BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Trường Đại học Đà Lạt

-----------o0o------------

ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN

CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH
HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT

ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM

MÃ SỐ: B2005-29-41-TĐ

Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết
 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Trường Đại học Đà Lạt
-----------o0o------------

ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA
CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT

ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM

MÃ SỐ: B2005-29-41-TD

Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục và Đào tạo

Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết
 NHÓM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Cán bộ tham gia thực hiện đề tài:

1. TS. Nguyễn Văn Kết
2. Th.S. Cao Thị Làn
3. Th.S. Nguyễn Thành Sum
4. NCV. Đỗ Phương Mai
5. NCV. Trương Thị Lan Anh
Các đề tài sinh viên đã báo cáo
1. Khảo sát hiệu quả ức chế virus của ribazole trên năm giống cúc nuôi cấy in vitro.
Đinh Thị Hạnh. Sinh viên Nông học khóa 27
2. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Farm traéng, Farm tím, Nöõ
hoaøng tím, Thoï ñoû, Thoï vaøng chanh) in vitro. Nguyễn Thị Thắm. Sinh viên Tại
chức Sinh học khóa 13
3. Tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro.
Phạm Thị Hằng Hương. Sinh viên Sinh học khóa 27
4. Phục tráng giống hoa cúc (Farm hồng, Pingpong vàng, Nút vàng, Nút tìm, Tia
muỗng vàng) bằng ribazole. Cao Viết Tuấn. Sinh viên Nông Học Khóa 27
5. Khảo sát ảnh hưởng của biện pháp bổ trợ ribazole trong việc làm sạch virus lên sự
sinh trưởng và phát triển của ba giống địa lan (Đỏ Bà Mai, Tím hột, Vàng Ba
Râu) tại Đà Lạt. Vũ Thị Phương Thanh. Sinh viên Nông học khóa 27
6. Khảo sát về tình hình sản xuất các giống cúc tại Đà Lạt hiện nay. Nguyễn Thị
Như Quỳnh. Sinh viên Nông học khóa 28.
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tóm tắt
Qua điều tra thực tế các loại cúc và lan cắt cành tại Thành phố Đà Lạt cho thấy
hiện nay có khoảng 38 giống lan đang trồng với mục đích cắt cành, trong đó có
khoảng 14 giống có giá trị và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng. Các giống cúc
cắt cành nhập vào Đà Lạt có trên 72 giống, tuy nhiên nhiều giống đã bị lãng quên, chỉ
còn lại khoảng 54 giống còn có thể phục hồi. Nhằm bảo tồn các giống hoa này, chúng
tôi đã tiến hành các biện pháp kiểm tra hiện trạng lây nhiễm các loại virus, và đã phục
tráng thành công 14 giống địa lan, 54 giống cúc in vitro.

Abstrast
Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of
Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively.
Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in
conservation programme and management of botanical collection.
Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the
highest virus infection rate among of these species. The results obtained by
observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium.
Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility
could be obtained virus free plants through cultures.

1
 Mở đầu
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việc du nhập ngày càng nhiều các giống hoa cắt cành là một xu hương cần thiết
đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa của người dân cũng như để xuất khNu. Tuy nhiên
song song với việc chạy đua thay đổi về giống trên thị trường sản xuất hiện nay thì
đồng thời cũng có rất nhiều giống dần dần bị lãng quên, không phải vì các giống hoa
này không đảm bảo chất lượng mà là do thị hiếu của người tiêu dùng. Việc nghiên
cứu các biện pháp công nghệ trong lĩnh vực nhân giống các loài hoa cắt cành có giá
trị kinh tế của địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen trong tập đoàn hoa cắt
cành là một biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng về hoa cắt cành trong
tương lai và tránh lãng phí một số lớn các giống hoa mà bản thân đất nước chúng ta
hiện nay chưa thể lai tạo được.
2. Mục tiêu đề tài
Đề tài thực hiện nhằm những mục đích sau:
- Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành hiện có tại Đà lạt.
- Sưu tập và bảo tồn các nguồn gen quí về hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v...có giá
trị tại tình Lâm Đồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
- Nghiên cứu các điều kiện môi trường sinh trưởng thích hợp của các giống cây
con bảo tồn trong điều kiện in vitro.
- Nghiên cứu các điều kiện môi trường giá thể sinh trưởng thích hợp của các
giống cây con vườn ươm.
- Tạo môi trường thực tập và nghiên cứu cho giáo viên và sinh viên.
3. Phạm vi và giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ thực hiện nghiên cứu bảo tồn các giống cúc và các giống hoa lan cắt cành
hiện còn tồn tại và đang sản xuất tại Thành phố Đà Lạt.

2
CÁC TỪ VIẾT TẮT
BAP 6-benzyl-aminopurine
dSm-1 deciSiemen per meter – Đơn vị biểu thị độ dẫn điện của dung dịch
EC Độ dẫn điện (Electrical conductivity)
IAA Indol-3-acetic acid
IBA Indolbutyride acid
KC Knudson (1946)
Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)
LM Lindemann(1970)
MS Murashige and Skoog (1962)
NAA
-naphthalene acetic acid
NCV Nghiên cứu viên
PLB Protocorm like body
TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
VW Vacin and Went (1949)
2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid.
LSD 0.5: Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5
CV% Hệ số sai dị
FrW: Trọng lượng tươi
NTL: Đường Nguyên Tử Lực – Đà Lạt

