Synteza biatka Rozdziat 30 fybosom, przedstawlony po prawe, jest fabryka produkuaca polipeptydy.Aminokvasy _wiqzane 2 cigsteczlami tansferowych RNA 59 kolejo dostarczane do rybosomu, anasteprie dofaczane do rosnacego lanicucha polipeptycowego Po zakoicren syntery poipeptd jest uvalniany zrybosomu Ten sposcb sytezy bata porwelana produkeje bardzo dlugich taicuchéw polipeptydowych, ze wzbudzajaca podziw dektadnoscia, (Po lewe) Doug Martin/Photo Researchers} nformacja genetyezna zawiera instrukeje dotyezqcq budowy bialek, a te, jak swiemy, sq odpowiedzialne 2a wypelnianie wiekszosci funkeji w komdrce. W Rozdzialach 28 129 dowiedzielismy sig, w jaki sposéb DNA ulega replikacji i jak jest przepisywany na RNA. Obecnie zajmiemy sig oméwieniem mechani- zmu syntezy bialka. Proces ten nazywa sig translacjq (ang. translation ~ thuma- czenic), poniewaz. polega na thumaczeniu jezyka skonstruowanego 2 liter od- powiadajacych caterem podstawowym zasacom kwasu. nukleinowego na jezyk biatka, KtGrego dwadzieseia liter stanowia aminokwasy. Translacja jest proce- sem bardzie} skomplikowanym niz replikacja czy transkrypeja, ktore postuguja sig tym samym jezykiem komplementarnosci zasad. Ze wzgledu na swoja role, wigzqca jezyki kwas6w nukleinowych i bialek, proces syntezy bialka zalezy przede wszystkim od kwas6w nukleinowych i czynnikéw bialkowych. Synteza biatka odbywa sie na rybosomach — olbrzymich kompleksach zawierajacych trzy duze czasteczki RNA i ponad pieédziesiat bialek. Jednym z najwigkszych osiagnigé biochemii ostatnich lat bylo ustalenie struktury rybosomu i jego sktadnik6w. Pozwolito to na analize funkeji rybosomu przy rozdzielezosci ato- mowej. Najwazniejszym wnioskiem z tych badati bylo twierdzenie, Ze rybosom jest rybozymem, co oznacza, Ze to czasteczki RNA wehodzace w sktad rybo- somu odgrywaja najwaéniejsza role w jego funkejonowaniu. Wniosek ten silnie wwspiera hipoteze, Ze rybosom jest reliktem swiata RNA. W 2wigzku z tym ry- bosom mote byé rédlem informacji dotyczqcych wezesnych etapdw ewolucji. W ogdinym zarysie 301 Synteza balla wymaga praettumaczenia informadi -genetyczne) zapisane} w jezyku kwas6w nukleinowych na jezyk bialek 30.2 Syntetazy aminoacylo-tRNA ‘odzytuja kod genetycany 303 Rybosom jest czastha rybonukleoproteinowa (705) abudowang z mate (305) i due} (605) podjednoseki 304 Czynniki bialkowe odgrywaja waing role w syntezie biatka 305 synteza biatka u eukariotow rézni sig od syntezy biatka u prokariotow przede wszystkim sposobem inicja} 306 Rybosomy zwigzane z retikulurm endoplazmatycenym produkuja biatka blonowe i sekrecyjne 307 Synteza biatka moze byé zahamowana przez antybiotyki itoksyay 861eee Ju ROZDZIAL30 Synteza biatka Rys.301 Synteralarcucha polipeptydowego. Bialka 59 syntetyzonane Poprter sukcesywne praylaczanie aminokwvasow do korica karboksylowego rosngcego laicucha polipeptydowego. Czasteczki transferowych RNA (tRNA), mRNA i wiele bialek biorg udzial, wraz z rybosomami, w syntezie biatka. Reakcje laczenia aminokwasdw z kwa- sami nukleinowymi katalizuja enzymy zwane syntetazami aminoaeylo-tRNA. Popreez reakcje zwigzania aminokwasu ze swoista dla niego czqsteczka tRNA enzymy te tlumacza kod genetyczny z jezyka kwaséw nukleinowych na jezyk bialek. W tym rozdziale skoncentrujemy sig przede wszystkim na procesie syntezy bialka u organizméw prokariotycznych ze wagledu na to, Ze jest on u bakterii bardzo dobrze poznany oraz obrazuje wiele ogélnych zasad syn- tezy biatka, Przedstawimy réwniez pewne cechy wyrdzniajgce synteze bialka ww organizmach eukariotycznych, 301 Synteza biatka wymaga przettumaczenia informacji genetycznej zapisanej w jezyku kwasow nukleinowych na jezyk biatek ‘W ogéInym zarysie synteza bialka zachodzi w ten sam spossb we wszystkich or ganizmach, co Swiadczy, Ze proces ten pojawil sig na bardzo wezesnych etapach ewolucji. Bialka sq syntetyzowane w kierunku od korica aminowego do karboksy= Jowego na drodze kolejnego dodawania aminokwas6w do korica karboksylowego rosngcego lasicucha polipeptydowego (rys. 30.1). Aminokwasy sq dostarezane do syntetyzowanego bialka w formie aktywowanej jako aminoacylo-tRNA, tore powstaja przez polaezenie grupy karboksylowe} aminokwasu z koricem 3 czasteczki transferowego RNA. Polaczenie aminokwasu ze swoistym tRNA jest katalizowane przez odpowiednia syntetaze aminoacylo-tRNA. Energii do reakeji aktywacji dostareza hydroliza ATP. Dla kazdego aminokwast istnieje zazwyczaj jeden enzym aktywujacy oraz przynajmnicj jeden rodzaj tRNA. Synteza dtugich biatek wymaga matej czestosci bledow Proces transkrypeji mozna pordwnaé do procesu przepisywania tekstu, slowo za slowem, strona za strong. Nie ma tam zmiany alfabetu czy slow: nictwa, W awigzku z tym prawdopodobieristwo zmiany znaczenia jest mate. Tlumaczenie sekwencji nukleotydowej czasteczki mRNA na sekweneje ami- nokwasowa przypomina tlumaczenie na inny jezyk. Translacja jest procesem zlozonym, w ktérym uczestnicza dziesiatki czqsteczek. Prawdopodobieristwo pojawienia sig bledu istnieje na kazdym etapie, Podezas translacji dochodzi do konfliktu migdzy dwoma wymaganiami: proces musi byé dokladny, ale rownoczesnie wystarczajaco szybki, by sprosta¢ potrzebom komérki. UE. coli szybkos¢ translacji wynosi okolo 40 aminokwas6w na sekunde. ‘To naprawale bardzo duzo, jesli wezmie sig pod uwage zlozonos¢ tego procesu.TABELA301 Poprawnosé syntery biatka = Prawdopodobieristwo syntezy bezblednego bialka ee srvedeana Lezba reset aminokwasowych blechego aminalasu 100 300 1000, 4 0366 ‘04s 0.000 0" 0905 7a 0368 wot 0980 0970 10905 wot 0999 0997 0950 Zasves. Prandopadcbenstwo 9 sytesybezbgdnego bia alety od aby budjgych go amirokwatow lod cepts wpronadzan bidego arinokwen p= f=)" Jak dokladnym procesem musi byé synteza bialka? Rozwazmy rézne war tosi tempa wptowadzania bledéw. Prawdopodobieristwo bezblednej syntezy bialka zalezy od liczby reszt aminokwasowych i czestosci wprowadzania bied- ‘nego aminokwasu (¢). Jesli przeanalizujemy dane z tabeli 30.1, to zauwazymy, ie cxgstosé wprowadzania pomylek reedu 107? nie mode by¢ tolerowana, nawet wprzypadku matych biatek. Wartos¢ ¢ rzedu 10~ prowadzitaby do bezblednej syntezy bialka skladajacego sig z 300 aminokwas6w (~33 kDa), ale juz w przy- padku bialka 0 dlugosci 1000 reszt aminokwasowych (~110 kDa) pojawig sie bledy. Tak wiee, do efektywnego wytwarzania wiekszych bialek konieczne jest, aby czgstos¢ pomytek nie byta wieksza niz 10° na jedna reszte aminokwasowa. Wieksza dokladnosé syntezy bialka jest oczywiscie modliwa, choé nalezy sobie adawaé sprawe, Z¢ 2 wyjatkiem najwiekszych bialek nie wplynie ona znaczaco na zwigkszenie procentu polipeptydéw z poprawna sekwencjq. Jednak wieksza dokladnosé wymaga wprowadzenia dodatkowych, wymagajacych czas, mecha- nizmw korygujacyeh, KtOre spowoduja, 2e szyDkos¢ syntezy bialka zmniciszy sie. W receywistosei, obserwowane wartotcic5q biskie 10. Czgstosé wprowa- dzania bledéw rzedu 10~ na aminokwas zostata wyselekcjonowana w trakeie cevolueji w celu poprawnej syntezy bialek o dlugosci okoo 1000 reszt amino- Kwasowych, utrzymujac réwnoczesnie wystarczajaco duze tempo syntezy. Cagsteczki transferowych RNA maja podobna budowe Wiernosé syntezy biatka wymaga dokladnego rozpoznania tréjnukleotydo- ‘wych kodoncw mRNA. Przypomnijmy sobie, ze kod genetyczny przyporzadko- wuje kaidy aminokwas do trdjliterowego kodonu (s. 125). Sam aminokwas nie inie rozpoznaé odpowiedniego kodonu. W konsekwencji, aminokwas Zostaje preylaczony do swoistej czastecrki tRNA rozpoznajace} odpowiedni kodon poprzez parowanie zasad typu Watson—Crick. Thansferowe RNA sq czqs- tecckami adaptorowymi, oddzialujgcymi ze swoistymi kodonami i dostarezajq- ejmi aminokwasy w celu ich wigezenia do taricucha polipeptydowego. antykodon xe tug GCE odo Sekwencja nukleotydowa pierwszej czasteczki tRNA zostala okreslona przez Roberta Holleya w 1965 roku i byla rezultatem siedmiu lat pracy. Jego badania nad tRNA alaninowym drozdzy pozwolity ustalié po raz pierwszy petna sekwer je nukleotydowg kwasu nukleinowego. Ta czasteczka adaptorowa jest pojedyn- caym laicuchem rybonukleinowym skladajeym sig 2 76 nukleotyd6w (rys, 30.2) ‘Koniee5' tRNA jest fosforylowany (pG), natomiast koniee 3" zawiera wolna grupe hydroksylowg. Miejsoem preylgczenia aminokwasu jest grupa 3-hydroksylowa adenozyny na koricu 3 czasteczki tRNA. Sekwencja nukleotydowa 5-IGC-3, ‘ajdujgca sie w Srodku laricucha ezasteezki tRNA, stanowi antykodon, edzie 863 301 Podstawy translacji z PH mijsce pealaczenia ‘mmokwasu antykodon Fys.302_Selwencja nukleotydowa tRNA alaninowego drozdiy. Na schemacie przedstawiono sekwencjenukleatydowg alanylo-RNA raz Jego strulcure crugorzedowa w formielisia konicayny. Madyfikowane nuklecaydy ‘ezraczono nastepujacym shrétamé ~ metylinozyna, UH, — dinydrourydyna, ‘T= 1ybotymidyna, ¥ — pseudourydyra, mG — metyleguanozyna i mG ~ dimetylo guanczyna.| —inozyna, ny modsfikowany ‘ukleozyd, wchodei w slad antykodonsROZDZIAL30 Synteza biatka He Ss pele ryboza S-metyloortydyne ‘me {ostortowany koniecs — sip. ~~ tamig dodatiowe ‘emienne) ys. 303 Ogsina budowa czasteczek RNA. Poxdwnanie sekwencji nudleotydowe| = roinych crasteczek tRNA wykazalo wiele Sneykodonowa \wspalnych cech ich budowy. 1 reprezentuje specjalna zasadg purynowa ~ inozyne. Sekweneja nukleotydéw antykodonu jest komplementarna do jednego z kodonéw alaniny ~5-GCC3. ‘Werdtce potem oznaczono sekwencje nukleotydowe kilku innych czaste- czek RNA. Obecnie znamy tysiace takich sekweneji. Wszystkie sekwencje {RNA moina ulozyé w formic ,liscia koniczyny”, ktdra ma prawie polowe nukleotydéw sparowanych ze soba (ys. 30.3). Wynika stad, ze czgsteczki RNA ‘maja wiele wspdlnych cech strukturalnych. Odkrycie to nie powinno byé zasko- czeniem, poniewai wszystkie czasteczki tRNA musza byé zdolne do oddzia- ywania w podobny sposdb z rybosomami, mRNA i czynnikami biatkowymi biorgcymi udziat w translacji. Wezystkie znane tRNA majg nastgpujgce cechy wspélne: 1, Ich pojedynezy taricuch zawiera 73-93 nukleotydéw (okolo 25 kDa). 2. Zawieraja wiele nietypowyeh zasad, zazwyezaj 7-15 na czasteczke. Niektore z nich to metylowe badd dimetylowe pochodne A, U, Club G, ktére powstaja wskutek enzymatycznego modyfikowania prekursorowego tRNA. Metylacje zapobiegaja tworzeniu niektérych par zasad, a tym samym czynia pewne zasady zdolnymi do innego rodzaju oddzialywasl. Metylacje zwigkszaja cha- rakter hydrofobowy niektérych obszaréw tRNA, co moze byé istotne dla oddziatywatt z syntetazami lub bialkami rybosomowymi, Inne modyfikacje ‘wplywajq na rozpoznanie kodonéw mRNA. Zagadnienie to zostanie wkrstee oméwione. 3. Mniej wigce} polowa nukleotydéw tRNA jest sparowana i tworzy dwu- niciowe helisy. Mozna wyréznié pigé grup nieparujacych sig zasad: sekwencia CCA na koricu 3', bedaca czgscia ramienia akceptorowego; petla THC, za- wdzigczajaca swa nazwe sekwencji rybotymina-pseudouracyl—cytozyna; ramig dodatkowe, zawierajace zmienng liczbe nukleotyd6w; petla DHU, zawierajaca kilka czqsteczek dihydrouracylu; petla antykodonowa. Strukturalna r6zn0- rodnosé, bedgea wynikiem kombinaeji helis i petli zawierajacych nietypowe zasady, umozliwia indywidualne rozpoznanie kazdej czasteczki (RNA z zacho- ‘waniem ogéinego, strukturalnego podobieristwa.jy, RYS304 | Strdtura tRNA w Ksztalcie titery L. Model szkieletowy tRNA enyloalaninowego z drozdiy 0 ksatatce litery LL Rejon CCA znajdue sie na jednym kon rae cczasteczki, a petla antykodonowa na drugim, (2a: 1EHZ.pdb] 4. Koniec 5' wszystkich tRNA jest fosforylowany. Nukleotydem koricowym jest zazwyczaj pG. 5. Aktywowany aminokwas jest przylaczony do grupy 31 hydroksylowej ostatnie} adenozyny na koricu 3' sekwencji CCA bedacej czescig ramienia ake ceptorowego. Rejon ten jest jednoniciowy i znajduje sig na koricu 3’ dojrzalych caasteczek tRNA. 6. Antykodon znajduje sie w petli bedace w przyblizeniu w srodku sekwengji nukleotydawej czasteczki (RNA. ‘Aktywowany aminokwas i antykodon znajduja sie na przeciwlegtych koficach czasteczki tRNA, ktéra ma ksztatt litery L ‘Tréjwymiarowa strukture czasteczki tRNA poznano w 1974 roku. Ustalono ja na podstawic badatt rentgenograficznych krysztaléw (RNA fenyloalaninowego 1 droddzy, przeprowadzonych w laboratoriach Aleksandra Richa i Aarona Kuga, Struktura ta, jak sie péZnicj okazato, bardzo przypomina struktury wielu innych ezgsteezek tRNA. Ponize} zostaly wymienione najwazniejsze \wlasciwosei struktur praestrzennych tRNA: 1. Caasteczka tRNA preypomina ksztaltem litere L. (rys. 30.4). 