Blood) dan ditampung pada Appendorf yang tersedia
sampai tanda batas
2. Disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 3000 rpm
3. Dipisahkan bagian bening ke tabung Appendorf yang lain dan diberi label
4. Dipipet plasma (bagian bening) sebanyak 10 L, dimasukkan ke dalam tabung
Appendorf yang lain, kemudian ditambahkan reagen 1000 L ke dalam tabung
Appendorf yang berisi plasma. Lakukan ha yang sama terhadap blanko dan standar.
5. Untuk blanko, dipipet 10 L aquadest ke dalam tabung Appendorf, ditambahkan 1000
L reagen. Sedangkan untuk standar, dipipet 10 L standar trigliserida, lalu di
tambahkan 1000 L reagen
6. Ditempatkan ketiga tabung Appendorf (sampel, standar, dan blanko) pada alat
homogenizer selama beberapa menit
7. Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25C dan terlindung dari cahaya
8. Diukur kadar trigliserigda menggunakan Microlab dan kadarnya dicatat.
III.3.3 Uji Kadar Glukosa Darah
1. Diambil darah dari sukarelawan puasa, dimasukkan ke dalam tabung Appendorf
kemudan di sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 3000 rpm
2. Dipisahkan bagian bening ke tabung Appendorf lain, dan di beri label
3. Dipipet plasma/serum (bagian yang bening) sebanyak 10 L, dimasukkan ke dalam
tabun Appendorf yang lain, kemudian ditambahkan reagen glukosa 1000 L
4. Dilakukan hal yang sama terhadap blanko dan standar
5. Ditempatkan ketiga tabung Appendorf tersebut pada alat homogenizer selamma
beberapa menit..
6. Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25C dan terlindung dari cahaya
7. Diukur kadar glukosa darah menggunakan microlab, hasilnya dicatat dan
diinterpretasikan.
III.3.4 Uji Kadar Asam Urat
A. Sampel Urin
1. Disiapkan sampel, dimasukkan sampel ke dalam tabung Appendorf sebanyak 0,5
mL. Lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm.
2. Dipipet 1 bagian urin yang bening (10 L) kemudian encerkan dengan aquadest
sebanyak 100 L, dihomogenkan selama beberapa menit

3. Di pipet 10 L urin yang telah homogen, lalu ditambahkan reagen (Reagen I :

Ragen II = 4:1 )
4. Dilakukan hal yang sama pada blanko dan standar
5. Dihomogenkan selama beberapa menit, lalu diinkubasi pada suhu kamar (2025C) selama 30 menit dimulai saat penambahan reagen
6. Diukur serapan menggunakan mikrolab pada panjang gelombang 520 nm, Hg 546
nm
7. Hasil dicatat dan dianalisis
B. Sampel darah
1. Disiapkan sampel darah, disentrifugasi sampai didapat serumm/plasma darah
2. Dipipet plasma (bagian yang bening) sebanyak 10L, dimasukkan ke dalam
tabung Appendorf kemudian ditambahkan reagen 1000 L. Dilakukan hal yang
sama pada standar dan blanko.
3. Dihomogenkan beberapa meni, lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 2025C dan terlindung dar cahaya, waktu dihitung saat penambahan reagen.
4. diukur serapan menggunakan Mikrolab, dan dicatat hasilnya.
III.3.5 Uji Kadar Urea
Preparasi Sampel
A. Sampel Urin
1. Dikumpulkan urine dari pasien (Volunteer)
2. Dimasukkan ke dalam tabung Appendorf sebanyak 0,5 ml kemudan di
sentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
3. Ambil 1 bagian yang bukan endapan (10 L), setelah itu encerkan dengan 100
bagian aquadest (1000 L), lalu homogenkan selama beberapa menit
4. Pipet sampuran sebanyak 10 L (Perlakuan dua kali)
B. Sampel Darah
1. Dikumpulkan whole blood dari 2 orang pasien (Praktikan) kemudian sentrifugasi
selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm
2. Dipipet bagian yang bening (plasma) sebanyak 10 L (perlakuan duplo)
Pengukuran:
1. Masing-masing sampel (urin dan plasma) dtambahkan reagen (Reagen I 800 L dan
Reagen II 200 L)
2. Homogenkan beberapa saat, kemudian diinkubasi selama 1 menit pada suhu kamar
25-30C
3. Ukur serapan masing-masing pada panjang gelombang 340 nm. Hg 365 nm
4. Perlakuan yang sama pada blanko dan standar.
III.2.6 Uji Kadar Kreatinin
A. Pengukuran kadar dan serapan blanko
1. Dicampurkan reagensia (larutan A : Larutan B = 4 mL : 4 mL)