3
 Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng
1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình
nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái
niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ
quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29)..
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính
toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Cuối thế kỷ 19,
nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp
nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi
tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của
cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển
thành cơ thể hoàn chỉnh (15, 22).
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi
White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với
một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó
White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại
vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic axit. Từ đó việc nuôi cấy
đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau.
Năm 1958, tính toàn năng của tế bào đã được khẳng định bằng công trình
nghiên cứu của Stewart và cs. (1958) trên mô rễ cây cà rốt. Các tác giả này đã nuôi
cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo
gồm các tế bào nhu mô. Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành
phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào.
Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ.
Đến những năm 60, khi đồng thời Stewart (1963), Wetherell và Halperin
(1963) cùng thông báo rằng tế bào cà rốt tự do khi nuôi cấy trên môi trường thạch đã
tạo thành hàng ngàn phôi, các phôi này phát triển qua các giai đoạn giống như quá
trình tạo phôi bình thường ở cà rốt, lúc này tính toàn năng của tế bào càng được
khẳng định.
Từ những khám phá trên, hàng loạt các báo cáo về tính toàn năng của tế bào đã
được thông báo, hầu như tất cả các cơ quan đều có thể phát triển phôi. Phôi soma đã
được ghi nhận ở nhiều giống như Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium,
Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza...
Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và
phục tráng hàng loạt các cây trồng có giá trị như khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, các cây
lương thực, cây ăn quả.... Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp
dụng ở nhiều nước trên thế giới (10, 11, 15. 22, 30).

4
1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng
Công nghệ sinh học thực vật hình thành do áp lực tự nhiên của xã hội theo hai
khuynh hướng: áp lực gia tăng năng suất và áp lực giảm năng suất mùa màng. Trước
những xu hướng đó, đòi hỏi ngày càng phải đưa nhanh kỹ thuật mới vào công tác lựa
chọn, nhân giống cây trồng.
Sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật theo thời gian có thể được tóm
tắt như sau: từ những năm 1920 bắt đầu là lai chéo, năm 1960 là kỹ thuật gây đột biến,
năm 1970 là sự phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 là kỹ thuật dung hợp tế bào
trần và từ những năm 1990 đến nay là sự phát triển của kỹ thuật gen (10, 12, 15. 22,
30).
Nhờ sự kết hợp giữa nuôi cấy mô thực vật và công nghệ gen, người ta đã tạo ra
được những thuộc tính mới cho cây trồng một cách có định hướng và hiệu quả. Nhờ
thuộc tính totipotent của thực vật, người ta có thể hoàn toàn tái tạo nên một loạt các
cây mới hoàn chỉnh từ một tế bào mang đặc tính mới chỉ trong một thời gian ngắn.
Nhờ sự kết hợp này đã giúp cho công nghệ sinh học thực vật nói chung và nuôi
cấy mô nói riêng có những bước tiến mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn. Có thể nói một
cách khái quát những ưu điểm của công nghệ này là:
- Chọn lọc nhanh những tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô là con đường
nhanh nhất giúp chọn lọc và biểu hiện tính trạng.
- Nuôi cấy mô tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho quá trình chuyển
gen ở thực vật.
- Nuôi cấy mô kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần và đột biến có thể tạo
ra các dòng lai khác loài.
- Giúp nhân giống vô tính với tốc độ và số lượng lớn.
- Giúp tạo được cây sạch bệnh.
- Thực vật nuôi cấy mô là nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất các chất quý hiếm,
đặc biệt là các dược chất.
- Các cây mô là đối tượng tốt và hiệu quả của những nghiên cứu về sinh lý,
sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử.
- Các cây mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật rất dễ dàng.
- Các cây mô có thể cung cấp quanh năm.
1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô
Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là
các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều
tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một hàm
lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được
tổng hợp nhân tạo. Những chất điều tiết sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ
phận khác của cơ thể gây nên những tác động điều tiết của cây.

5
 Vai trò điều hòa của chất điều tiết sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự
hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá
trình đó.
Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và
cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng đối với sinh
trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật.
1.3.1 Các auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA).
IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ.
Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 –
diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự
phân chia mô và trong quá trình tạo rễ (10, 12, 40, 41).
NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ.
Đối với rễ, về cơ bản auxin ức chế sự phát triển của rễ, chỉ ở nồng độ cực thấp
(10 -10-12g/ml) thì mới có tác dụng kích thích sinh trưởng của rễ, vượt qua ngưỡng
-9

này (10-8mg/l) thì lại thể hiện tác dụng ức chế.

IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích
thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy.
Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng..
NAA được Went và Thimann (1937) tìm ra. Chất này có tác dụng làm tăng hô
hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi
chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy
(10, 12, 40, 41).
1.3.2 Cytokinin
Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào.
Các cytokinin thường gặp là 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin.
Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic.
Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng
có hoạt tính mạnh hơn kinetin.
Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian
hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các
chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp
protein và tăng cường hoạt động của một số enzim (10, 40, 41).
Benjamin và cs. (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự
phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs. (1988) cho
rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1-
5mg/l.
Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các
chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh

6
trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định
đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ này thấp sẽ kích
thích quá trình phát sinh chồi, nếu tỷ lệ này cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển
mô sẹo. Barna và Wakhlu (1998) chỉ ra rằng tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago
ovata tăng cao khi trên môi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM.
Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng định rằng chỉ khi tác động đồng thời của
auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, dẫn đến quá trình
mitos và cảm ứng cho sự phân chia tế bào.
Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình
phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho
quá trình này diễn ra một cách bình thường (10, 12, 40, 41).
1.3.3 Các nhóm chất khác
Ngoài những nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro
còn sử dụng một số nhóm chất khác như Abscicis acid, ethylen, các amino acid...
Abscisis acid sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái
nghỉ bắt buộc. Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật. Ethylen có thể
kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đNy nhanh sự lão hóa trong quá trình nuôi cấy mô.
Silver nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành trong quá trình
nuôi cấy mô (40, 41).
Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây. L.
Glutamine có thể được xem như là nguồn nitơ. Enzim hydrolyzed protein N-Z amin
Type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2g/l. Thêm vào đó
malate, citrate, pyruvate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường
nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium (Gamborg &
Shyluk, 1970; Gamborg, 1986).
Ngoài ra, các chất chiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có
thể rất hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định
và các nhân tố sinh trưởng.
1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)
Trong 5 thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về kỹ thuật vi nhân giống (Arditi và
Krikorian, 1996; Chakrabarty và cs., 2001; Rasai và cs., 1995; Rout và cs., 2000). Vi
nhân giống là sự nhân giống vô tính với số lượng của cây trồng thông qua nuôi cấy
mô in vitro. Kỹ thuật nuôi cấy này đã được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân giống
các loài cây cảnh và những loài khác trên toàn thế giới (Chu 1992; Huetteman và
Preece 1993; Mantell và cs., 1985; Prerik, 1987).
Một trong những dạng thú vị và quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro là
khả năng tái sinh và sinh sản của cây từ nuôi cấy tế bào và mô. Dạng đơn giản nhất
của tái sinh cây in vitro là kích thích sự phát triển của chồi. Kỹ thuật này tận dụng sự
phát triển cá thể cho sự phát triển chồi bằng đỉnh sinh trưởng hoặc chồi bên. Trạng
thái ngủ của những chồi này bị phá hũy và sự phát triển của các chồi non được kích

7
thích bằng tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng (thường sử dụng cytokinin) để tái sinh
ra chồi con. Các chồi con này sau đó được tách ra cho phát triển rễ để tái sinh cây con.
Sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô có thể được thực hiện bằng cách nuôi cấy từ
đỉnh sinh trưởng, từ callus và từ tế bào, hoặc chồi nách vì chồi nách là tiền thân của
đỉnh sinh trưởng. Ngược lại, sự tái sinh bất định diễn ra tại những vị trí khác như là
các đốt thân, từ lá mầm, vùng kéo dài ra của rễ. Sự tái sinh chồi bất định thường phụ
thuộc vào sự có mặt của gen cấu trúc. Nhưng sự tái sinh cây từ callus và từ tế bào
thường không có mặt của gen cấu trúc.
Sự phát sinh cơ quan là sự hình thành các cơ quan riêng biệt như chồi hoặc rễ.
Sự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ. Hầu hết
các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng
rất ít loài có thể được cả hai cách. Một số loài có thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuôi
cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định.
Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi
nhân giống do có sự biến dị ít nhất. Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh
cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ
tái sinh của nó.
1.4.1 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống
Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974,
George và cs. 1984).
Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu.
Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu.
Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên
nhất trong vi nhân giống (Chu 1992). Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng
trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa.
Giai đoạn 3 : là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con. Giai đoạn
này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài.
Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn
hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng.
1.4.2 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro
Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi cấy
cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố. Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần
dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng. Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều
báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik
1987; Torres, 1989).
Môi trường nuôi cấy
Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in vitro
nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977).
Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi
thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999;
Saxena và cs., 1988).

8
 Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin
và chất điều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như
nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986).
Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô
tế bào. Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ. Muối
amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM. Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay
đổi từ ức chế đến hiệu quả. Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là
thích hợp. Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng vi lượng.
Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng
rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây. Môi trường B5 (Gamborg và cs.,
1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi
trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây. Theo Huang và cs.,
Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi
trường MS.
1.4.2.2 Các chất điều tiết sinh trưởng.
Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất
lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật. Mor và Zieslin (1987), Rout và cs.
(2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác
giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất
rõõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây
khác nhau. Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi.
Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin, 2-ip trên
môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu
của Kang và cs. (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân
nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa. Loại dâu này sẽ cho số lượng
chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0 µM BA kết hợp với 0,1
µM NAA. Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya
và Chandra, 1983). Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm
số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi
không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc.
Trong nuôi cấy rễ in vitro, sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn
chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc
không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs.,
2000).
1.4.2.3 Nguồn cacbon và những cơ chất khác
Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro
hoặc glucose (nhưng rất ít). Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose,
galactose nhưng rất ít sử dụng. Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế
bào. Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng
và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3,
vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong nuôi cấy in vitro
để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968).

9
 Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài
egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite.
Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của
quá trình nuôi cấy in vitro. Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó
đóng vai trò như là chất hút Nm của môi trường. Than hoạt tính có khả năng hấp thụ
một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra
trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra.
Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs.,
1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984). Bổ sung thêm than hoạt tính
vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác
dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức
chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy. (Dumas và cs.,1995; George và
Sherrington, 1984).
1.4.2.4 Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro.
Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành
chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996). Trong trường thông qua nuôi cấy
chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi
trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây. Trên cây dâu tây Fragaria x
ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS
các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM) và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuôi cấy.
Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM
NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ
nhân nhanh cũng giảm.
1.4.2.5 Sự hình thành rễ
Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều
tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998). Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành
dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ
đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5%. (Webb và Street, 1977). Theo Indra D. Bhatt và
Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành
rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng
thấp (0.1mg/l).
Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm
than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin. Than hoạt tính làm
nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs.,
1999). Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra
rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs.,
1993; George và Sherrington, 1984).
Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều
kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng
ruộng.