2. Wezasteczce znajduja sie dwa dwuniciowe odeinki helikalne. Helisy prey: pominaja forme A-DNA, zgodnie z tym, co przewidziano dla dupleksu RNA (6, 789). Helisa zawierajgca korice 5’ i 3’ ezasteczki tRNA tworzy jedno ramig litery L zakoriczone petla TYC; pozostate dwie helisy ukladaja sig prostopadle ww drugie ramig czasteczki (rys. 30.5). 3. Wigkszos¢ zasad znajdujacych sig w rejonach jednoniciowych bierze udziat w oddzialywaniach wodorowych, ktdre czesto nie sq charakterystycznymi od- dzialywaniami typu Watson-Crick. 4, Konice CCA zawierajacy migjsce preylaczenia aminokwasu znajduje sig ra jednym koricu litery L. Ten jednoniciowy rejon moze zmieniaé swofa kon- formacje w czasie aktywacji aminokwasu oraz w czasie syntezy bialka. 5. Nadrugim koricu litery L znajduje sie petla antykodonowa, Taka budowa cagsteczki tRNA powoduje, ze trzy zasady petli antykodonowej, tworzqce an- tykodon, sa mocno wyeksponowane. 865 301 Podstawy translacii py FY30S. Odeeywania warstwowe helisw tRNA. Cztery helisy struktury drugorzedowe| tRNA cddtialuja warstwowo (patra ys. 303), tworzacstrukture ksztaker preypominajacgltere L.[Za:eHZ pdb]6 ROZDZIAL 30. Synteza biatha péenina Nes" aminoacylo-tRNA Rys.30.6 Aminoacylo-tRNA. Aminokwas Ulega estryfikaci | zostaje praytacrony do grupy hydroksylove) lub 3 koncowej adenozyny tRNA. Na rysunku przedstawiono aminokwas zwigzany 2 grupa hydroksylowa 3 - Z wyéej opisane} budowy czasteczki tRNA wynika, Ze jest ona dobrze dopasowana do funkeji czasteczki adaptorowe}, antykodon jest dostepny do oddziatywari z odpowiednim kodonem mRNA, a koniec wiazacy aktywo- wany aminokwas ma optymalng lokalizacjg ze wgledu na proces tworzenia wigzania peptydowego. 30.2. Syntetazy aminoacylo-tRNA. odczytuja kod genetyczny Preykaczenie aminokwasu do tRNA jest waine z dw6ch powodéw. Po piernsze, przylgczenie danego aminokwasu do swoistego (RNA decyduje 0 prawidlowym odezytaniu kod genetycznego. Jesli aminokwas zostat zwigzany z konkret- nym tRNA, to zostanie wlaczony do rosnacego laficucha polipeptydowego w miejscu, o ktGrym bedzie decydowa¢ antykodon tRNA. Po drugie, tworzenie wigzania peplydowego miedzy grupq aminong jednego aminokwasu a grupq Karboksylowa drugiego jest termodynamicznie niekorzystne. Aby synteza bialka mogta zachodzié, aminokwas musi byé najpierw zakiywowany. Aktywowanymi zwigzkami posrednimi w syntezie bialka sq estry aminokwasow, w ktorych grupa karboksylowa aminokwasu jest polaccona z grupa 2- lub 3-hydroksylowg rybozy na koricu 3’ RNA. Ester aminokwasu i tRNA nazywa sig aminoacylo- -IRNA; czasami nazywa sig go réwnied naladowanym tRNA (rys. 30.6). Aminokwasy sa wstgpnie aktywowane przez adenylacje Reakcja aktywacji jest katalizowana przez specyficzne syntetazy aminoacylo- RNA, zwane r6wnied enzymami aktywujacymi. Pierwszym etapem reakcji jest tworzenie aminoacyloadenylanu z aminokwasu i ATP. aminokwas + ATP == aminoacylo-AMP + PP, Zwiiyzek ten jest mieszanym bezwodnikiem, w ktérym grupa karboksylowa aminokwasu jest 2wiqzana z grup fosforanowa AMP; dlatego zwigzek ten nazywa sig r6wnicé aminoacylo-AMP. 2 ao Rs eee HN Ku HO OH aminoacyloadenylan Kolejnym etapem jest przeniesienie grupy aminoacylowej aminoacylo-AMP na czasteczke (RNA, z utworzeniem aminoacylo-tRNA. aminoacylo-AMP + tRNA === aminoacylo-tRNA + AMP ‘Suma obu reakeji aktywacji i przeniesienia jest rownanie aminokwas + ATP + tRNA = aminoacylo-tRNA + AMP + PP, AG" tej reakeji jest bliskie zeru, poniewaz energia swobodna hydrolizy wiazania estrowego aminoacylo-tRNA i hydrolizy ATP do AMP i PP, jest po- dobna. Jak juz widzielismy to wiele razy, taka reakcja jest .napedzana” przez hydrolize pirofosforanu. Reakcja sumaryczna trzech reakeji czqstkowych jest silnie egzoergiczna:aminokwas + ATP + tRNA + H»O——> aminoacylo-tRNA + AMP + 2 P, Tak wigc, do utworzenia aminoacylo-tRNA zostaje wykorzystana energia zmagazynowana w didch wysokoenergetycznych wigzaniach fosforanowych, Energia pierwszego wigzania jest spozytkowana na utworzenie aminoacylo- ARNA, a energia uwolniona w czasie hydrolizy drugiego wigzania umozliwia preebicg reakeji. Reakcja aktywacji i przeniesienia aminokwasu jest katalizowana przez tg sama syntetaze aminoacyl-tRNA. Aminoacylo-AMP nie oddysocjowuje ‘od syntetazy, lecz wskutck oddzialywaii niekowaiencyjnych pozostaje mocno awigzany z miejscem aktywnym enzymu. Chociaz aminoacylo-AMP jest awigzkiem posrednim w syntezic aminoacylo-tRNA, jest on dosé stabilny imodna go latwo wyizolowa¢ z mieszaniny reakeyjnej, do ktorej nie dodano tRNA. acyloadenylanie méwilismy juz. pray okazji aktywacji kwassw thusz- czowyeh (s, 622). Gléwna réinica migdzy tymi reakejami polega na tym, ie w przypadku aktywacji kwasGw tluszezowych akceptorem grupy acylowe} jest CoA, a w omawianym przez nas przypadku — tRNA. Efekt energetyczny obu syntez jest bardzo podobny: obie reakeje wskutek hydrolizy pirofosforanu sa nieodwracalne, Syntetazy aminoacylo-tRNA selektywnie rozpoznaja aminokwasy majace ulec aktywacji Kaida syntetaza aminoacylo-tRNA jest wysoce specyficzna dla swoistego aminokwasu. Wystarczy stwierdzié, Ze tylko raz na 10" lub 10° reakcji katali- tycanych enzymy te blednie polacza aminokwas z tRNA. W jak sposdb synte- tazy aminoacylo-tRNA osiggnely taki wysoki stopiest specyficznosei? Kazda syntetaza aminoacylo-tRNA wykorzystuje wlasciwosci swaistego aminokwasu. Preyjrzyjmy sig wyzwaniu, jakiemu musi sprosta¢ syntetaza treonylo-tRNA. ‘Treonina jest bardzo podobna do dwéch innych aminokwaséw — waliny iseryny. Treonina rééni sie od waliny tylko obecnoscig grupy hydroksylowe] W migjscu grupy metylowej. Seryna natomiast, podobnie jak treonina, ma grupe hydroksylowa, a nie ma grupy metylowej, W jaki sposdb syntetaza treo- rylo-RNA potrafi wyeliminowaé modliwosé przylaczania blednych amino- kwasdw do swoistego tRNA? Analiza struktury przestrzenne} miejsca wigzania aminokwasu w synte- tazie treonylo-tRNA wyjasnia, w jaki spos6b enzym ten climinuje mozliwosé blednego rozpoznania waliny (rys. 30.7). Enzym zawiera jon cynku, zwigzany znim przez dwie reszty histydyny i jedng resztg cysteinowa. Podobnic jak Rys.30.7 Struktura miejsca aktywnego syntetazy treonylo-tRNA Miejsce wigzania aminokwasu zawiera Jon cynku {kolor zielony) koordynujacy treonine poprzez je| grupy aminowa Thydrotsylowa, 867 30.2 Syntetazy aminoacylo-tRNA Rawr acyloadenylan zazek posedai ° sn J tena a aminoacylo-RNA,868 Ee ROZDZIAL 30 Synteza biatka Korea Rys. 308 Miejsce korekcyine. “© sMeroda mutagenezy ustalono gdzle anajduje sg miejsce korekcyjne (kolor aielony] w syntetane treonylo-tRNA Na rysunku przedstawiono tyko jedna ppodjednosthe dimeryconego eneymu. Na kolejryech rysunkach przedstawiono rewnies tylko jedha pocjednostke dimeru, [2a 10F6pab] ‘miejsce korekgi micjsce aktywaci Rys.30.9 Korekeja aminoacylo-tRNA, Gigtkie amie CCA arninoacylo-tRNA mote przenosi¢ aminokwas od migjsca aktywacj do miejsca korekcj Jeli aminokwas pasuie do miejsca korekeyjnego, aminokwas zostanie usunigty na drodze hydraliy, w prrypadku anhydrazy weglanowej (6. 255), pozostale wiazania koordyna- cyjne sa wykorzystywane do oddzialywari z substratem. Treonina tworzy je z jonem cynku poptzez swoja grupe aminowa i grupe hydroksylowa karicucha bocznego. Ta sama grupa hydroksylowa jest dodatkowo rozpoznawana przez reszte asparaginianu tworzac z nim wiqzanie wodorowe. Natomiast grupa metylowa waliny, znajdujaca sig w miejseu grupy hydroksylowej treoniny, nie moze braé udzialu w tych oddzialywaniach; walina zostaje wige wykluczona Z miejsca aktywnego, a co za tym idzie, nie jest adenylowana i przenoszona na treonylo-LRNA [w skrdcie (RNA™"), NaleZy zauwaiyé, Ze grupa karboksy- Jowa aminokwasu nie jest uwiklana w zadne oddzialywania i moze atakowaé a-fosforan ATP, aby utworzyé aminoacyloadenylan. Inne syntetazy aminoacy- o-tRINA rozwinely odmienne strategie w celu prawidlowego rozpoznania swo- istego aminokwasu; wykorzystanie jonu cynku wydaje sig charakterystyezne tylko dla syntetazy treonylo-tRNA. Miejsce wigzania cynku jest natomiast mniej przydatne w procesie odréi- niania seryny od treoniny, ze wegledu na to, Ze seryna réwniez zawiera grupe hydroksylowa zdolna do wiazania cynku, Gdyby syntetaza treonylo-tRNA wykorzystywala tylko mechanizm opisany wydej, wiaczalaby biednie seryng do treonylo-tRNA z czestoscig jeden raz na 10° do 10° poprawnie wlgczo- nych res2t treoninowyeh. Jak wspominalismy na s, 862, taka czestosé bledsw prowadzitaby do licznych pomylek translacyjnych, Zatem, enzym musi byé bardziej specyficeny. Jak to sig dzieje? Aktywnosé korekcyjna syntetaz aminoacyl-tRNA zwieksza poprawnosé syntezy biatka Kiedy syntetaze treonylo-tRNA inkubuje sig z t(RNA™ blednie kowalencyjnie polgczonym zseryna (SertRNA'™), dochodzi do szybkiej hydrolizy aminoacy- Jo-tRNA i uwolnienia seryny i URNA. W przeciwieristwie do opisanej sytuacji inkubacja prawidlowo naladowanego tRNA! (ThrtRNA™) nie prowadzi do tej reakeji. Wynika stad, ze syntetaza treonylo-tRNA zawiera dodatkowe miejsce funkejonalne, w ktdrym dochodzi do hydrolizy Ser-tRNA™", ale nie Thr-tRNA™. Aktywnosé korekcyjna umoiliwia syntetazie naprawe bledéw izmniejszenie czgstosci pomytek do mniej niz jeden blad na 10°. Wyniki badati strukturalnych oraz badaii z zastosowaniem mutagenezy wykazaly, ze miejsce odpowiedzialne za aktywnos¢ korekcyjna znajduje sig w odleglosci wiekszej ni 2,0:nm (20 A) od miejsca aktywnego enzymu (rys. 30.8). Miejsce to 2 lanwoseig przyjmuje i hydrolizuje Ser-tRNA™', natomiast nie hydrolizuje Thr-tRNA™, ‘Odrdznienie seryny od treoniny jest stosunkowo latwe, poniewad treonina za. wiera dodatkowa grupe metylowa; miejsce przystosowane do struktury seryny wykluezy, ze wzgled6w sterycznych, treoning. Wiekszosé syntetaz aminoacylo-tRNA zawiera centra acylujace i hydroli- tyczne. Para uzupelniajacych sig miejse pelni funkeje podwéjnego sita, zapew- niajge duza specyficznosé aminoacylacji. Centrum acylujace odrzuca amino- kwasy wigksze niz wlasciwy — z powodu zbyt malych wymiardw tego centrum, natomiast w centrum hydrolityeznym usuwane sq produkty, ktdre sq mniejsze niz prawidlowe. Analiza struktury przestrzennej kompleksu syntetazy treonylo-tRNA i je) substratu wykazala, Ze aminoacylowany koniec CCA moze sig poruszaé i opusz- czaé centrum acylagji, aby przeniesé sig do centrum hydrolitycznego (rys. 30.9) Wynika stad, ze aminoacylo-tRNA moze zostaé skorygowany bez koniecznosei coxdysocjowania od syntetazy. Ten sposéb naprawy bledu, w due} mierze za- leany od konformacyjnej gietkosci krétkiego odeinka sekwencji polinukleoty- owe}, jest analogiczny do sposobu wykorzystywanego przez polimerazy DNA 6. 