2. Homogenkan dengan Shaker 2 menit

3. Diukur kadar dan serapan blanko dengan alat microlab
4. Diukur Volume Ttal Urin pagi yang dihasilkan.
B. Pengukuran kadar dan serapan standar
1. Dipipet 25 L larutan standar kreatinin 2mg/mL. Kemudian ditambahkan
reagensia 500 L (reagen A dan reagen B). Dihomogenkan pada shaker 2 menit
2. Dikur kadar dan serapannya dengan mikrolab
C. Pengukuran kadar dan serapan kreatinin urin
1. Disiapkan urin pagi dari volunteer
2. Diukur volume total urin yang dihasilkan
3. Disiapkan 0,5 mL urin dari Volunteer, dimasukkan dalam Appendorf,
disentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 500 rpm
4. Dipipet 10 L urin hasil sentrifugasi dan diencerkan dengan 490 L aquadest
5. Dihomogenkan dengan shaker 2 menit kemudian ditambahkan reagensia 500 L
(reagen A dan B) dan dihomogenkan kembali dengan shaker selama 1 menit
6. Segera diukur kadar dan serapan kreatinin urin denga alat Mikrolab
7. Hasilnya dicatat dan dihitun kadarnya.
D. Pengukuran kadar dan serapan kreatinin plasma
1. Diambil sampel darah (Whole Blood) dan ditampung pada tabung Appendorf
yang tersedia sampai tanda batas kemudian sentrifugasi selama 15 menit pada
kecepatan 5000 rpm
2. Dipisahkan plasma ke dalam tabung Appendorf yang lain, dan diberi label
3. Dipipet plasma sebanyak 25 L , dimasukkan ke dalam tabung Appendorf yang
lain da dilakukan dua kali.
4. Ditambahkan reagensia 500 L (reagen A dan B) dan homogenkan kembali
dengan shaker selama 1 menit.
5. Segera diukur kadar dan serapan kreatinin plasma dengan alat Microlab
6. Hasilnya dicatat dan di hitungkadarnya
III.3.7 Uji Kadar Bilirubin
A. Pengukuran Bilirubin Total
1. Disiapkan 5 mL Whole Blood, disentrifugasi 5000 rpm selama 10 menit untuk
mendapatkan serum.
2. Dipipet reagen I sebanyak 500 L, dimasukkan ke dalam tabung Appendorf
3. Ditambahkan sampel sebanyak 50 L, kemudian ditambahkan reagen II sebanyak
5 L
4. Dihomogenkan selama beberapa saat, diinkubasi selama 2 menit dalam oven pada
suhu 37C
5. Diukur serapannya dengan microlab
B. Pengukuran Bilirubin Direct
1. Disiapkan Whole Blood sebanyak 5 mL, disentrifugasi 5000 rpm selama 10 menit
untuk mendapatkan serum
2. Dipipet reagen I sebanyak 500 L, dimasukkan ke dalam tabung appendorf

3. Ditambahkan sampel sebanyak 50 L, kemudian ditambahkan Reaggen II

sebanyak 5 L
4. Dihomogenkan selama beberapa saat, inkubasi selama 2 menit dalam oven pada
suhu 37C
5. Diukur serapannya dengan Microlab
III.3.8 Uji Kadar SGOT dan SGPT
Pengujian kadar SGPT dan SGOT sama, hanya saja reagennya berbeda
1. Diambil sampel darah whole blood sebanyak 3 mL, lalu ditampung pada tabung
reaksi kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm
2. Dipisahkan bagian bening ke dalam tabung Appendorf lainn dan diberi label
3. Dipipet plasma (bagian yang bening), dimasukkan kedalam tabung Appendorf lain
4. Dicampurkan reagen I sebanyak 400 L dengan reagen II sebanyak 100 L kemudian
homogenkan
5. Ditambahkan 100 L sampel ke dalam campuran reagen kemudian dihomogenkan
selama 1 menit
6. Inkubasi selama 1 menit pada suhu kamar 20-25C
7. Diukur serapannya dengan menggunakan Mik=crolab dan dicatat kadarnya.