10
2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium
sw.)
2.1 Khái quát chung
Lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông vào 551-479 trước công nguyên
bởi Khổng Tử.
Cây lan được biết đến đầu tiên ở Trung Quốc là Kiến Lan (tìm ra ở Phúc kiến)
là Cymbidium enrifolium.
Theo Phrastus được xem là ông tổ của thực vật học và cũng có thể nói là cha
đẻ của ngành học về lan. Orchis được ông dùng để chỉ những cây lan tìm thấy ở vùng
Địa Trung Hải.
Thế kỷ thứ nhất sau công nguyên, Dioscorides dùng Orchis để mô tả 2 loài địa
lan trong quyển sách về dược liệu của ông và được Linnaeus ghi lại trong sách “Các
Loài Cây Cỏ” (Species Plantarum) vào 1753, rồi John Lindley sử dụng đầu tiên để đặt
tên cho họ lan là Orchidaceae từ năm 1836 và tồn tại cho đến nay.
Ở Việt Nam sự nghiên cứu về lan chưa rõ rệt lắm nhưng có lẽ người đầu tiên
tìm hiểu và nuôi trồng lan là vua Trần Anh Tông, kế đến là Joanis Loureiro, là nhà
truyền giáo người Bồ Đào Nha (1789) trong cuốn “ Thực Vật Chứng Nam Bộ ”
(Flora Cochinchinesis) các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam và
đã được Bentham và Hoocker ghi lại trong “ Các Giống Cây Cỏ” (Genera
Plantarum)(1862 – 1883). F. Gagnepain và A. Guillaumin mô tả 101 giống gồm 636
loài lan cho cả 3 nước Đông Dương trong bộ “ Thực Vật Chí Đông Dương ” do
Hlecomte chủ biên.
Đáng kể nhất là quyển II bộ sách “ Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam” của giáo sư
Phạm Hoàng Hộ với 289 loài lan được mô tả và vẻ hình. Mới dây giáo sư đã bổ sung
thêm 364 loài lan trong quyển III tập 2 của bộ sách “Cây Cỏ Miền Nam Việt Nam”
xuất bản 1993. Trong đó chi Cymbidium.sw có 15 loài:
C.aloifolium (Lindl.).sw, C.atropurpureum (Lindl.) Rolfe., C.banaense Gagn,
C. bicolor lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.devonianum Paxt., C.enrifolium (Lindl.).sw,
C.erythrostylum Rolfe, C.filay sonianum Lindl., C.inrigne Rolfe, C.lancifolinum
Hookf, C.lowianum Reich.b.f, C.schroederi Rolfe., C.sinense (Jacks)Willd.,
C.macroshizon Lindl..
Theo Trần Hợp trong cuốn “Phong Lan Việt Nam” tập 1 và 2 xuất bản 1988-
1990 thì họ lan Việt Nam có khoảng 368 loài, trong đó chi Cymbidium có khoảng 10
loài sau:
C.aloifolium (Lindl.).sw, C.dayanum Hookf, C. devonianum Paxt.,
C.enrifolium (Lindl.).sw, C.evrardii Guillaum, C.grandiflorum Griff, C.inrigne Rolfe,
C.lancifolinum Hookf, C.parishii Reich.b., C.poilanei Gagnep.
Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến trong cuốn “Phân Loại Học Thực Vật –
Thực Vật Bậc Cao” xuất bản 1978 thì họ lan ở Việt Nam có 91 chi 463 loài, trong đó
chi Cymbidium có khoảng 12 loài sau:

11
 C.aloifolium Swartz., C.cyperifolium Wallex Lindl, C.dayanum Reich.b.f, C.
devonianum Paxt., C.ebarneum Reich.b.f, C.enrifolium Swartz., C.erythrostylum
Lindl., C.giganteum Wall., C.inringne Reich.b.f., C.lancifolinum Hookf, C.polanei
Gagn., C.munronianum kinget plant.
2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt.
Hiện nay, nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới và
trong nước đang ngày càng tăng. Trong năm 2000 kim ngạch xuất khNu hoa lan cắt
cành và giống cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó chỉ riêng hoa lan cắt
cành đã chiếm 128 triệu USD. Do đó việc trồng lan đã trở thành một hướng phát triển
kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông
Nam Á.
Thái Lan trở thành một nước xuất khNu hoa cắt cành và cây giống lan nhiều
nhất trên thế giới. từ 1990 đến 1995 số lượng lan cắt cành xuất khNu ở Thái Lan tăng
1.7 lần, từ 15.6 triệu cành lên 26.5 triệu cành.
Chính phủ Malaysia đã thấy hiệu quả kinh tế lớn của việc trồng lan nên đã giao
300 ha đất cho hiệp hội hoa lan Malaysia, với mục đích quy hoạch vùng này thành
trung tâm sản xuất hoa xuất khNu.
Trong những năm gần đây Nhà nước ta cũng định hướng phát triển việc trồng
lan không chỉ phụ vụ cho xuất khNu mà còn phục vụ cho ngành du lịch. Các cấp lãnh
đạo nhà nước từ Trung ương đến địa phương đã bắt đầu thấy được tầm quan trọng của
ngành xuất khNu hoa lan nên đã có những chủ trương khuyến khích phát triển. Năm
1978, ngành xuất khNu thành phố Đà Lạt đã xuất khNu lô đầu tiên sang các nước Châu
âu với 3000 cành lan., cho đến nay thì số lượng này đã tăng lên đáng kể.
Hiện nay việc trồng lan đem lại hiệu quả kinh tế cao, đây là một mặt hàng thu
nhiều ngoại tệ, nhưng bản thân nó lại chẳng yêu cầu phải có vốn đầu tư quá cao.
Điều kiện tự nhiên của Đà Lạt phù hợp với việc trồng nhiều loài hoa, đặc bệt là
hoa lan. Trong đó địa lan Đà lạt vốn nổi tiếng từ lâu về sự phong phú và vẻ đẹp độc
đáo mà chỉ có địa lan ở Đà Lạt mới có được. Những năm gần đây, ngành trồng lan Đà
Lạt đã có những biến chuyển đáng kể. Diện tích trồng hoa thay thế cho trồng rau ngày
càng tăng. Hiện nay Đà Lạt có 400 ha trồng hoa với 300 triệu cành hoa xuất khNu
hàng năm. Hướng phát triển đến năm 2010 tăng diện tích trồng lên 450 – 500 ha trong
đó ưu tiên phát triển trồng lan. Thêm vào đó, với sự trợ giúp của công nghệ nuôi cấy
mô, việc nhân giống và tạo ra những giống mới do lai tạo cũng dễ dàng hơn, từ đó mà
thời gian trồng lan được rút ngắn lại.
Hiện nay sản lượng hoa lan cắt cành đặc biệt là địa lan vẫn chưa đủ cung cấp
cho nhu cầu rộng lớn của thị trường. Trong khi đó dịch bệnh thối giả hành, và một số
bệnh do virus hoành hành đã làm giảm một lượng lớn số chậu địa lan có ở Đà Lạt. Do
vậy ngành trồng lan trong đó Cymbidium là chủ đạo sẽ còn tiếp tục phát triển. Từ một
vài dẫn liệu nêu trên, ta có thể mạnh dạn kết luận việc nuôi trồng Cymbidium ở Đà
Lạt có một ưu thế tuyệt vời. Và đây là một tiềm năng to lớn mà nếu chúng ra biết
cách tác động sẽ đem lại lợi nhuận cao.
Họ lan là họ có số lượng loài lớn thứ 2 với khoảng 20000 - 25000 loài. Trong
đó Cymbidium được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, Cymbidium có những