807), W obu przypadkach korekta bez dysocjacji enzymu znaczaco zwigksea wiernosé odezytu, przy niewielkich kosztach czasu i energii. Niektore syntetazy osiagnely jednak bardzo duza dokladnos¢ bez stoso- wania mechanizmu korygujacego. Przykladem jest syntetaza tyrozylo-tRNA,E | | | tra nie ma Zadnych trudnosei w odréénieniu tyrozyny od feny- loalaniny; grupa hydroksylowa 2wiazana z pierscieniem aroma- tycznym tyrozyny umoiliwia 10° razy silniejsze zwiazanie sig tego aminokwasu z enzymem w pordwnaniu z fenyloalaning. System korekeyjny zostal ewolucyjnie utrwalony tylko wéwczas, gdy popraw- nnosé reakeji musiata byé zwiekszona ponad te, ktéra mozna byto osiagnac praez wstepne wigzanie aminokwas-enzym. Syntetazy rozpoznaja réznorodne cechy transportujacych RNA W jaki spos6b syntetazy rozpoznaja swoiste czasteczki tRNA? Jest to niezwykle wazny etap translacji, Dochodzi w nim do powiaza- nia Swiata aminokwas6w i Swiata kwasdw nukleinowych, W tym sensie syntetazy aminoacylo-tRNA sq jedynymi czasteczkami biologicenymi, ktére ,rozumiejg” kod genetyczny. Precyzyjne rozpoznanie przez te enzymy zarwno czasteczek tRNA, jak iminokwas6w odgrywa zasadnicza role w wiernej syntezie bialka. Z reguly w przypadku kazdej syntetazy i jej swoistego tRNA inne cechy czasteczek sq istotne we wzajemnym rozpoznaniu. Zatem ustalenie regul rozpoznania jest trudne. Rozpatramy teraz dwa przyklady oddzialywat syntctaza~swoisty RNA. eB ‘Wydaje sig, 2 antykodon tRNA méglby byé dobrym elemen- ramig akceptorowe entykodonowa miejsce horekei, Rys.30.10 Kompleks syntetazy treonylo-tRNA Struktura kompleksu syntetaza treonylo-tRNA 1ARNAT, Syntetaza wiate zarSwno ramie akceptorowe, tem nadajacym tym czasteczkom indywidualny charakter, a {0 dla- jak ipetle antykodonowa crasteczld tRNA. (Za: 1QF6.pb.] tego, Ze kazdy rodzaj tRNA ma sw6j specyficzny antykodon, W rzeczy samej niektére syntetazy rozpoznajq swoiste dla nich czgsteczki tRNA gléwnie na podstawie sekwencji antykodonu, chociaz moga one rozpoznawaé réwniez inne elementy struktury {RNA. Najbardziej przekonujgcych dowodow tego sposobu rozpoznania dostarczyly badania krystalograficzne komplekssw syntetaz z ich swoistymi (RNA. Rozwazmy na przyklad sirukture kompleksu syntetazy treonylo-tRNA i tRNA! (rys, 30.10). Jak oczekiwano, ramig CCA sigga do centrum acylacji zawierajacego cynk. Jest ono optymalnie zoriento- wane, by przyjaé treoning od treonyloadenylanu, Enzym oddzialuje nie tylko zramieniem akceptorowym, ale réwniez z petla antykodonowa. Szczegdinie te ostatnie oddzialywania duzo wyjasniajg. Kazda z zasad sekwencji antyko- donu 5'-CGU-3' bierze udzial w tworzeniu wiazan wodorowych z enzymem; wigzania, w ktérych biorg udzial G i U, wydaja sig bardziej istotne, ponicwaz Cmoée byé zastapione przez G lub U bez zmniejszenia wydajnosci reakeji acy- lacji. Wyniki badati prowadzonych w drodze mutagenezy dostarczyly dodatko- vwych informacji na temat specyficznego rozpoznania RNA przez syntetaze aminoacyl-tRNA. Na przyklad, (RNA z E. coli réni sig od tRNAA"* w 40 pozycjach i zawiera pare zasad C-G w pozycjach 3 : 70. Jesli zamienié pare C-G na pare G-U (nie jest to klasyezna para typu Watson-Crick), to (RNAS jest rozpoznawany przez syntetaze alaninowa tak, jakby to byl RNA“"". Czy zatem fragment tRNA jest wystarezajacym substrate w reakeji aminoacylacji katalizowanej przez syntetaze alanylotRNA? Rzeczywiscie, ,mikrohelisa” zawierajaca tylko 24 z 76 nukleotydéw wyjsciowego (RNA jest specyficznie aminoacylowana przez te syntetaze. Mikrohelisa zawiera tylko ramig akcepto- rowe i zamykajaca ja petle (rys. 30.11). Wynika stad wniosek, ze dla niektérych syntetaz mozliwa jest specyficzna aminoacylacja nawet w nieobecnosci petli antykodonowej. Syntetazy aminoacylo-tRNA moina podzielié na dwie klasy AY Dis kaidego aminokwasaisniefe przynajmniejjedna swoista spatetaza aminoacylo-tRNA. Réznorodnos¢ wielkosci, sktadu podjednostkowego oraz, sekweneji aminokwasowej tych enzyméw przyprawialy uezonych przez wicle lat o bol glowy. Czy jest modliwe, ze wszystkie syntetazy ewoluowaly nie- Renanaa Sees =o A we Rys.30.1 Mikrohelisa rozpoznawana przez syntetaze alanylo-tRNA. Struktura Spink’ do wloséw, 0 dlugos zalediie 24 nutleotydsw, kere) ramig odpowiada ramieniu akceptorowemu tRNA**, ulega aminoacylacji praez syntetaze alanylo- RNA, 869870 7 ROZDZIAL30 Synteza biatka Rye 3012 Katy syntetaz ® aminoacyl-tRNA. Sytetazy naletace do Hlasy 1 Kasy I rozpomnaja r61ne strony castecld RNA. Roig CCA prymufe odmienne konformacje w kempleteach 2 sytetaza Hay Ii Na ryuntach Koniee CCA jest kevowary w stone exytlna pate rys. 304 1305} (2s IEUY pdb. 1OF6pdb] “TaBeLA30.2. Klasyfikacia | struktura podjednostkowa syntetaz aminoacylo- ARNA E.coli isa Wasa argo) 7 (a Sie a) nf a) lute Siva.) eta) Wis) teu sta) et heh) to) Ser} Tyla) Pro a) valla Tha} zaleénie od siebie? Ustalenie struktury przestrzennej kilku syntetaz, a nastep- nie dokladne pordwnanie ich sekweneji aminokwasowych wykazalo, Ze rine syntetazy sq jednak ze soba spokrewnione. Syntetazy mozna podzielié na dwie Klasy, nazywane klasq 1 klasg I. Syntetazy specyticznie rozpoznajace 10 spo- Sr6d 20 podstawowych aminokwas6w naleia do jednej klasy, a rozpoznajace pozostale 10 — do drugiej (tab. 30.2). Dokonano interesujace} obserwacji: ot6i syntetazy nalezqce do dwéch klas rozpoznajg rézne strony” czasteczki tRNA. (rys. 30.12). Ramig CCA czasteczki RNA przyjmuje rézne konformacje, do- stosowujae sig do tych oddzialywart: dla enzyméw klasy IT ramig ma konforma- cig helikalna, taka sama jak w wolnych tRNA (patrz rys. 30.4 130.5), a w przy- padku enzym6w klasy I przyjmuje konformacje spinki do wlosow. Obie klasy charakteryzuja sig ponadto innymi, odmiennymi wlasciwosciami. 1. Enzymy klasy I acyluja grupe 2-hydroksylowa ostatniej adenozyny tRNA, natomiast enzymy klasy IT acylyja hydroksyl 3' (wyjatek stanowi syntetaza fe- nyloalaninowa), 2. Dwie Klasy syntetaz wigza ATP w odmienny sposdb, 3. Wigkszosé enzyméw klasy | ma budowg monomeryczna, natomiast wiek- szosé enzyméw klasy II wystepuje w formie dimerycznej Diaczego powstaly dwie rézne klasy syntetaz aminoacylo-tRNA? Obserwacja, ée te dwie klasy wiaéa rééne ,strony”czasteczki tRNA, nasuwa moéliwe wyjasnienic. Wykorzystanie micjsc rozpoznania na réinych ,stro- nach” tRNA moglo byé niezbedne do prawidlowego rozpoznania i identyfika- ji wszystkich tRNA. 30.3. Rybosom jest czastka rybonukleoproteinowa (705) zbudowana z matej (305) i duzej (50S) podjednostki Zajmiemy sig obecnie rybosomami, molekularnymi maszynami koordynujq- cymi prace NA, mRNA j bialek w procesie syntezy polipeptydéw. Rybosom E. coli jest czastka sktadajaca sig z kwas6w rybonukleinowych i bialek, a jego masa wynosi okolo 2500 kDa, srednica w przyblizeniu 25,0 nm (250 A), a wspalezynnik sedymentacji 70S. W komérce bakteryjnej znajduje sig okolo 20 000 rybosoméw, co stanowi prawie jedng czwarta masy komorki. Rybosom dysocjuje na dwie podjednostki: duiq (50S) i malq (308), Podjednostki te mozna dalej rozlozy¢ na biatka i czasteczki RNA. Mala pod- Jednostka rybosomowa zawiera 21 réénych bialek (oznaczonych od SI do $21) i czasteczke RNA 0 wspolezynniku sedymentacji 16S. Z kolei duza podjed- nostka zawiera 34 rééne bialka (oznaczone od Li do L34) i dwie czasteczki | |podjednostha 505 RNA, 23S i SS. Rybosom zawicra po jednej kopii kazdego rodzaju RNA, po dwie kopie L7 i L12 i po jednej kopii pozostalych bialek. L7 i L12 r6 tylko obecnoscig grupy acetylowej na koricu N biatka L7. Obie podjednostki mana ponownie zlozy¢ (rekonstytuowaé) in vitro z ich poszczegdlnych czesci skladowych. Po raz pierwszy dokonal tego Masayasu Nomura w 1968 roku. Rekonstytucja rybosomu jest znakomitym prayktadem zasady, ze wielkoczgstecz- kowe kompleksy mogq sie odtwarzaé spontanicznie ze swoich skladnik6w. Badania rybosomu z uzyciem mikroskopii elektronowe} 0 coraz wiekszej rozdzielezosei doprowadzily do poznania ogsinego ksztaltu te) rybonukleo- proteiny, a takée pozwolily na okrestenic micjse wiazacych czasteczki (RNA. Zdumiewajgcy postep w badaniach nad struktura rybosomu zostal dokonany zuzyciem metod krystalografii rentgenowskiej. Pionierskie badania w tym za- kresie przeprowadzita Ada Yonath. Ustalila ona struktury obu podjednostek rybosomowych (30S i 50S) pray rordzielezosci zbliione} do atomoweis struk- tura catego rybosomu 70S zostala wkrétce réwnied rozwigzana (rys. 30.13). Je] ustalenie wymagato zlokalizowania ponad 100 000 atomow. Cechy rozwigza- nych struktur obu podjednostck, a takze calych rybosoméw, potwierdzily wiele wlasciwosei opisanych juz wezesniej, z uzyciem bardziej posrednich metod. Uzyskanie tak dokladnych struktur rybosomu jest wspanialym punktem wyj- Scia do dalszych badaii nad mechanizmem syntezy bialka. Rybosomowe RNA (5S, 165 i 235 rRNA) odgrywaja gléwna role wesyntezie biatka Praedrostek rybo w nazwie rybosomu jest bardzo trafny, poniewaz dwie trzecie masy tej czqstki stanowi RNA. Trzy rodzaje RNA obecne w rybosomie ~ 5S, 16S i 23S sq podstawowe, jesli chodzi o budowe i funkcje rybosomu. Powstaja one na drodze specyficznego rozcinania pierwotnego transkryptu 0 wspal- czynniku sedymentacji réwnym 30S. Zestaw parujacych sig ze soba zasad Ww tych czasteczkach zostal wydedukowany na podstawie dwojakiego rodzaju doswiadezen. W pierwszych pordwnano sekwencje nukleotydowa czasteczck FRNA z wielu gatunkéw w celu wykrycia w nich konserwatywaych rejondw. Na prayktad, w RNA organizméw jednego gatunku wystepowala para zasad G-C, aw RNA organizméw drugiego gatunku ~ para A-U. Lokalizacja tych par w czqsteczkach RNA byla jednak taka sama. W drugich modyfikowano chemicenie zasady, a nastepnic RNA poddawano hydrolizie (rys. 30.14). Dazigki tym eksperymentom ustalono réwniez pewna szczegéing ceche czaste~ czek rRNA, Okazalo sie, Ze rybosomowe RNA tworzq w preestrzeni Seisle okres- lone struktury z wieloma krétkimi rejonami helikalnymi, Wnioski te, iw zasadzic ‘wszystkie istotne cechy struktury drugorzedowej rRNA, zostaly potwierdzone daicki zastosowaniu rentgenografii strukturalne}. jp; 195 3018 _Strutzua rybosomw uzyskana metodami duze) roxdzielezosci, Suczegtowe modele rybosomow uzyskane na podstawie ‘wynikéw bad z udyciem krystalografl rentgenowskie|rybosoméw 70S oraz podjednostek 305 1 50S. 235 RNA —kolor 20lty, 5S RNA — kolor pomaraficzowy, 16S TRINA — kolor 2ielony, bialka podjednosti 505 —kolor czerwony, biatka podjednostk! 30S — kolornicbiesk. Zauwad, te odleglose ‘migdzy podjednostkami $05 | 305 sklada sie calkowicie 2 RNA [Za: IGIXpdb,, 1GIY.pdb] 71Fc @ erie vaunted 4 Mebecces, plemnogen eagucubiee ‘i 4 Ng Mekuy : rae E ea Hi AS “etecty Atha, e 872 teed iucuccnetthih Gg, 1. 