12
đặc điểm nổi bật cả về giá trị thNm mĩ lẫn giá trị khoa học. Vẻ tao nhã, hài hòa của
chúng từ lâu đã hiện diện trong văn học nghệ thuật và gắn liền với đời sống văn hóa
của con người Phương Đông.
2.3 Hình thái bên ngoài của địa lan.
Về hình thái bên ngoài địa lan là những cây thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng
năm tạo thành những bụi nhỏ. Thân ngầm của địa lan (căn hành) thường ngắn nối
những củ với nhau, … các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già,
khi bị tách khỏi căn hành cũ có thể phát sinh đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những
cây con, do đó người ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân.
Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài. Đường kính của
giả hành từ 1cm đến 15cm. Giả hành được bao bọc bởi các bẹ lá xếp xít nhau, do đó
giả hành của địa lan không rõ ràng như một số loài lan khác như denrobium, catleya.
Rễ của một số loài địa lan bì sinh hay phụ sinh thường mọc bám trên vỏ cây,
mặt đất. Một số loài khác có rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay
thực sinh). Những rễ mới thường chỉ mọc ở cây con, còn cây mẹ ít khi hình thành rễ
mới mà chỉ thấy những rễ phụ phân nhánh từ rễ củ.
Lá địa lan thường có hai dạng, dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng
thực đính trên giả hành. Lá ở dạng thực đính trên giả hành thường có cuống lá, giữa
bẹ lá và cuống lá có một phần phân cách, khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy
giả hành, một số loài không có cuống lá. Tùy theo từng loài mà hình dáng của phiến
lá, gân lá rất khác nhau, gân dọc nổi rõ hay gân chìm trong thịt lá. Một số loài ít chịu
rợp có phiến lá màu vàng xanh, còn lại thường là màu xanh đậm. Bản lá và độ dày
của lá thay đổi tùy theo từng loài, các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các
loài ưa bóng rợp. Lá có dạng dải, dạng mũi mác hay dạng phiến. Đầu lá thường là
nhọn, hay chia thành hai thùy. Kích thước của lá biến động từ 0.5 cm – 6cm, chiều
dài thay đổi từ 10 cm – 150 cm.
Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới của giả hành từ các nách lá, tách các bẹ
già đâm ra ngoài. Chồi hoa thường xuất hiện cùng với chồi thân mọc đâm ra hai phía
hình đuôi cá, nhưng chồi hoa căng tròn hơn, trong khi đó chồi thân thì hơi dẹt. Các lá
đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra hai phía hình đuôi cá, còn các lá bao ở chồi hoa thì
luôn ôm chặt quanh phát hoa.
Cành hoa không phân nhánh, có thể dựng đứng hay buông thõng. Cành hoa có
thể mang từ vài hoa đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo hình xoắn ốc. Búp hoa
khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cành hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi
xuống dưới, sau đó búp hoa bắt đầu bung cánh.
Hoa Cymbidium thoạt nhìn có 6 cánh với 5 cánh gần giống nhau và 1 cánh
môi. Thực ra 3 cánh bên ngoài chính là 3 lá đài, có màu sắc giống 2 cánh hoa ở trong.
Cánh hoa cuối cùng biến đổi thành cánh môi có màu sắc sặc sỡ hơn.
Hoa Cymbidium là hoa lưỡng tính, đặc biệt nhị đực và nhụy cái cùng gắn
chung trên một trục hợp nhụy (trụ nhị - nhụy). Trên trục hợp nhụy, thì nhị nằm ở trên
cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi
một nắp màu trắng ngà, nắp này dễ mở rời và cách biệt với nuốm nhụy bởi một các
mỏ nổi lên. Do hoa có cấu trúc đặc biệt như vậy nên Cymbidium trong tự nhiên quá

13
trình thụ phấn chỉ xảy ra được nhờ côn trùng. Tận cùng phía bên trong hoa có dĩa mật
và đôi khi còn có tuyến tiết mùi thơm.
Sau khi thụ phấn xong, bầu hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu phình lên và tạo
thành quả. Quả của lan thuộc dạng quả nang có ba góc, bên trong quả chứa hàng trăm
ngàn hạt. Hạt lan có kích thước rất nhỏ trông như bụi phấn, màu vàng lụa. Khi chín,
quả mở theo 3 đường góc và phát tán hạt theo gió, hạt rơi vào nơi có điều kiện thích
hợp như Nm độ, ánh sáng,… thì hạt sẽ nảy mầm thành cây con. Trong tự nhiên tỷ lệ
hạt lan nảy mầm là rất thấp, do đó khi chưa có công nghệ nuôi cấy mô thì việc trồng
và nhân giống lan cần thời gian lâu và gặp nhiều khó khăn.
2.4 Phân loại địa lan.
Trong hệ thống phân loại họ lan là một họ lớn thứ hai với 20.000- 25.000 loài
chỉ sau họ cúc (A.L. Takhtajan). Loài địa lan thuộc
Ngành: Magnoliophyta- Angiospermae
Lớp: Liliopsida- monocotyledemes
Bộ: Orchidales
Họ: Orchidaceae
Chi: Cymbidium.
Theo các tác giả Võ Văn Chi và một số tác giả khác thì trong tự nhiên có chi
Cymbidium có khoảng hơn 50 loài, và ở Việt Nam có 15 loài trong đó chỉ riêng Đà
Lạt có tới 12 loài.
- Cymbidium aloifolium Swartz (Hay Cymbidium aimulans Rolfe; Cymbidum
Pubesecens Lindl).
- Cymbidium cyperifolium.
- Cymbidium dayanum Reichb.F
- Cymbidium devoniaum Paxt
- Cymbidium eburneum Reichb
- Cymbidium ensifolium Swartz (hay Cymbidium sudaicum Schltr)
- Cymbidium erythrostylum Lindl (hay Cymbidium longifolium Don;
Cymbidium Limodorum Angustiflorum Ham)
- Cymbidium gagiteum Wall (hay Cymbidium gradnifolium Griff; Cymbidium
hookerianum. R)
- Cymbidum insigne Rolfe
- Cymbidium Lancifolium Hook. F (hay Cymbidium gibsonii Paxt; Cymbidium
javancum Hook. F.)
- Cymbidium polanei Gagn.
- Cymbidium munronianum King et Plan.

14
 Ở Đà Lạt ngoài 12 loài trên còn có nhiều biến chủng khác, nhưng hiện nay vẫn
chưa xác định rõ loài, thứ. Từ lâu đồng bào dân tộc ở Đà Lạt đã dùng từ Tòong Plăng
có nghĩa là “lan sả” để gọi những loài lan này. Nhưng cho tới khi người Pháp và
người Kinh đến Đà Lạt thì phong trào trồng lan và phát triển lan ở Đà Lạt mới bắt đầu
phổ biến và ngày càng phát triển.
Cuối những năm 50 của thế kỷ này, một số giống lan lai đã di nhập vào Đà Lạt
để thoả mãn về nhu cầu giống mới và thị hiếu của một số người chơi lan giàu có.
Trong quá trình nuôi trồng lan lai, giới chơi lan đã tích luỹ dần những kinh nghiệm
trong việc xác định các yếu tố giá thể, giàn che, cách tưới nước bón phân,… phù hợp
với điều kiện khí hậu ở Đà Lạt. Những cây lai đó đã phát triển tốt và cho ra hoa đều
đặn hàng năm. Từ đó phương pháp trồng “lan ngoại” đã được hình thành và được phổ
biến nhưng cũng chỉ dừng lại trong phạm vi hẹp của những người trồng lan tiêu khiển.
Trong mấy năm gần nay, phong trào trồng lan của người dân Đà Lạt đang có
chiều hướng phát triển mạnh các loài địa lan, đặc biệt là các loài lan nhập nội như:
Tím Hột, Miretta xanh, Xanh Chiểu, Trắng bệt, Trắng Bệt, Hồng Bệt, Miss Kim, Đỏ
Bà Mai, Vàng Ba Râu, Miretta xanh,… … Vì các giống lan này cho hoa rất đẹp, màu
sắc sặc sỡ, hương thơm và đặc biệt là lâu tàn nên đã làm thu hút các nhà vườn, các
nghệ nhân chơi hoa, họ đã chú ý nuôi trồng và nhân giống ngày càng nhiều.
2.5 Virus hại thực vật
Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất
nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá
dưa chuột, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,…Virus thực vật gây nhiều
thiệt hại như làm giảm chất lượng nông sản, giảm năng suất và có khi là mất 100%
năng suất. Trên thế giới hàng năm bệnh virus gây thiệt hại khoảng 70 tỉ USD
(Nguyễn Văn Tỵ, 2002).
Tại nước ta, nhiều bệnh virus được truyền từ năm này qua năm khác gây thiệt
hại một vài phần trăm cho đến 80- 90% năng suất cây trồng, đặc biệt virus gây thoái
hóa nghiêm trọng các cây trồng nhân giống vô tính. Hiện nay, các cây đang trồng
cũng như cây mô ở Đà Lạt đều không hoàn toàn sạch bệnh, và virus là nguyên nhân
gây bệnh nghiêm trọng nhất cản trở sự phát triển của sản xuất trồng trọt hiện đại. Việc
nghiên cứu và phòng bệnh virus giúp giảm thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất cần
thiết, đặc biệt là những nước có nền kinh tế dựa vào nông nghiệp là chính như nước ta.
Ivanopski là người đầu tiên khám phá ra thế giới virus khi nghiên cứu bệnh
trên cây thuốc lá vào năm 1892. Virus được phát hiện đầu tiên đó gây những vết
khảm trên lá cây thuốc lá là Tobaco Mosaic Virus và đây cũng chính là loài virus có
phổ cây chủ lớn nhất hiện nay. Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ
giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, con người đã phát hiện được trên 4 ngàn
loại virus, trong đó có hơn 100 loại là virus hại thực vật và có tới hơn 25 loài virus
gây hại trên cây lan.
Như vậy, virus thực vật là những vi sinh vật có kích thước vô cùng nhỏ bé và
có những đặc điểm sau đây (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002).