4 fag, AES UIIE IUIEE : ged” spent ost tiie gee ein Op ope Prageaunensy a cn A Te rae pT =p 19830 Struleura ybosomowego RNA (A) Strultura dugorzedowa 1S ANA zhudowane na podstawie badah porwnawcaych selene) nukleotydowe} 65 rRNA elu organizméw prokariotycznych oraz na podstawie badaf chemicenych, (2) Stetura trzeciorzgdowa 165 rRNA ustalona na podstawe kystalografi rentgenowski (A) det upraejmosc:r. Bryn Weiser, Or. Harty Noll. 8) 22: FIG pcb]Przez wiele lat uwazano, Ze to bialka rybosomowe petnia gléwna funk- jg w syntezie bialka, a RNA sludy jedynie jako szkielet strukturalny. Obecnie nasze poglady 2mienily sig zasadniczo. Odkrycie czasteczek RNA © whasciwosciach Katalitycznych uzmystowilo biochemikom, ze RNA mode odgrywaé w rybosomie znacznie bardziej aktywna role. Poznanie dokladne} struktury rybosomu wykazalo, ze istotne z punktu widzenia pelnionych funk- ji miejsca rybosomu zbudowane sq niemal wylgcenie z RNA. Udzial bialek w budowie tych micjse jest minimalny. Wiele z tyeh bialek charakteryzuje sig podluénym ksztaltem, ktéry pozwala im sig ,wslizgiwaé” w szkielet zbudowany RNA. Wniosek plynacy z tych odkryé jest taki, Ze rybosomy najprawdopo- dobniej byly pierwotnie zbudowane tylko z RNA, natomiast bialka pojawily sig péniej, w celu dalszego udoskonalania dzialania rybosomu, Odkrycie 10 pozwala odpowiedzieé na pytanie ,co bylo pierwsze: jajko czy kura?”, czyli, czy pierwszy byt rybosom (zbudowany miedzy innymi z bialek), czy tez bialka, Ktére przecie# powstajg dzieki jego dziataniu podczas translacji Biatka sq syntetyzowane od kofica aminowego do karboksylowego Zanim rozpoczniemy omawianie mechanizmu syntezy biatka, musimy ustalié kilka faktéw, Badania przeprowadzone przez Howarda Dintzisa metoda zna- kowania pulsacyjnego (ang. pulse-labeling) jednoznacznie ustalily, ze synteza bialka rozpoczyna sig od korica aminowego. Retikulocyty (mlode krwinki czerwone), w ktérych zachodzila intensywna synteza hemoglobiny, poddano krotkotrwatemu dziataniu leucyny znakowanej *H. Pobierano probki hemoglo- biny w odstepach krétszych niz okres potrzebny do syntezy kompletnego faii- cucha. Uzyskana hemoglobing rozdzielono na laricuchy polipeptydowe « i a nastepnie analizowano rozklad *H w obrebie ich sekwencji aminokwasowe). W probkach, ktére pobrano najwezesnie} po podaniu znakowanego amino- kwasu, radioaktywne byly tylko korice karboksylowe polipeptydéw. W pééniej pobranych probkach radioaktywnosé pojawiala sig coraz blizej korica amino- ‘wego, Takicgo rozkladu radioaktywnosci mozna bylo oczekiwaé tylko wtedy, jesli korice aminowe wielu faricuch6w zostaly zsyntetyzowane, zanim podano radioaktywny aminokwas, Eksperyment ten pokiizat, ze faricuch polipeptydowy rosnie w kierunku od korica aminowego do karboksylowego. Translacja informacyjnego RNA przebiega w kierunku 5'—> 3! ow w bialku wynika bezposrednio z sekweneji nukleoty- t kicrunck odezytywania mRNA? Odpowied¢ uzyskano wykonujac eksperyment, w ktérym wykarzystano syntetyczny polinukleotyd 5 x R-AA-4£A-AAJ- AAS sluéqcy jako matryca w bezkomérkowym ukladzie syntetyzujacym bialko. AAA koduje lizyne, natomiast AAC koduje asparagine. Jako produkt reakeji pojawil sig potipeptyd 0 nastepujacym skladzie HSN ys —Ubys)-Asn—¢ ~ ‘0 Poniewaz obeenos¢ asparaginy stwierdzono na koricu karboksylowym po- lipeptydu, kodon AAC musial byé ostatnim czytanym kodonem. Wynika stad, 4 podczas translacji mRNA odezytywany jest w kierunku 5'—» 3! (s. 831). Jest kie~ runek translacji bylby odwrotny do kierunku transkrypaji translacji ulegalyby tylko w pelni zsyntetyzowane czasteczki mRNA. Jesti natomiast kicrunck jest len sam, to MRNA mo‘e ulegaé translagji juz w ezasie swojej syntezy. U orga- nizméw prokariotycznych translacja zaczyna sig tué po rozpoczeciu transkryp- 873 303 Rybosomys. 30.15. Polisomy. Transkrypcja odcinka ONA E.coli prowadsi do powstania czgsteczek mRNA Ulegalacych natychmiast traslac|i praez licane rybosomy. (2: OL Mller, Jr BAA Hamlalo, CA. Thomas, J. Science 169(1970}392-395] Rys. 30.16 Miejsca inicjagi. Sekwencje mies incjaci biosyntezy biatka wrniektorych cagsteczlach mRNA pochodzenia bakteryjnego | wirusowego, Porownanie wskazuje na abecnaté pewnych wspolnych sekwencji 874 . Koniee ' mRNA wiaze sie zrybosomem, edy tylko zostanie zsyntetyzowany, na dlugo przed zakoriczeniem syntezy kofica 3’ mRNA. Istotng cechq ekspresji _gendw prokariotycznych jest scisle zwiqzanie transkrypcji i translacji w czasie iw przestrzeni, Wiele rybosoméw réwnoczesnie moze ,tlumaczy<” jedng czas- teczke mRNA. Réwnolegle prowadzona synteza bialka znacanie cwigksca wydajnosé wykorzystania mRNA. Zbiér rybosoméw zwiazanych z jedng cza- steczka mRNA nazywa sie polirybosomem lub polisomem (rys. 30.15). Kodon AUG zazwyczaj oznacza sygnat startu i jest poprzedzony kilkoma zasadami parujacymi sie z 16S rRNA Jak rozpoczyna sig synteza bialka’) Najprostsza moZliwosé, w kt6rejtrzy pierwsze nukleotydy mRNA sq rwnoczesnie pierwszym kodonem, nie wymagalaby obec- nosci specjalnego sygnalu ,start”. Jednakie udowodniono eksperymentalnie, ze translacja nie rozpoczyna sig od samego poczatku korica 5 mRNA. W rze- czywistosci, pierwszy odezytywany kodon jest niemal zawsze oddalony © ponad 25 nukleotydéw od korica 5 mRNA. Dodatkowo, u prokariot6w wiele cagsteczek mRNA to czasteczki policistronowe (poligenowe), co oznacza, Ze koduja one dwa lub wigce laricuchsw polipeptydowych. Na przyktad, u E. col! pojedyncza cza- steczka mRNA o dlugosci okolo 7000 nukleotydéw koduje pieé enzymaw szlaku biosyntezy tryptofanu. Kaide z tych pigciu bialek ma swéj sygnal start i sygnat stop. Wiadomo, Ze wszystkie znane czasteczki mRNA zawieraig sygnaty definiviace poczqiek i Koniec kaidego kodowanego taiicucha polipeptydowego. Punktem wyjseia do poznania mechanizmu inicjacji translacji bylo odkry- cie, Ze niemal potowa bialek . coli ma na swoim koricu aminowym metioning. Rzeczywiscie, kodonem iniejujgeym w mRNA jest kodon AUG (metionina), znacznie rzadziej GUG (walina) lub bardzo radko UUG (leucyna). Jakie jeszeze dodatkowe sygnaly sa potrzebne do zidentyfikowania kodonu inicju- jacego translacjg? Pierwszym krokiem w kierunku uzyskania odpowiedzi nna to pytanie byto wyizolowanie rejon6w inicjatorowych wielu réznych mRNA. Rejony te mona wyizolawaé przez trawienie komplekséw mRNA™rybosom (tworzonych w warunkach umodliwiajacych inicjacje syntezy polipeptydu, lecz nie elongacje) rybonukleaza tr2ustkowa. W kazdym przypadku pewne odeinki mRNA 0 dlugosci okolo 30 nukleotydéw byly chronione przed trawieniem. Zgodnie z oczekiwaniem kaédy z odeink6w inicjatorowych mRNA zawieral kodon AUG (lub GUG badé UUG) (rys. 30.16). Dodatkowo, kazdy rejon ini- Gjatorowy charakteryzowal sig sekwenejg bogata w puryny, ktdra znajdowala sie po stronie 5’ kodonu start, okolo 10 nukleotydéw przed nim, Znaczenie tego bogatego w puryny rejonu, nazwanego sekwencig Shine Dalgarno, zostalo wyjasnione z chwila poznania pelne} sekwencji nukleoty- arn do sekweneji Shine-Dalgarno, Zamiana sekweneji CCUCC znajdujacej sig bli- sko korica 3' 168 rRNA w drodze mutagenezy na sekwenejg ACACA znacznie AGCACGAGGGGAAAUCUGAUEGARCGCUAC trpa col UUUGGAUGGAGUGAAACGAUGGCGAUUGCA araB col CGUAACCAGGUAACARCCAUGCCAGUGUUG tra E col CAAUUCAGGGUGCUGAAUGUGARACCAGUA fac co AAUCUUGGAGGCUUUUUUAUECUUCGUUCU biako A fog ox178, UAACURAGGAUGAAAUGCAUGUCUAAGACA replaza fga 05, UCCUAGGAGGULUGACCURUGCCAGCUUUU biako A fagp R17 AUGUACURAGGAGGUUGUAUGGAACAACGC crofaga a atu sie pane se 2P1eS RNA. iniatoraye tRNAutrudnia rozpoznanie w mRNA kodonu inicjujacego. Odkrycie to oraz inne dowody pokazuja, Ze rejon inicjatorowy mRNA wiaze sig z 16S rRNA w rejo- Z opisanych doswiadezert wynika, 42e dwa rodzaje oddzialywari decydujq 0 wyborze miejsca stariu syntezy bialka: 1) parowanie sie zasad mRNA z koricem 3° 165 rRNA oraz 2) parowanie sie ko- donu start z antykodonem tRNA inicjatorowego. Bakteryjna synteze Metionina, znajdujgca sig na koricu aminowym bialek E. coli, jest zazwyczaj modyfikowana. Synieza biatka w bakteriach rozpoczyna sie N-formylometioning (fMet). Formylometionine, w celu zapoczatkowania syntezy bialka, dostarcza do rybosomu specjalny tRNA. Ten 1RNA inicjatorowy (oznaczony skrotem tRNAy) réani sig od tRNA (skrétowo oznaczanego tRNAm) wlaczajacego me- tioning w pozostalych miejscach rosngcego laricucha polipeptydowego, Indeks foznacza, 2e metionina przylaczona do iniejatorowego tRNA ulega formylacji, natomiast przylaczona do tRNA», —nic. Aktywowanym donorem grupy formy- owe| w tej reakeji jest N"°-formyloczterohydrofolian.W przyblizeniu u polowy bialek £. coli dochodzi do usunigcia N-formylometioniny w momencie, gdy rosnacy Jaricuch polipeptydowy zaczyna wystawaé poza rybosom, Metionina jest przylaczana do tych dwéch tRNA przcz te sama synte- tazg aminoacylo-tRNA. Nastepnie inny enzym specyficznie dodaje grupe formylowa do kovica aminowego metioniny zwiazanej z tRNAy (rys. 30.17). ‘Transportujacy RNA; moze sig wiaza¢ z kaédym z trzech kodondw inicjuja- cych translacje, lecz 2 malejacym powinowactwem (AUG > GUG > UUG). Znamienne jest, Ze ani wolna metionina, ani metionylo-LRNA, nie sq substra- tami dla tej specylicznej formylotransferazy. iatek rozpoczyna formylometionylo-tRNA Rybosom zawiera trzy miejsca wigzania tRNA zlokalizowane nna pograniczu podjednostek 30S i 50S Nieawykle waznym momentem w rozumieniu mechanizmu syntezy bialka bylo rozwigzanie struktury rybosomu 70S z przylaczonymi trzema ezastecz- kami (RNA i fragmentem mRNA (rys. 30.18). Tak jak oczekiwano, fragment. mRNA jest zwigzany w obrebie podjednostki 30S, Natomiast kazda z ezaste- “ ®) 875 303 Rybosom RNA, rmetionina [prs ya “cs sea esionlo-tRNA, ‘tranny 1" oumylcztro hydeaolon uansiormylaza tac foxmometinyl-tRNA, iment Rys.30.17Tworzenie formylometionylo- ARIA, Inicjatorowy tRNA (IRNAA) zostaje ‘ajpierw zaminoacylowary meticnina, ‘a nastepnie dochodzi do transferu grupy foxrylowe| 2 N”-formyloczterohydrofolany na metionylo-tRNAg. mRNA mise E miejsce P miejsce A mmiejsce E miejsce Pisce A Rys.30.18 Miejsca wigzaniatransportujacych RNA. {A} W rybasomie 70S wystepuja tray miejsca wiazania tRNA. Okresla sig je ako A (od amninaacylo-tRNA}, P (od peptydylo- ARNA) iE fod angielskiego stowa exit —wy}Scie), Kaada 2 cagsteczek tRNA kontaktuje sig + ebydwiema podjednostkami (35 i505) rybosomu (8) CzasteczK! RNA w miejscach A i P ‘worza paty zasad z mRNA. (8) za: JGPpcb ]876 cack tRNA jest zwigzana z obydwiema podjednostkami. W przypadku podjed- ROZDZIAL 30 Synteza biatka nostki 30S dwie z trzech czasteczek tRNA sq zwiqzane z fragmentem mRNA poprzez parowanie sig zasad kodonu i antykodonu. Te miejsca wiqzania czas teczek tRNA nazywaja sie miejscem A (dla aminoacylo-tRNA) i miejscem P (dia peptydylo-tRNA). Trzecia czasteczka tRNA wiade sig z sqsiadujacym mijscem nazywanym micjscem E (ang. exit - wyjscie). Drugi koniec kazdej 2 czasteczek tRNA oddzialuje 2 podjednostka 50S. Ramiona akceptorowe czasteczek tRNA zajmujgcych miejsca A i P lokalizuja sig w rejonie odpowiedzialnym za synteze wiazania peptydowego. Dalsza analiza tego miejsca wykazala obccnosé tunclu ciagnacego sig az do tylnej strony rybo- somu. Tym wlasnie tunelem przechodzi, w trakcie syntezy, aricuch polipepiydony. W trakcie syntezy wigzania peptydowego rosnacy taficuch polipeptydowy jest przerzucany migdzy czasteczkami tRNA Synteza bialka rozpoczyna sig oddzialywaniem podjednostki 30S i mRNA po- przez sekweneje Shine-Dalgarno, Po utworzeniu tego kompleksu zaminoacylo- Wany formylometionina tRNA inicjatorowy wiaze sie z kodonem inicjatorowym AUG, Nasigpnie przylacza sig podjednostka 50S i powstaje kompletny, aktywny rybosom 70S. Jak dochodzi do syntezy laricucha polipeptydowego (rys. 30.19)? Na pytanie to pozwolily odpowiedzie¢ eksperymenty wyjasniajgce strukture 1)- bosomu 708 z praylaczonymi trzema czqsteczkami tINA i fragmentem mRNA. Inicjatorowy tRNA jest zwigzany z miejscem P rybosomu. Nastepnie, z miejscem ‘A wigge sig zaminoacylowany RNA, ktGrego antykodon jest komplementarny do kodonu znajdujgcego sie w tym czasie w miejscu A. W opisanym komplek- sie znajduje sie wszystko, co jest potrzebne do syntezy wigzania peptydowego: czasteczka formylometioniny zwigzana z inicjatorowym tRNA zostaje przenie- siona na grupe aminowa aminokwasu, ktory jest wiazany z RNA zajmujgcym migjsce A, Reakeja ta jest reakejg spontaniczna, katalizowang przez okreslone miejsce w 238 rRNA, zwane centrum peptydslotransferazowym. Grupa aminowa aminoacylo-tRNA 7 miejsca A ma optymalng orientacje, aby zaatakowaé wiazanie estrowe migdzy tRNA inicjatorowym a formylome- eee > L f@ge @ wizanie ‘worzenie wigzania 305, aminoago-tRNA epiydomege cr wanslotaca | eloneacia ‘ayn G Rys.3019 Mechanizm biosyntezy biatha, oor +P, ‘Gykl tozpoczyna sie wprowadzeniem — Peptydylo-IRNA w mice P. Amincacylo- “tRNA zajmuje miejsce A W momencie 30) oba mien cle dochode ( to ori wien pevidows ebo le Capstech NA NA gaa tranloagj cig okt anotd eyes elongacyinego & (6) Kory wymusea ‘ eee ieveaniowmegaitn do mica Rastepre RNA ogc sip ont, (od ybosorm ty samy Key“ nH — ey ~~, ge ay wrva L Rie tRNA peRien on H ons > » o ‘RNA RNa RNA (ieisce a) tetaedne cain ps ys 3020 Tworzenie wigzania peptydowego. Grupa aminowa aminoacylo-tRNA atakuje _tupe karbonylowa wigzania estrowego w peptydylo-tRNA. Tworzy sig tetraedryceny produkt posredri. Produkt ten rozpada sig, dajgc wiqzanie peptydowe | uwalniajac deacylowany tRNA, tioning (rys. 30.20). Centrum peptydylotransferazowe zawiera zasady przyczy- niajgce sig do tej reakeji poprzez pomoc w aktywowaniu grupy—NH) w amino- acylo-ARNA okupujacym miejsce A, a takze poprzez stabilizacje utworzonego tetraedrycznego zwigzku postedniego. Mechanizm tej reakcji jest w duzym stopniu analogiczny do mechanizmu reakeji katalizowane} przez proteazy serynowe, takie jak chymotrypsyna (6. 