15
 Virus là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát chúng trên kính
hiển vi điện tử. Virus có cấu tạo rất đơn giản: có hai phần chính là lõi axit nucleic và
vỏ protein.
Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là ARN, một số ít còn lại có
vật chất di truyền là ADN.
Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào. Virus thực vật có thể nhiễm bệnh
cho một hay nhiều loài cây, và mỗi loại cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus.
Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ
chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế
bào để tạo thành vô số virus con mới. Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần,
thoái hóa và suy tàn có khi bị chết. Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm
đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác
nhau và phụ thuộc vào từng loài cây cũng như sức chống chịu của từng cây.
2.5.1 Thành phần cấu tạo
Thông thường mỗi virus được tạo từ hai thành phần chính là protein và axit
nucleic, một số virus đặc biệt còn có cả polyanin, lipit, hoặc một số men đặc hiệu.
Dựa vào những hiểu biết về đặc điểm cấu tọa của virus mà các nhà khoa học đã tìm ra
những chất hóa học có tác dụng làm giảm sự nhân lên của virus trong tế bào cây chủ.
Protein của virus thực vật có tác dụng bảo vệ, bám giữ và có vai trò quan trọng
trong việc virus truyền bệnh qua môi giới. Protein của virus thực vật cũng được tạo
thành từ nhiều axit như alanin, acginin, glixin, triptophan, valin,…Các virus (ARN
hay ADN) sẽ quyết định bản chất protein của chúng.
Ở bên ngoài tế bào cây chủ có những điểm đặc biệt hay những thụ thể để virus
nhận biết mà bám vào, từ đó mới bơm nucleic vào tế bào. Do đó từ kết quả phân tích
vỏ protein của virus và biết được trình tự nhận biết đó thì sẽ tổng hợp được những
chất hóa học có cấu tạo giống các thụ thể để giảm tốc độ lan truyền virus trong cây
chủ.
Axit nucleic của virus giữ vai trò chủ yếu quyết định tính di truyền, khả năng
truyền nhiễm và gây bệnh. Phần lớn các virus thực vật có vật chất di truyền là ARN,
một số ít là ADN. Cả ARN và ADN đều là những đại phân tử chứa hàng trăm ngàn
các đơn vị nhỏ được gọi là các nucleotit. Mỗi nucleotit được cấu tạo từ một gốc
photphat, bazơ nitơ và đường 5 carbon. Có 2 nhóm bazơ nitơ là purin và pirimidin với
5 loại là uracil, adenin, guanin, xitozin và timin.
Dựa trên cấu tạo của các nucleotit mà con người đã tổng hợp nên những dẫn
xuất của chúng hoặc những hóa chất mà về mặt hóa học tương tự các nucleotit này.
Các hóa chất này sẽ cạnh tranh với các nucleotit để tham gia tạo thành các axit
nucleic, và do đó làm sai khác trật tự nucleotit và làm giảm tốc độ tái sản xuất của
virus.
2.5.2 Về cách gọi tên: tên virus thường được đặt theo qui tắc sau
Tên virus = Tên cây chủ + Đặc điểm bệnh + Virus

16
 Ví dụ : Tobaco Mosaic Virus: đây là virus gây hại trên cây thuốc lá, đặc điểm
bệnh là gây khảm lá.
Odontoglossum Ringspott Virus: virus này gây hại trên cây lan thuộc chi
Odontoglossum, lá cây bị bệnh có các vết bệnh hình đốm vòng.
Virus là một loại kí sinh phân tử không có cấu tạo tế bào, nhưng cũng không
sinh sản bằng cách phân đôi như vi khuNn, virus sinh sản bằng cách kí sinh vài tế bào
sống và “ bắt ” tế bào cung cấp vật chất cần thiết cho virus tổng hợp thành protein và
vật chất di truyền của virus, sau đó các thành phần này lắp ráp với nhau tạo thành
virus con. Phương thức sinh sản này người ta gọi là sinh sản tái tạo (multiplication).
Như vậy sự sinh sản của virus hoàn toàn dựa vào vật chất của tế bào, làm cho tế bào
kiệt quệ và dẫn đến chết.
Virus thực vật muốn kí sinh và gây bệnh cho cây chủ thì virus phải bám được
vào thành tế bào và xâm nhiễm vào trong tế bào. Bản thân virus không chủ động di
chuyển và xâm nhập vào bên trong tế bào được. Sự xâm nhiễm của virus thực vật vào
cây chủ có thể thông qua các vectơ truyền bệnh như côn trùng, bét nhện,… hoặc qua
các vết thương cơ giới do con người gây ra trong quá trình cắt tỉa cây trồng. Sau khi
xâm nhập được vào bên trong tế bào, sự lây lan của virus từ tế bào này sang tế bào
khác có thể qua cầu nguyên sinh giữa các tế bào, hoặc qua dòng vận chuyển vật chất.
Người ta cũng phát hiện ra rằng trên tế bào có một số điểm nhận biết đặc biệt mà
virus có khả năng bám vào để từ đó xâm nhập vào tế bào, gọi là các thụ thể.
Sau khi xâm nhiễm vào tế bào cây chủ, virus sẽ giải phóng vật chất di truyền
(RNA, DNA) quá trình này gọi là sự lột áo (uncoating). Tiếp đó là quá trình tái tạo
vật chất di truyền và biểu đạt gen.
Đối với virus có vật chất di truyền là ARN (ARN virus), quá trình tái tạo ARN
gồm tái tạo ARN của virus và mARN protein của virus. “ARN virus ” lợi dụng
ribosom của cây chủ phiên dịch ra là enzym ARN- phụ thuộc ARN (ARN- dependent
ARN polymerasa, RdRp). Dưới tác dụng của RdRp tế bào sẽ tổng hợp ra hàng loạt
ARN con của virus và ARN tổ gen của virus, lúc này ARN tổ gen sẽ tiến hành phiên
dịch ra protein vỏ áo. Cuối cùng “ARN con” và “protein vỏ áo” lắp vào nhau tạo thể
virus con hoàn chỉnh. Vô số virus con được tạo thành sản sinh ra enzym phân giải
màng tế báo ký chủ để phóng thích virus con ra ngoài, từ đó tiếp tục xâm nhiễm sang
các tế bào bên cạnh.
Đối với virus có vật chất di truyền là ADN, sự tái tạo lại vật chất di truyền có
thể xảy ra theo con đường sau: đầu tiên là từ DNA sẽ phiên mã ra RNA , sau đó xảy
ra quá trình phiên mã ngược từ RNA qua DNA và quá trình tổng hợp protein từ RNA.
Cuối cùng là protein và DNA sẽ kết hợp với nhau để tạo thành virus mới hoàn chỉnh.
Như vậy virus sử dụng vật chất của tế bào để sinh sản. Do đó virus cũng gây ra
những biến đổi về sinh lí và hình thái bên ngoài của cây bị bệnh.
2.5.3 Virus gây biến đổi về sinh lí cây chủ.
Virus thực vật kí sinh bên trong tế bào và sử dụng vật chất của tế bào cây để
xây dựng cơ thể virus mới do đó gây ra những tác động lên quá trình tổng hợp và trao
đổi chất của tế bào cây chủ. Virus có thể kìm hãm sự tổng hợp, trao đổi chất này
trong khi đó lại kích thích sự tổng hợp và trao đổi chất khác.