247). Peptydylo-tRINA jest analogiem acyloenzymu tworzonego przez proteazy serynowe. W proteazach serynowych zeyloenzym tworzy sig kosztem energii uwalnianej z reakcji rozciecia amidowego. W rybosomie energia potrzebna do utworzenia analogicenego zwigzku - aminoacylo-tRNA pochodziz ATP hydrolizowanego przez syntetaze aminoacyl-tRNA przed ,przybyciem” tego zaminoacylowanego tRNA do ry- bosomu. Innymi stowy, energia potrzebna na utworzenie tego wigzania zostaka jué zmagazynowana wezesniej, w trakeie tworzenia aminoacylo-ARNA. Po utworzeniu wigzania peptydowego faticuch peptydowy jest przykaczony do tRNA znajdujacego sig w micjscu A w obrebie podjednostki 30S, podezas gdy ziniana oddzialywar w obrebie podjednostki SOS lokuje ten tRNA z peptydem \w obrebie czesci miejsca P duzej podjednostki. Transferowy RNA, nadal okupu- {acy miejsce P w obrebie podjednostki 30S, nie zawiera aminokwasu. Aby proces {ranslacji még! byé kontynuowany, mRNA musi by¢ praesuniety (czyli musi ulec ‘ranslokagji) tak, aby kodon dla nastepnego aminokwasu znalazt sig w miejscu A. Translokacja zachodzi dzieki aktywnosci bialka enzymatycanego zwanego ceynnikiem elongacyjnym G (6. 880). Energi do tego procesu dostareza hiydro- liza GTP. Po zakoriczeniu tego etapu peptydylo-ARNA znajduje sig calkowicie ‘w miejscu P, a wolny tRNA inicjatorowy znajduje sig w miejscu E, nie oddzi lujac juz-z mRNA. Po dysocjacj inicjatorowego tRNA rybosom wraca do stanu ‘wyjsciowego, z tym jednak zastrzezeniem, Ze lascuch peptydowy jest obcenie ‘aiqzany 2 innym tRNA, odpowiadajacym pierwszemu kodonowi za kodonem AUG. Zauwaimy, Ze laricuch peptydowy pozostaje w obrebie migjsca P podjed- nostki 50S przez caly opisany wy2ej cykl, najprawdopodobniej rosnac w kierunku tunelu. Cykl ten powtarza sie wielokrotnie, jesli tylko nowy aminoacylo-IRNA pojawi sig w miejscu A. Earicuch polipeptydowy ulega ciaglemu wydhuz Tylko oddziatywania kodon-antykodon decyduja o wtaczeniu aminokwasu do rosnacego taricucha polipeptydowego Jak wynika z mechanizmu opisanego na s. 875, tylko tworzenie sie komplemen- tarnych par zasad antykodonu wprowadzanego do rybosomu tRNA i kodonu mRNA zajmujacego miejsce A decyduje o rodzaju aminokwasu przylaczanego 877 30.3 Rybosombialles antykodon er: —k-y-2— KY 2 kodon 3 ‘steing + tRNA — do laricucha polipeptydowego. Czy aminokwas przylaczony do tRNA petni jakas role w procesie rozpoznania? Odpowied# na pytanie uzyskano w naste pujacy sposdb. Najpierw do tRNA“ przylaczono cysteine, ktéra nastepnie w reakeji z niklem Raneya zostala przeksztalcona w alaning. Reakeja ta, zachodzaca na etapie Cys-tRNA“*, powoduje usunigcie atomu siarki z akty- wowanej cysteiny, bez naruszenia jej polaczenia z tRNA. W ten sposob uzy- skano hybrydowy aminoacylo-tRNA, w kt6rym alanina zostala kowalencyjnie zlqczona z tRNA specyficznym dla cysteiny. Ho aR, + + Jt AP AMP Hy hd be, —tt Sa ans, yaa TRNAS “Tike Raneye” “HN” #RNAS cyte seN I ° ystRNA ‘Ala-tRNAS Ktéry 2 kodonéw jest rozpoznawany przez ten hybrydowy aminoacylo- -tRNA: alaninowy czy cysteinowy? Odpowiedé na to pytanie uzyskano wprowadzajac ten RNA do bezkomérkowego ukladu syntetyzujacego bialko. Matryca byl polimer zawierajacy tylko U i G w stosunku 5: 1, co zazwyezaj pro- wadzi do whaczenia cysteiny (kodon UGU), ale nigdy alaniny (kodon GCN). W tym jednak przypadku do syntetyzowanego polipeptydu byla wlaczana alanina, pochodzgca z Ala-tRNA® dodanego do mieszaniny inkubacyjngj Identyczny wynik uzyskano stosujac jako matryce mRNA hemoglobiny i hy- brydowy aminoacylo-tRNA, znakowany C alanylo-tRNA*. Po trawieniu trypsyng okazalo sig, ze jedynym radioaktywnym peptydem byt peptyd nor- malnie nie zawierajacy alaniny, lecz cysteing. A wigc aminokwas 2wiqzany zaminoacylo-tRNA nie odgrywa zadnej roli w rozpoznaniu kodondw. Zdolnosé hybrydowych aminoacylo-ARNA do wiaczania aminokwas6w do rosnacego taricucha polipeptydowego wykorzystuje sig do syntezy peptydow © zmienionej sekwencji aminokwasowej. Czasteczki tRNA wiaze sig najpierw do nienaturalnego aminokwasu, wykorzystujac w tym celu metody chemiczne. Hybrydowe aminoacylo-tRNA dodaje sig do bezkomérkowego uktadu syn tyzujacego bialko wraz ze zmodyfikowanym mRNA, ktéry zawiera w okreslo- nych micjscach kodony rozpoznawane przez hybrydowy aminoacylo-tRNA. Produkowane bialka zawieraja w oczekiwanych pozycjach nienaturalne ami- nokwasy. Ponad 100 réznych zmienionych chemicznie aminokwasdw zostalo w ten sposéb whyczonych do bialek. Nalezy jednak pamigtaé, ze do tych celéw ‘modna wykorzystywa¢ jedynie L-aminokwasy; ze w2gledow stereochemicznych tylko one moga byé substratami w reakeji tworzenia wigzania peptydowego. Niektére czastec: z zasada tolerancji RNA rozpoznaja wigcej niz jeden kodon zgodnie Jakie prawa rzqdzq rozpoznaniem kodonu przezantykodon tRNA? Najprostsza hipoteza bylo przypuszczenie, ze kazda zasada kodonu tworzy wiazanie typu Watson-Crick z komplementarng zasada antykodonu. Kodon i antykodon musza byé wtedy ulozone wzgledem siebie antyrdwnolegle, W zamieszezonym obok schemacie litery ze znakiem prim (') oznaczajq zasady komplementarne. ‘Tak wige XiX' moga oznaczaé A iU (lub Ui A) albo GiC (lub Ci G). Zgodnie z przyjgtym zalozenicm dany antykodon rozpoznaje tylko jeden kodon, Fakty méwig jednak co innego. Niektdre czgsteczki tRNA moga rozpoznawaé wiece} nis jeden kodon, Preyktad stanowi RNA alaninowy z droadzy, ktory rozpoznaje trzy kodony: GCU, GCC i GCA. Dwie pierwsze litery tych kodo- now sq identyczne, a treecia ina. Czy oznacza to, Ze rozpoznanie trzec litery kodonu podlega mniejszym ograniczeniom nié rozpoznanie dwéch po- zostalych? Model zdegenerowanego kodu genetyeznego dopuszcza taka moi- liwosé. Kodony XYU i XYC koduja zawsze ten sam aminokwas, XYA i XYGzamwyczaj r6wnicz. Na podstawie tych danych Crick zaproponowal hipoteze, e kryteria przestrzenne parowania sig traeciej zasady kodonu moga byé mnie rygorystyczne, niz.w przypadku pazostalych dwéch zasad, Zbudowano modele réinych par zasad, by okreslig, ktGre z par praypominajg standardowe pary A-Ui G-C pod wzgledem odleglosei i kta migdzy wiazaniami glikozydowymi W badaniach tych uwzgledniono inozyne, poniewad obserwuie sig jej obecnosé wkilku antykodonach. Dopuszczajac pewna toleranejg przestrzenna (ang, wob- ble —chwiejnos¢) w tworzeniu par zasad przez trzecig zasade kodonu, ustalono, de moga zachodzié kombinacje parowati przedstawione w tabeli 30.3. Hipoteza tolerancji zostata potwierdzona eksperymentalnie. Antykodony czasteczek tRNA 0 znanych sekwenejach wiaza sie z kodonami przewidzia- aymi przez te hipoteze. Na przyktad, antykodon tRNA alaninowego IGC tozpoznaje kodony GCU, GCC i GCA. Przypomnijmy, ie sekwencje nukleo- tydowa piszemy 2wyczajowo zawsze w kierunku 5!— 3’, Tak wiec inozyna — 1 (pierwsza zasada 2 5' strony antykodonu) paruje sie z U, C lub A (pierwsza zasada 73’ strony kodonu), tak jak to przewidziano teoretyeznie, ryboza oe oy 4 rybora ryboza" aa rasad ara zasad Inoryne-aydyna inozyna-adenozyna Moina sformulowaé dwa uogslnienia dotyczace oddzialywati kodon— ~antykodon: 1. Dwie pierwsze zasady kodonu tworza pary z zasadami antykodonu w spo- s6b standardowy. Rozpoznanie jest precyzyjne. Wynika stad, 2e kodony réi- niqce sie zasadami w jednej z pierwsaych dwéch pozyeji muszq byé rozpoznawane przez réine czysieczki tRNA, Na prayklad, oba kodony UUA i UCA koduja leucyne, leez sq rozpoznawane przez r6zne tRNA. 2. Pierwsza zasada antykodonu decyduje o tym, czy dany tRNA rozpoznaje jeden, dwa czy trzy rodzaje kodonéw: C lub A w tej pozyeji umodliwia roz- oznanie jednego kodonu, U lub G — dwéch, natomiast I — trzech kodondw. Tak wige degeneracja kodu genetyeznego wynika czesciowo ze swobodniejszego arowania sie trzecie} zasady kodonu z pierwszq zasadq antykodonu. Widzimy tu przyezyne czgstego pojawiania sie w antykodonach inozyny, jednego ze 7modyfikowanych nukleozydéw. Inozyna umoiliwia czasteczce tRNA odezy- tanie az trzech kodondw. Inozyna jest tworzona w tRNA w reakeji deaminacji adenozyny na poziomie pierwotnego transkryptu. Diaczego zasada tolerancji dotyczy tylko trzecie} pozyeji kodonu, a nie pierw- saych dwéeh? W malej podjednostce rybosomu, w 16S rRNA znajduja sig dwie suczegsine reszty adenozynowe (A1492 | A1493) i reszta guanozynowa (G530), KiGre tworza wigzania wodorowe w obrebie malego rowka tylko prawidlowego ddupleksu kodon-antykodon (rys. 30.21). Oddzialywania te ,kontroluja”, czy die pierwsze zasady kodonu tworza w dupleksie z antykodonem pary typ Watson wh a4 Tantia 303 Moiliwosci parowania ‘traecie} zasady kodonu zgodnie zhipoteza tolerancji Pierwsza zasada Tinecia vasada antykodonu kodonu © G a u uv Alba S Unb i U.ChbA 165 RNA A1495, antykodon AS6 kodon Ur Rys. 30.21 Caasteczia 165 RNA kontroluje poprawnosé parowaf zasad kkodonantykodon, Adenina 1493, jedna ~trach konserwatywnych zasad w 16S FRNA tworzy wiazania wodorowe 2 asadami zar6wno kodonu, jak i antykodonu tylko wtedy, gdy odziaiywania aad w obrebie kodonu i antykodonu sq prawictowe, [z:JMOgle V. Ramakrishnan. Annu. Re, Biochem. 74{2005}129-17,rys, 2a] 879padjednostka rybosomowa 30S S0SxIF Is AUGTP) tet, omplets inicujacy 305 podjednostia 505 + 1,0 12,60 +, sia 705 Rys.30.22 Iniglacja transtac}t uprokariotéw. Czynnik iniciujace omagala naipierw utworzyc kompleks inicjujacy 308, a nastepnie kompleks inicjujacy 705. ago —Crick. Takie} kontrofi nie ma w przypadku trzeciej pozyeji kodonu, dlatego ‘wieksza jest tolerancja dla pojawiajgcych sie tam oddzialywan z pierwsza pozye)a antykodonu. Ten mechanizm zapewniajacy wiernos¢ rozpoznania jest analo- gicany do oddzialywari w obrebie malego rowka DNA, wykorzystywanych przez polimeraze DNA, a shuéqeych temu samemu celowi (s. 794). Tak wige rybosom codgrywa aktywng role w kontroli poprawnosci oddzialywea kodon—antykodon. 30.4. Czynniki biatkowe odgrywaja waina role w syntezie biatka Chociaz ezasteczki rRNA pelnia najwazniejsza role w translacji, czynniki bialkowe sq réwniez bezwzglednie potrzebne w procesie syntezy polipepty- dow. Czynniki biatkowe biorg udzial w inicjacji, elongacji i terminacji syntezy bialka. NTPazy zawierajgce motyw petli P (zwany inaczej petla P bogata ww reszty glicynowe), a nalezace do rodziny bialek G, odgrywaja tu szczegdinie waina Tole. Praypomnijmy sobie, 2e bialka te pelniq funkcje molekularnych przelacznikow podczas cyklicznego przechadzenia od formy zwiazanej 2 GTP do formy oddziatujacej z GDP (s. 387). Podczas tworzenia kompleksu inicjujacego 70S formylometionylo- -tRNAr zajmuje w rybosomie miejsce P Informacyjny RNA i formylometionylo-tRNA, musza byé dostarezone do bosomu, by zainicjowaé synteze biatka. W jaki spossb dochodzi do tego W procesie tym istotna role odgrywaja try biatka zwane czynnikami ini- cjujqeymi: TF1, IF2 i 13. Dwa caynniki, IF1 i IF3, tacza sig 2 podjednostka rybosomowa 30S (rys. 30.22). Ziviqzanie tych czynnikw z podjednostka 30S zapobiega przedwezesnemu przylaczeniu podjednostki 50S. Powstalby wtedy nieaktywny rybosom pozbawiony mRNA i fMet-tRNAy. IF] wiaze sie w po- bliéu miejsca A rybosomu i skierowuje fMet-RNA do miejsca P. Praylaczenie GTP przez IF2, biatko nalezace do rodziny bialek G, zmienia jego konforma- cjg i umoéliwia mu zasocjowanie z formylometionylo-tRNAy. Kompleks IF2~ -GTP-iniejatorowy tRNA wigde sig z mRNA (prawidlowo ulokowanym dzigki sekweneji Shine-Dalgarno oddzialujacej 2 16S TRNA) i podjednostka 30S, tworzac kompleks inicjujqcy 30S. Hydroliza GTP zwiqzanego x 1F2 nastepuje w momencie przylaczenia podjednostki 50S i powoduje uwolnienie czynnikow inigjujgeych. WV rezultacie powstaje kompleks inigjujacy 708. Utworzenic aktywnego kompleksu inicjujacego 70S oznacza stan gotowo- Sci rybosomu do przejicia w faze elongagji. Caasteczka fMet-tRNA; zajmuje na rybosomie miejsce P. Pozostale dwa miejsca dla czasteczek tRNA, miejsce Ai miejsce E—sq puste. Formylometionylo-tRNA; jest tak ulozony, ze jego anty- kodon paruie sig z kodonem startowym AUG (GUG lub UUG) znajdujacym sie wmRNA. To parowanie okresla wlasnic ramke odezytu dla calego mRNA. Czynniki elongacyjne dostarczaja aminoacyl-tRNA do rybosomu Druga faza syntezy bialka jest cykl elongacyjny. Cykl ten rozpoczyna sig wprowadzeniem aminoacylo-tRNA w puste miejsce A rybosomu. O tym, jaki konkretnie aminoacylo-tRNA zostanie wprowadzony w to miejsce, decyduje kodon mRNA znajdujacy sig w miejscu A. Aminoacylo-tRNA, ktdry powstal w reakeji katalizowanej przez specyficang syntetaze, nie opuszeza tak po pro stu syntetazy i nie dyfunduje do miejsea A. Za umieszezenie aminoacylo- -tRNA w miejscu A odpowiedzialne jest biabko o masie czasteczkowe} 43 kDa 9p, FYE 3023 _strulcura cry elongacynego EF-Tu. Stuturakomplelas itwersonego rmigdzy EF-Tu i aminoacylo-tRNA, Domena na koncuN biaka to domena NTPazy typu? {kolor fioletowy), podobna do tych,ktore wystepuia w innych biatkach G.[Za:IB23pdb]= exynnik elongacyiny Tu (EF-Tu). Czynnik elongacyjny Tu, kolejny czlonek rodziny bialek G, wiaze aminoacylo-tRNA tylko w kompleksie z GTP (rys. 30.23). Zwigzanic sig EF-Tu do aminoacylo-tRNA ma dwie funkcje. Pierwsza to ochrona delikatnego wigzania estrowego w aminoacylo-tRNA przed hydro- liza, Druga to hydroliza GTP zwiazanego z EF-Tu do GDP w chwili utworzenia odpowiedniego kompleksu miedzy EF-Tu-aminoacylo-tRNA i rybosomem, Jesli antykodon wprowadzonego aminoacylo-tRNA nie jest komplementarny do kodonu, nie dochodzi do hydrolizy GTP, a aminoacylo-tRNA nie zostaje umieszezony na rybosomie. Kontrola wykorzystania energii pochodzqcej z hy- drolizy GTP dopomaga w zwiekszeniu wiernosei syntezy bialka. Hydroliza GTP uwalnia réwniez z rybosomu EF-Tu, W jaki sposcb EF-Tu w formie zwiqzane} z GDP zostaje przeksztaleony w forme zwigzana z GTP, ezyli zdolna do wigzania kolejnego aminoacylo- -RNA? Drugi czynnik elongacyjny Ts ~ EF-Ts taczy sig 2 czynnikiem EF-Tu, indukujge réwnoczesnie odiaczenie GDP od EF-Tu. Nastgpnie GTP wiade si¢ 2 EF-Tu wypierajac caynnik EF-Ts, Nalezy odnotowaé, ze EF-Tu nie oddzia- luje z fMeriRNA;. Oznacza to, te tRNA inicjatorowy nie bedzie dostarczony do miejsca A. Natomiast Met-tRNAw, tak jak pozostale aminoacylo-tRNA, wiaie sie z EF-Tu, Teraz rozumiemy, dlaczego wewnetrzne kodony AUG nie sq odezytywane przez inijatorowy tRNA. Czynnik inicjujacy IF2 rozpoznaje tylko fMet-tRNAy, nie wigzae sig z Zadnym innym tRNA. Opisany wyzej cykl EF-Tu z przemiang GTP-GDP przypomina sposob dzialania bialek G (zbudowanych z trzech podjednostek) w przekazywa- niu sygnatu (6, 387) oraz bialka Ras w kontroli werostu (8. 398). Podobieristwo to jest efektem dziedzictwa ewolucyjnego, poniewaz N-koricowa domena bialka EF-Tu jest homologiczna do motywu petli P NTPaz w innych bialkach G. Pozostale dwie domeny EF-Tu sa odmienne — ich rola polega na oddzialy- ‘waniu'z aminoacylo-tRNA i rybosomem, We wszystkich tych pokrewnych bial- kach zmiana konformacji wywolana zwigzaniem sig z GTP lub GDP prowadzi do wymiany partnera tych biatek. Kolejnym podobieristwem jest 10, 2e we ‘wszystkich przypadkach potrzebne jest biatko Katalizujgce wymiang GDP na GTP; aktywowany receptor pelni role czynnika EF-Ts w przypadku bialka G (2budowanego z trzech podjednostek). Po utworzeniu wiazania peptydowego nastepuie translokacja tRNA. imRNA napedzana przez GTP Po prawidlowym umieszczeniu aminoacylo-IRNA w miejscu A proces prze- niesienia reszty peptydylowej z tRNA. zajmujacego miejsce P jest procesem spontanicznym, napedzanym tworzeniem sig silniejszego wigzania peptydo- ‘wego w miejsce wiazania estrowego. Jednak synteza bialka nie moze byé kon- tynuowana bez translokacji mRNA i czasteczek RNA wzgledem rybosomu, Informacyjny RNA musi sig przesunaé o trzy nukleotydy, deacylowany tRNA musi opuscié miejsce P i zajaé miejsce E, a peptydylo-tRNA przemieszeza sie do miejsca P, opuszczajac miejsce A. W efekcie nastepny kodon znajduje sig w migjscu A, gotowy do oddziatywati z wprowadzanym aminoacylo-tRNA. ‘Trdjwymiarowa struktura rybosomu podlega znacznym zmianom w trakeie ranslokacji, Pewne dane eksperymentaine wskazuja na to, 2¢ translokacja moie byé wlasnic efektem zmian zachodzacych w samym rybosomie. Niemnie} jednak czynniki bialkowe przyspieszaja ten proces. W iranslokacji posred- niczy caynnik elongacyjny G (EF-G, zwany tez translokazq). Zaproponowany mechanizm przyspieszania translokacji jest przedstawiony na rysunku 30.24, Na poczatku, EF-G zwiqzany 2 GTP wiaze sig z rybosomem w poblizu mi ‘Ai oddzialuje z 235 rRNA z duzej podjednostki 50S. Zwiazanie EF-G do ry- bosomu stymuluje aktywnosé GTPazowa tego bialka. Z powodu hydrolizy GTP, w EF-G zachodza zmiany konformacyjne, ktdre powoduja przesunigcie peplydylo-tRNA z miejsca A do miejsca P, pociagajac za soba mRNA i de- sat 304 Czynniki bialkoweadenina adenina Rys.3024 _ Mechanizm translokacj. EG, w formie zwigzane| z GTP, wiate sie zrejonem ppodjecnostki 505 zawierajacym miejsce wiazania EF-Tu. Praylaczenie sig EF-G styruluje hhydrolize GTP. a ta z koe’ indukuje zmiany konformacyjne EF-G powodujgce praesunigcie ‘caasteczki NA i MRNA wagledem rybosomu na odleglose odpowiadsjaca jednemu kaconowi acylowany tRNA. Dysocjacja EF-G jest sygnalem, ze rybosom jest gotowy do przyjgcia nowego aminoacylo-tRNA w miejsce A. ayn Ostatnim etapem translacji jest terminacja. Jak dochodzi do zakoriczenia syn- tezy polipeptydu w chwili, gdy rybosom napotyka kodon ,stop”? Aminoacylo- -IRNA 2wykle nie wiaze sie z rybosomem w miejscu ‘A, jesli znajduje sig tam jeden z kodonéw oznaczajaeych zakoriczenie syntezy bialka, czyli UAA, UGA lub UAG. Prawidlowe komérki nie zawierajg czqsteczck tRNA z anty- kodonami komplementarnymi do kodonéw stop. W zamian za to sygnaty stop ‘8q rozpoznawane przez bialkowe caynniki uwalniajqce (RF). Jeden z ezynnikéw uwalniajaeych, RFI, rozpoznaje kodony UAA i UAG. Drugi czynnik, RF2, rozpoznaje kodony UAA i UGA. Trzeci czynnik, RF3, nalezacy podobnie jak EF-Tu do rodziny bialek G, postedniczy w oddzialywaniach czynnikéw REL lub RF2z rybosomem. RFI i RF2 maja bardzo 2warta strukturg, a ich odpowiednik u eukariot6w ksztaltem swym przypomina ezasteczke tRNA. Po przylgczeniu do rybosomu bialko ulega rozwinigciu, aby wypelnié luke (zajmowang w czasie elongacji przez aminoacylo-tRNA) migdzy kodonem stop na mRNA a centrum peptyd lotransferazowym podjednostki 50S. Chociaz dokladny mechanizm uwalniai peptydu z rybosomu nic jest znany, sugeruje sig, ze czynnik uwalniajacy moze stymulowa¢, razem z centrum peptydylotransferazowym, atak czqsteczki wody na wigzanie estrowe, uwalniajgc tym samym laricuch polipeptydowy. Odlgezony polipeptyd opuszeza rybosom. Transportujacy tRNA i mRNA sa jeszcze kr6tko zwiazane z rybosomem 70S, az do momentu gdy przylaczy sie do niego EF-G i dodatkowy czynnik, zwany rybosomowym czynnikiem uwalniajgcym (ang, ribo- some release factor, RRF, rys. 30.25). Po przykaczeniu tych czynnikow, w reakeji zaleénej od GTP, poszezegélne czesci kompleksu rozlaczaja sig. ee uwalniajace koficza synteze biatka odczytujac kodony ,stop” N (Ooh te. 882 UAR UAA Rys.30.25Terminacja syntery biatka. Czynnik uwalniajacy tozpeznaje kodon stop W miejscu A i stymuluje uwolnienie zsyntetyzowanego polipeptydu z komplesu peptydylo ERNA w miejseu P.30.5 Synteza biatka u eukariotow réani sie od syntezy biatka u prokariotéw przede wszystkim sposobem inicjacji Podstawowy schemat syntezy bialka u eukariotéw i archeondw jest podobny do dzialajgeego u bakterii. W translacji cukariotycznej Koniecany jest jednak uudzial wiekszej liczby bialek, a niektGre etapy sq bardziej skomplikowane. Ponize| wymieniono kilka istotnych réénic i podobieristw migdzy translacja u prokariot6w i eukariots 1. Rybosomy: Eukariotyczne rybosomy sa wieksze. Skladaja sig z duzej pod- jednostki 60S i mate} podjednostki 40S, kt6re razem tworza rybosom 80S omasie 4200 kDa. Dla poréwnania przypomnijmy, ze prokariotyezny rybosom 70S ma mase 2700 kDa. U eukariotsw podjednostka 40S zawiera 188 RNA, homologiczny do prokariotycznego 165 rRNA. Podjednostka 60S zawiera trzy rodzaje rRNA: 5S i 28S, bedace odpowiednikami prokariotycanych 58 i 23S, oraz 5,8 wystepujacy tylko u eukariotéw. Sekwencja nukleotydowa tego ostat- niego jest homologiczna do korica 5' 238 RNA prokariotow. 2. Inicjatorowy «RNA, U eukariot6w aminokwasem rozpoczynajacym syn- tezg biatka jest metionina, a nie N-formylometionina. Tak jak w organizmach prokariotycznych, specjalny tRNA bierze udzial w syntezy bialka, aminoacylotRNA nazywany jest Met-tRNAj lub MettRNAy (,i” oznacza inigjacje, a ,£” oznacea, Ze moze on byé formylowany in vitro). 3. Iniciacja. Kodlonem inijujacym synteze biatka u eukariot6w jest zawsze AUG. Eukarioty, w przeciwieristwie do prokariotéw, nie zawieraja sekweneji bogatej w puryny na koricu 5 mRNA, stuzacej do odrdénienia kodonu inicjato- rowego AUG od wewnetranych kodonéw metioninowych, Zwykle kodon AUG leigey najblizej korica 5' mRNA jest wybierany jako kodon rozpoczynajacy sy tezg bialka. Podjednostka rybosomowa 40S przylqcza sig do kapu na koricu 5’ cukariotycznego mRNA (6, 850) i szuka kodonu AUG systematycznie posuwajac sie w kierunku 5'— 3! mRNA (rys. 30.26). Proces poszukiwania kodonu start jest napedzany przez zalezng od ATP helikaze. Parowanie sig antykodonu Met- ARNA\z kodonem AUG na mRNA sygnalizuje, ze cel zostal osiagnigty, Niemal ‘we wszystkich przypadkach eukariotyezny mRNA ma jedno miejsce inicjacji syntezy bialka, koduje wigc tylko jedno bialko, Prokariotycny mRNA prze- civmnie, ma wiele sekweneji Shine-Dalgarno, a tym samym wiele miejsc inicjacji syntezy bialka i dlatego moze sluzyé jako matryca do syntezy kilku bialek Enkarioty maja znacznie wigcej czynnik6w inicjujacych syntezg biatka niz organizmy prokariotycane, a ich wspéidziatanie jest znacznie bardziej skompli- Kowane. Przedrostek elF oznacza eukariotyczne czynniki inicjujace. Na przy- lad, elF-4E to bialko wiazace sig bezposrednio z kapem (7-metyloguanozyna, s. 850), a elF2, zwigzane z GTP, dostarcza Met-tRNAj do rybosomu, Rédnica W mechanizmie inicjacji miedzy prokariotami a eukariotami jest czesciowo konsekwencja réénic w dojrzewaniu mRNA u tych dwéch grup organizméw, U prokariot6w koniee 5! mRNA jest dostepny dla rybosomow natychmiast po rozpoczeciu transkrypeji. U eukariotéw przeciwnie, pre-mRNA ulega najpierw procesom dojrzewania w jadrze i dopiero wtedy zostaje przeniesiony do cytoplazmy, gdzie dochodzi do inicjacji ranslagji. Struktura kapu na koricu 5'mRNA jest latwo rozpoznawalnym sygnalem inicjacji translacji, Dodatkowo, alozonosé procesu iniejacji syntezy bialka u eukariot6w pozwolila na wyksztal- cenie innych mechanizmow regulacji ekspresji gendw, 0 czym bedzie mowa w Rozdziale 31, 4. Budowa mRNA. U eukariotéw oba korice czasteczki mRNA. znajduja sig btisko siebie i dlatego jej struktura przypomina kolo. Bialko elF-4E, ktGre vwigée strukturg kapu na koricu 5’ mRNA, oddzialuje réwniez z ogonem poliA mRNA poprzez dwa bialka postedniczace, Najpierw elF-4E wigze sie z elF-4G, : 383 303 Symer Balke w elariotow ET 1x4 ep . “or posdiednoitia 40s Met = podjednestka 40s ‘re stladnikam nigger! nae ADP +P; Met podjedrostka 60s, cya iiiiace kompleks inijujacy 805, Rys.3026 _Etap inicjcj transact eukariotow. W organizmach eukariotycanych inicjacjatranslac) rozpocryna sie tworzeniem kompleksu ra koricu S' mRNA, Do kapu praylacza sie miedzy innyi podjedrostka 405 | Met tRNA, Napedzany hydkolizg ATP kompleks skanuje nastepnie mRNA do momentu napotkania pierwszego kedonu AUG. 'Nastgpnie przylacza sie podjednostka 605, Powstaje kompleksiniclujacy 805,Rys.30.27 Oddziatywania biatko~biatco zblitaja do siebie fzycanie koice ‘czgsteczki mRNA. [Wedlug: H.Lodish et al, Molecular Cell Biology Sth ed. (WH, Freeman and Company, 2004), rys. 431] Proc oe ae Rys, 30.28 Rybosomy zwiazane 2 retikulum endoplazmatycznym. Na preedstawione| mikragrafit elektronowe} rybosomy wyeladaia jak czame kulki zwigzane z cytoplazmatyczng strong retikulum endoplazmatycznego, dalac w efekcie chropowaty wyglad Natomiast retikulum endoplazmatyczne alackie jest pozbawione rybosoméw. [Z: GKVoletz MM. Rolls, TARapoport, EMBO Rep. 3 (2002}944-950] a toz kolei wiae sie z biatkiem asocjujacym z ogonem poliA, taw. biatkiem PABPI (ang. poly(A)-binding protein) (rys 30.27). Kap i ogon poliA sq zatem w bliskim sysiedztwie, Taka kolista struktura najprawdopodobnie} ulatwia ponowne wigza- nie sig rybosomu po zakoriczeniu jednej rundy syntezy biatka, Elongacju i terminacja. Bukariotyczne czynniki elonga- cyjne EFla i EFlpy sq odpowiednikami prokariotyeznych czynnik6w EF-Tu i BF-Ts. EFla zwigzany z GTP dostarcza aminoacylo-tRNA do rybosomowego miejsca A, a EF py ka- talizuje wymiane zwiazanego z EFla GDP na GTP. Czynnik eukariotycany EF2 postedniczy w translokacji odbywajace) sig na koszt GTP. Proces ten zachodzi niemalze tak samo jak u prokariotow, edzie czynnikiem odpowiedzialnym za translokacje jest EF-G. W terminacji syntezy bialka u cukariot6w posredniczy tylko jeden czynnik uwalniajacy ~ eRF, u prokariot6w uczestniczyly w tym procesie dwa czynniki uwalniajgce. Czynnik cIF3, tak jak jego odpowiednik w organizmach proka- iotycanych IF3, uniemoiliwia reasocjacje podjednostck rybosomowych, gdy sq nicobeene inne clementy kompleksu inicjujacego. 30.6 Rybosomy zwiazane z retikulum endoplazmatycznym produkuja biatka btonowe i sekrecyjne Nowo zyyntetyzowane bialko E. coli moze zostaé w cytoplazmie, moze byé skierowane do blony plazmatycznej, do blony zewnetrznej, do przestrzeni mig- dzyblonowej lub poza komérke. Komérki eukariotyezne moga kierowac bialka do swoich wewnetranych kompartment6w, takich jak lizosomy, mitochondri chloroplasty czy jadro komérkowe. Jak komérka Kieruje procesem sortowania bialek? U eukariotéw pierwsze zasadnieze decyzje zostaja podigte wkrétce po rozpoczeciu syntezy biatka. Ostateczne miejsce przeznaczenia zalezy w duzej mierze od tego, gdzie znajduje sie rybosom syntetyzujaey bialko. W komérce eukariotyeznej rybosom pozostaje w stanie wolnym w cytopla- zmie, chyba ze jest kierowany do retikulum endoplazmatyeznego (ER), bardzo rozwinigtego systemu blon, stanowigcego okolo polowe wszystkich blon ko- mérki, Rejony zawicrajace rybosomy zwane sq szorsikim retikulum endopla- zmatycznym, ze wzaledu na swoja ,chtopowata” powierzchnie, natomiast rejony pozbawione rybosoméw nazywa sig retikulum endoplazmatycznym gtadlkim (rys. 30.28). Wolne rybosomy syntetyzuja bialka, ktére pozostajg w komérce: moana je znaleéé albo w cytoplazmie, albo w organellach otoczonych podwejna blona, takich jak jadro komérkowe, mitochondria, chloroplasty. Rybosomy awigzane z ER zazwyczaj syntetyzuja bialka preeznaczone na eksport poza komorke albo bialka, kt6re pozostaja zwigzane z blona komdrkowa i kontaktuja sie ze Srodowiskiem zewnetrznym. Bialka syntetyzowane na szorstkim ER moina podzielié na tray gléwne klasy: bialka sekrecyjne (bialka wydzielane na ze wnatrz komorki), biatka lizosomalne i bialka blonowe. Zasadniczo wszystkie bialka blonowe, z wyjatkiem tych znajdujgcych sig w blonach mitochondri6w i chloroplast6w, sq syntetyzowane na rybosomach zwigzanych z ER. Komsrka wykorzystuje bardzo rézne strategic, by skierowaé biatko tetyzowane na Wolnych rybosomach do jadra komérkowego, peroksysom mitochondriéw czy chloroplastéw. W tym rozdziale zajmiemy sig. gléwnie kierowaniem bialek syntetyzowanych na rybosomach zwigzanych z retikulum endoplazmatycznym. " Obecnose sekwencji sygnatowej w biatku decyduje o jego translokacj w poprzek btony retikulum endoplazmatycznego Synteza bialka przeznaczonego do wydzielenia na zewnatrz komérki lub do zako- twiczenia w blonie plazmatycznej rozpoczyna sig na wolnych rybosomach. Jednak{kr6tko po rozpoczgciu syntezy zostaje ona zatrzymana do momentu, az rybosom nie zostanie ulokowany na cytoplazmatyczncj stronie blony ER. Kiedy rybosom zakotwiczy sig w blonie ER, synteza bialka zostaje wanawiona. Skaro tylko nowo syntetyzowany peptyd zacznie ,wystawaé” poza rybosom, zostanie on kotransla~ «yinie przeniesiony przez blone do Swiatla retikulum endoplazmatczynego. ‘Wolne rybosomy syntetyzujgce biatka pozostajace w cytoplazmie sa takie same jak rybosomy zwigzane z ER. W jaki zatem spos6b rybosomy syntetyzujace biaka przeznaczone do retikulum zostaja zwiqzane z biona ER? Caly proces skierowujacy rybosomy do retikulum wymaga obeenosci ezterech clement6w. rikisce ceca MATGSRTSUUUAFGUECUPWLOEGSA | FPT MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA | FYN MEWVTFISLULFSSAYS | Rov MEVLSLEYEL TAIPHIMS | ova ludzki harmon warostu ludtka proinsulina proalbumina wolu faficuch H mysich preeciwcial fzoaym kury MRS UUILWVLCFL PKUAALG | KVF promeltyna pszczt MKFLVNVALVFMVVYISYIYA | APE Balko glue Drosophila MK LLVVAVIACMLIGFADPASG | cKD Vial 19 kukuryay MAAKIFCLIMLLGLSASAATA | SIF inwertaza drotdty MLLOAFLFLLAGFAAKISA SMT ldo wirus gypy A MKAKULVLLYAFWAG | pQI 1. Sekwencja sygnalown, Sekwencja sygnalowa to sekwencja 9 do 12 hydrofo- bowych reszt aminokwasowych, czasami znajduja sie w niej rowniez dodatnio na- ladowane aminokwasy (rys. 30.29). Sckweneja ta znajduje sig zazwyczaj blisko korica aminowego rosnycego taricucha polipeptydowego. To wlasnie obeenosé sckweneji sygnatowe} identyfikuje rosnacy polipeptyd jako ten, ktéry musi przekroczyé blong ER. Czasem sekwencja sygnalowa pozostaje w dojrzalym biatku, ezasami zas zostaje odcigta przez peptydaze sygnatowa, znajdujaca sig po wewnetrzngj stronie blony ER (patrz rys. 30.29). 2. Cagstha rozpoznajgca sekwencig sygnatowg SRP (ang. signal recognition particle, SRP). Czastka rozpoznajgca sekwencje sygnalowg rozpoznaje se- kwencie sygnalowa i wiaze sig z nia i z rybosomem, jak tylko ta ostatnia za~ ceznie ,wystawaé” poza rybosom, Nastepnie czastka SRP skierowuje rybosom krétkim fragmentem zsyntetyzowanego polipeptydu do blony ER. SRP jest rybonukleoproteing zbudowana z.78 RNA i szesciu réinych bialek (rys. 30.30). Jedno z bialek, SRP 54, jest GTPaza waing dla aktywnosci tej ezqstki. SRP mote sig wigzaé z wszystkimi rybosomami, ale silne i specyficane wiazanie nastepuje tylko w przypadku, gdy na rybosomie bedzie syntetyzowane bialko zawierajace sekwencje sygnalowa. Mozna wigc powiedziec, 2 SRP testuje rybosomy na obecnosé peptydu sygnalowego. Zwigzanie SRP z sekwencja sygnalowa blokuje miejsce wiazania czynnika elongacyjnego, a tym samym. ‘ostaje zatraymana synteza bialka, 3, Receptor SRP (SR). Kompleks SRP-rybosom zostaje skierowany do ER, dzie SRP wiaze sig z receptorem SRP, integralnym bialkiem blonowym zbu- dowanym z dwéch podjednostek: SR i SRB. SRat, podobnie jak SRP 54, jest GTPaza, 4, Translokon, Rozpoznanie SRP-SR umoiliwia zwigzanie rybosomu z blona ER. Rybosom zakotwieza sie w obrebie maszynerii translokacyjne}, zwanej translokonem. Jest to wielopodjednostkowy kompleks bialek integralnych i peryferyeznych blony ER. Translokon jest kanafem transportujacym bialka. Kanal ten otwiera sie, gdy translokon i rybosom potacza sig. Zostaje wtedy wanowiona synteza biatka, a rosnacy laricuch polipeptydowy przesuwa sig wkanale translokonu w kierunku swiatla ER. 7 885 30.6 Rybosomy zwigzane 2 blong Rys30.29._Sekwencie sygnalowe nna konicach aminowych wybranych, euiariotycanych bialek sekeecy}nych i blonowych. Rdzen hydrofobowy (koler 26ity) jest popraedzony resztari zasadowymi (kolor niebieski). Za rdzeniem _najdue sie miejsce odcinania peptydu sygnalowege (kolor czerwony), wiate sekawencje / selon P9/pia. ys 30,30 Czastka rozpomnajaca selwencjesygnatowa. Ceastkarozpornagca sekavencie syznalowa (SRF) sada Se 2 szeici bialek (ednym 2 rich jest SRP 54) ijedne, 300-nukleotydowe| casteczk RNA, Crastecoka RNA ma zlotona strulcure 2 wieloma rejonami heikalnymi rozdztelonymi fragmenta) jedroniciowy zaznaczonym jako wybrauszera, (Wed H.Lodish etal, Molecular Cel Biology, Sth ed, [W.H. Freeman and Compary, 2004) Patz K. Stub et a. Mol. Cel. Biol 1195}3949-3959, 5. High, B, Dobbertstein 4. Cell Biol. W31991}229-233)lew i sekwenda wil sygnatowve vine ys. 30.31, CyK! kierowania biatek 7 udriatem SRP. (1) Synteza bialek rozpoczyna sig ra wolnych rybosomach, (2} Po ukazaniu sig na zewngtrz tybosomu sekwene) sygnatowe) wigte sie» nig SRP, a synteza biatka zostae zaharnowana. (3) Kompleks SRP-rybosom zakotwicze sie z udziatem receptora SRP w blonie ER, (4) SRP i receptor SRP rownoczesnie hydrolizujg zwigzane czasteczki GTP. Synteza biatka zostaje wanowiona, a uwolniona czastka SRP jest gotowa do zwiazania kolejne sekwencii sygnatowe) (5) Peptydaza sygnalowe mote Lusunaé peptyd sygnatomy, jak tylko pojaw sig on w Swietle ER, (6) Synteza biatka trwa, abialko jest wttacrane prosto do Swiatta ER, (7) Po 2akofczeniu syntezy bialka rybosom jest uwalniany, a tunel w translokonie zostaje zaminigty. [Wedtug: H. Lodish et al. Molecular al Biology, Sth ed, (WIM. Freeman and Company, 2004), ry. 166,] Oddzialywania skladnik6w maszynerii translokonu 2ostaly przedstawione na rysunku 30.31. Dwa biatka: SRP 54 i podjednostka SRa musza zwigzaé GTP, aby powstal komplcks SRP-SR. Przeniesienie rybosomu na translokon motliwe jest tylko wiedy, ady dwie czasteczki GTP — jedna zwiqzana z SRP 54, druga z SR ~ zostang odpowiednio ulozone. Nastepnic dochodzi do hydrolizy obu czasteczek GTP, SRP i SR oddysocjowuja, a uwolniona czastka SRP jest gotowa do zwiazania kolejnej sekweneji sygnatowej i rozpoceecia kolejnego cyklu, Peptydaza sygnalowa, zasocjowana w swieile ER z translokonem, usuwa peptyd syenatowy z wiekszosci bialek. Pecherzyki transportujace przenosza biatka do miejsc ich ostatecznego przeznaczenia W Swietle ER nowo powstale bialko zwija sie, aby utworzyé swojg charak- terystyczna strukture przestrzenng. NiektGre bialka zostaja poddane mody- fikacjom takim jak N-glikozylacja. Bistka zostang posortowane i przetrans- portowane do swoich miejse przeznaczenia, Zasady transportu sq takie same, bez wrgledu na to, gdzie kierowane jest bialko. W transporcie uczestnicza echerzyki transportujqce, odpaczkowujace z retikulum endoplazmatycznego (rys. 30.32). Pecherzyki te przenosza swoja zawartosé do aparatéw Golgiego (AG), gdzie pecherzyki ulegaja fuzji z blona AG i deponujg ladunek w swietle AG. Tam nastepuja dalsze modyfikacje transportowanych bialek, na przyklad zostaja przylaczane reszty cukrowe (s. 317). Z aparat6w Golgiego pecherzyki transportujace przenosza biatka do miejsc ich ostatecznego przeznaczenia, jak to pokazano na rysunku 30.32.| | | Jakim sposobem biatko dociera do swojego miejsca ostatecznego przezna- czenia? Nowo zsyntetyzowane bialko bedzie dryfowaé wewnatrz Swiatla ER az do momentu, gdy awiaze sig z integralnym bialkiem blonowym zwanym receplorem przenoszonego biatka (ang, cargo receptor). Zwiazanic przenoszonego bialka zaweéa rejon jego wystepowania, co pozwala na utworzenie odpaczkowu- Jacego pecherzyka. Pecherzyk przeniesie bialko do miejsca ostatecznego prze- ‘maczenia — blony komérkowe}, lizosomu czy na zewnatrz. komorki. Gléwnym zabezpieczeniem przed niewlasciwym miejscem dostarczenia bialka jest prawi- dlowe zwiqzanie bialka z receptorem ER okreslajacym miejsce docelowe peche- rzyka transportujgcego. Aby zapewnié wlasciwe wizanie bialka z receptorem, te ostatnie rozpoznaja bardzo réznorodne cechy transportowanych bialek, takie Jak seezegdlna sekweneja aminokwasowa lub przylaczone weglowodany. Proces paczkowania jest ulatwiony przez wiazanie bialek plaszcza (COP) po cytoplazmatycznej stronie pecherzyka. Bialka plaszeza asocjujq razem ze soba, by ulatwié odlaczenic pecherzyka. Po uformowaniu i uwolnieniu echerzyka transportujacego bialka plaszeza oddysocjowuja, a wyekspono- ‘wane zostaje bialko integralne zwane v-SNARE (,.°” od vessicle ~ pecherzyk), VSNARE wiaze sig tylko ze specyficanym SNARE (,t” od target — czas teczka docelowa), bedacym skladnikiem blony docelowe). Wiazanie to dopro- wadza do fuzji blon pecherzyka transportujacego i blony docelowej, a bialko mnajdujace sig wewnatra pecherzyka zostaje dostarczone do miejsca przezna- Srodowisko zewnetrzne kométki Ry 3032 Drogi kierowania bialek. Nowo zsyntetyzowane w éwietle ER bialka s@ zbierane \ pecherzyki odpaczkowujgce od bion. Powstala pecherzyki transportujace. Pecherzyki transportuiace kieruja tadunek do aparatow Golglego, adie docheds’ do modyfikac)i balek, Nastgpnie tadunek jest przenoszony przez pecherzyki transportujace do miejse ostatecznego prreznaczenia: w procesie tym wazng role petnia batka v-SNARE | SNARE. 387 30.6 Rybosomy zwigzane 2 blong888 ‘Taee1a 304 _Antybiotyki — inhibitory syntezy biatka ROZDZIAL30._Synteza biatka faye)? ‘antybiotyle Daalanie Strepiomyeynainne _ hamujenigacle| powoduje bledne odezytywanle mRNA (prokarioty) ‘minoglkonydy Tetvacytina ‘wate sig x podjednostig 308 1 hamuje wiazanie aminoacylo-tRNA (proka rioty CChloramfenikol hamuje aktywnose peptydylotransferaryrybosomone| podjednosth SOS (pralarioty) Gpkloheksymid hamuje transiokace(eukarioty) Exytromyeyna ‘sige gz podjechstlg 505! hamuje tenackacie(prolatioty) Puromycyna owed przeduczesna terminacje syntezy poipeptydu ditaac jako ana log aminoacylo tRNA (prokerioty i 3. Sygnalem , start” w prokariotyeznym mRNA jest kodon AUG (lub GUG) poprzedzony sekwencjg bogata w puryny, parujaca sig z 16S rRNA. U prokariotéw trans- -krypeja i translacja sa ze soba Sciste spragdone. Kilka rybosomaw moi row- noczesnie przeprowadza¢ translacje na jednym mRNA, tworzac polisom. W rybosomie znajduja sie trzy miejsea wigzania tRNA zwane miejscem A (aminoacylowym), miejscem P (peptydylowym) i miejscem E (wyjscia), Kiedy tRNA z przylaczonym rosnacym laricuchem polipeptydowym znaj- duje sig w miejscu P, do miejsea A przylacza sie nowy aminoacyl-tRNA. ‘Wigzanie peptydowe zostaje utworzone w momencie, gdy grupa aminowa aminoacylo4RNA atakuje (jest to atak nukleofilowy) wiazanie estrowe Jaezace aminokwas z tRNA w peptydylo-tRNA. Po utworzeniu wigzania peptydowego zaréwno tRNA, jak imRNA musza ulec translokacji. W tymie moe sig rozpoczaé kolejny cykl wydluzania laricucha polipepty- dowego. Deacylowany tRNA przenosi sig do miejsca E i opuszcza rybosom, peptydylo-tRNA przemieszcza sig z miejsca A do miejsca P. Kodony mRNA rozpoznaja antykodony transferowych RNA, nato- miast nie rozpoznaja aminokwas6w przylaczonych do tRNA. Kedon mRNA paruje sig z antykodonem tRNA. Nicktére tRNA sq rozpozna- ‘wane przez wigce} niz jeden kodon, poniewad parowanie trzeciej zasady kodonu jest mniej resirykeyjne niz parowanie pozostalych dwéch zasad (zasada tolerancji). 304 Czynniki biatkowe odgrywaja waina role w syntezie biatka W syntezie biatka mozna wyrdani¢ trzy etapy: inicjacje, elongacie i ter- minacje. W organizmach prokariotyeznych mRNA i formylometionylo- “RNA (specjalny, inicjatorowy tRNA rozpoznajacy kodon AUG) przytacza sig do podjednostki rybosomowej 30S iz udzialem ezynnikéw inicjujgcych tworza komplcks inicjujacy 30S. Nastepnie do tego kompleksu przylqcza sig podjednostka SOS i powstaje kompleks inicjujacy 70S, w kt6- rym to kompleksie fMet-tRNA; zajmuje na rybosomie miejsce P, Czynnik elongacyjny EF-Tu dostareza do migjsca A (miejsca ami- noacylowego) rybosomu odpowiedni aminoacylo-tRNA (odbywa sig to w drodze tworzenia kompleksu EF-Tu~aminoacylo-RNA-GTP). Czynnik EF-Tu spetnia dwie funkcje: chroni aminoacylo-tRNA pred przedwezesng hydroliza oraz zwigksza wiernosé syntezy bialka poprzez kontrole prawidlowosci parowania kodon-antykodon, zanim GTP uleg- nie hydrolizic i aminoacylo-RNA zostanie umieszczony w miejscu A. Czynnik elongacyjny G wykorzystuje energie pochodzaca z hydrolizy GTP do napedzania translokacji. Synteze bialka koricz, czynniki uwal- niajace; rozpoznaja kodony: stop UAA, UGA i UAG. Czynniki te hydro- lizuja wigzanie estrowe migdzy polipeptydem a tRNA. 305 Synteza biatka u eukariot6w rézni sie od syntezy biatka u prokariotow przede wszystkim sposobem inicjacji Zasadnicze etapy syntezy biatka uw organizméw eukariotycanych i pro- kariotycznych sa bardzo podobne, jednak istnieje kilka waénych r6énic. Rybosomy eukariotyczne (80S) sktadaja sig z matej podjednostki 40S i duzej podjednostki 60S. Aminokwasem rozpoczynajacym synteze boiatka jest takée metionina, jednak nie ulega ona formylagji Inicjacja syn= {czy bialka u eukariotsw jest znacanie bardziej zlozona niz u prokariotow, Kodon AUG znajdujacy sig najblize} kovica S' mRNA jest niemal zawsze kodonem ,start”, Kompleks inicjujgcy 408 znajduje to miejsce, taczac sie z kapem na koricu S' mRNA, a nastepnie skanujac mRNA do momentu malezienia kodonu AUG. Regulacja syntezy bialka u cukariotéw jest waznym elementem sterowania ekspresja_gendw. Wiele antybiotykow dziala poprzez blokowanie transtacji u bakterii 30.6 Rybosomy zwiazane z retikulum endoplazmatycznym produkuia biatka blonowe i sekrecyjne W biatkach zakodowane sq informacje o ich miejscu pobytu w komérce. Synteza wszystkich bialek rozpoczyna sie w cytoplazmie na wolnych ry. bosomach. U cukariotéw biosynteza bialka jest rowniez kontynuowana w cytoplazmie, chyba Ze w rosnacym laricuchu polipeptydowym znajduje ig sekwencja sygnalowa kierujaca rybosom do retikulum endoplazma- tycanego (ER). Sekwencja sygnalowa, znajdujaca sig na koficu aminowym biatka, sklada sie z hydrofobowego rdzenia 0 dlugosci 9-12 reszt ami- nokwasowych, przed ktérym wystepuje z reguly reszta aminokwasowa o fadunku dodatnim, Czastka rozpoznajaca sekwencje sygnalowa (SRP) jest rybonukleoproteing, Rozpoznaje sckwencje sygnalowa i doprowadza Tybosom syntetyzujacy takie biatko do ER. Hydroliza GTP do GDP uwalnia sekwengje sygnalowa z kompleksu z SRP. SRP nastepnie odiacza 891 Streszczenie892 sig od receptora SR, a rosnacy laricuch polipeptydowy jest przenoszony ROZDZIAL 30 Synteza bialka w poprzek blony ER. Dalej bialka sq transportowane w komérce droga, transportu pecherzykowego. 307 Synteza biatka mote byé zahamowana przez antybiotyki i toksyny Wicle antybiotykow, waznych z klinicznego punktu widzenia, hamuje synteze bialka. Kazdy z etapdw syntezy biatka moze byé zablokowany poprzez dodanie odpowiednicgo antybiotyku. Toksyna blonicy blokuje synteze bialka na etapie elongacji, modyfikujac kowalencyjnie czynnik clongacyjny. Natomiast rycyna, toksyna obecna w raczniku pospolitym, blokuje elongacjg syntezy bialka usuwajae krytyczng dla aktywnosci ry- bosomu zasady adeninowa z RNA. Pojecia kluczowe translacja (s. 861) rybosom (s. 861) transferowy RNA (tRNA) (6. 863) kodon (6. 863) antykodon (s, 863) syntetaza aminoacylo-tRNA (6. 866) podjednostka 50S (s. 870) podjednostka 308 (s. 870) polisom (s, 874) sekweneja Shine-Dalgarno (s. 874) centrum peptydylotransferazowe (6. 876) zasada tolerangji (6. 878) caynnik inicjujacy (6. 880) zynnik elongacyjny Ta (EF-Tu) (s. 880) caynnik elongacyjny Ts (EF-Ts) (s. 881) caynnik elongacyiny G (EF-G) (s. 881) czynnik uwalniajacy (6, 882) sekwengja sygnatowa (s, 884) peptydaza sygnalowa (s. 885) ezastka rozpoznajgca sekwencje sy- gnalowa (SRP) (6. 885) receptor SRP (SR) (8. 885) translokon (s. 885) pecherzyk transportujgey (s. 886) biatko plaszeza (s. 887) ¥-SNARE (6. 887) LSNARE (6. 887) Wybér pigmiennictwa Literatura wprowadzajaca Noller, HF, 2005, RIA structure: Reading the ribosome. Science 300:1508-1514 Dahlberg, A. E. 2001. Ribosome structure: The ribosome in action. Science 282868869. Ibba, M., Curnow, A. W., and Séll, D. 1997, Aminoaeyl-tRNA synthesis: Divergent routes toa common goal. Tends Biochem. Sel, 22:39-42, Davis, B,K, 1999, Evolution ofthe genetic code. Prag. Biophys. Mol Biol. Te157-26. Schimmel, P and Ribas de Pouplana, L. 2000, Footprints of an ‘noaeyliRNA synthetasesare everywhere. Trends Biochem. Sct. 25:207-208, Ksigtki Cold. Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 2001 Volume 66, The Ribosome, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gesteland, R. F., Atkins, J. F.and Cech, T: (Eds, 2005. The RNA World, 34 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Garret, R., Douthwaite, 8. R. Lilja, A, Matheson, A. T, Moore, P. B., and Noll, H. F. 000, The Ribosome: Structure, Function, Antibioties and Cellular Ineractions. The American Society for Microbiology. Syntetazy aminoacylo-tRNA Ibba, M., and Soll, D. 2000, AminoacyliRNA synthesis. Annu ex, Biochem. 68:617-650, Sankaranarayanan, R., Dock-Bregeon, A. C., Rees, B., Bovee, M. Caillet, J, Romby, P, Francklyn, C. 8, und Moras, D. 200 Zinc ion’ mediated amino acid discrimination by threonyl- {RNA synthetase. Nat. Strut. Biol. 7:461~465, Sankaranarayanan, R., Dock-Bregeon, A. C., Romby, P., Caillet, 1, Springer, M., Rees, B, Ehresmana, C, Ehresmann, B. and ‘Moras, D. 1999. The structure of threonyl-tRNA synthetase- tRNA complex enlightens its repressor activity and reveals fn essential zinc ion in the active ste, Cel 7:371-381 Dock-Bregeon, A., Sankaranarayanan, R., Romby, P, Caillet, 1, Springer, M., Rees, B., Francklyn, C. 8., Ehresmann, C;, and ‘Moras, D. 2000. Transfer RNA-mediated editing in threonyl- tRNA synthetase: The class II solution to the double diserimi- nation problem, Cell 103:877-884, Serre, L., Verdon, G., Choinowski, T., Hervouet, N., Risler, J. L., and Zelwer, C. 2001. How methionyltRNA synthetase creates its amino acid recognition pocket upon L-methionine binding. J. Mol. Biol. 306:863-876, Beuning, P.J., and Musier-Forsyth, K. 2000, Hydrolytic editing by a class IT aminoacyl-tRNA synthetase. Proc. Nail. Acad. Sci U.S.A. 97:8916-8920, Bovee, M. L., Yan, W., Sproat, B. S., and Francklyn, C. S. 1998 tRNA discrimination at the binding step by a class II amino- acyltRNA synthetase. Biachemistry 38:13725-13735. Fuki, S., Nureki, O. Sekine, Shimada, A., To, J. Vassyvev, D.G., ‘and Yokoyama,5.2000. Structural bass for dauble-sieve discrimi nation of Lovaline from L-fsoleucine and L-threonine by the com plex of tRNA and valy-tRNA synthetase. Cell 103-793-803. dde Pouplana, L.R., and Schimmel, P, 2000. A view into the ori- gin of life: Aminoacyl-tRNA synthetases, Cell. Mol. Life Sci, 57:865-870. ‘Transportujacy RNA Ibba, M., Becker, H. D., Stathopoulos, C., Tumbula, D. Land Séll, . 2000. The adaptor hypothesis revisited. Trends Biochem. Sci. 25:311-316, Weisblum, B. 1999, Back to Camelot: Defining the specie role of {RNA in protein synthesis. Trends Biochem. Sei, 24:247-250, Rybosomy i rybosomowe RNA Schuwith, B. 5. Borovinskaya, M. A., Hau, C. W., Zhang, W., Vila-Sanjurj, A. Holton, J. M., and Doudna Cate, 3008 Structures o the bacterial ribosome at 3.5.4 resolution, Science 310:827-834. Moore, P.B. 2001. The ribosome at atomic resolution. Biochemistry 40232433250.