17
 Virus tác động lên quá trình hoạt động của hệ thống men trong tế bào để kìm
hãm enzym phản ứng tạo nên một số chất này hay kích thích tạo ra nhiều chất có lợi
cho virus. Trong cây bị bệnh virus, hoạt động một số men oxi hóa được tăng cường
như oxidaza (Woods, 1899), peroxidaza (Kokin, 1937), tirodinaza, xitocromoxidaza
(Martin, 1954), polyfenoloxida (Van Kammen và Drouwer, 1964), ngược lại thì hoạt
động của một số men khác bị kìm hãm như catalaza (Vager, 1955).
Virus gây bệnh cho cây cũng tác động lên quá trình hô hấp của cây. Những
thay đổi này không ổn định (có thể cao hay thấp) tùy thuộc vào giai đoạn sinh trưởng
của cây, điều kiện thời tiết hay tình trạng sinh lí của cây trồng.
Bệnh virus thường làm giảm số lượng diệp lục trong lục lạp, do vậy làm giảm
hiệu quả quang hợp của cây. Cùng với sự giảm số lượng diệp lục thì các sắc tố như
antoxianit, carotinoit sẽ tăng lên, làm cho lá cây nhiễm bệnh virus chuyển màu từ màu
xanh sang màu vàng hay nâu đỏ.
Bên cạnh đó, virus thực vật còn làm thay đổi tốc độ trao đổi gluxit trong cây.
Ban đầu cây bị bệnh ở bộ phận hoa, lá cây sẽ tích lũy các chất đường ở vị trí nhiễm
bệnh. Nhưng về sau hàm lượng đường ở các lá bị bệnh sẽ thấp hơn so với các lá khỏe.
Nguyên nhân là do virus ban đầu làm cản trở quá trình vận chuyển ở các bộ phận bị
bệnh đến các bộ phận khác dẫn đến việc tích lũy đường ở các bộ phận này. Sau đó,
virus sử dụng vật chất của tế bào, thúc đNy quá trình hô hấp nên hàm lượng đường ở
bộ phận bị bệnh sẽ thấp hơn các bộ phận khác trong cây.
2.5.4 Virus gây biến đổi về hình thái.
Thông thường cây chủ chỉ có biểu hiện bệnh ra bên ngoài khi mà đã bị nhiễm
bệnh khá nặng. Một số triệu chứng về hình thái do virus gây ra:
- Triệu chứng khảm lá: Là triệu chứng rất phổ biến của nhiều bệnh virus mới hại
thực vật. Lá cây loang lổ chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng (Mosaic
- khảm lá). Khảm lá thường xảy ra ở các bệnh như: Virus khảm thuốc lá, khảm
ớt, dưa chuột, khảm lá đậu, khảm lá táo tây.
- Đốm chết hình nhẫn: Thương gặp là khảm và tạo ra đốm chết loại hình nhẫn
(đốm vòng) như bệnh đốm hình nhẫn ở cây đu đủ, cây mận, cây thuốc lá, cây
hoa cNm chướng.
- Triệu chứng hại gân lá: Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân sáng,
gân chết, gân biến dạng… như virus Y hại cây thuốc lá tạo gân sáng, virus Y
hại một số giống khoai tây (tạo gân biến dạng).
- Khảm lá, lùn cây: Là hiện tượng khảm lá kèm theo cây lùn như Maize mosaic
dwarf virus hay khảm sóc lá (Maize strerk trip mosaic virus) ở ngô, lúa, và các
cây đơn tử diệp.
- Xoăn, cuốn lá: Biến dạng lá như xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá
cây ớt, hồ tiêu.
- Biến màu và biến vàng: Là những triệu chứng gây biến vàng (ở lúa), gây hoá
xanh (ở cam, chanh).

18
 - Lùn bụi, tàn lụi: Là hiện tượng khá phổ biến như lùn bụi ở cây lạc, cây chuối
rụt, cây cam bị bệnh tritera virus. Vết chết ở thân cây, vết lõm thân như hiện
tượng sưng cành táo, vết lõm thân cây cam, chanh.
- Biến dạng củ, quả: Như ở táo, mận, nho bị nhiễm virus, quả cà chua bị đốm
héo, củ khoai tây ở cây bị bệnh vàng lùn.
Các triệu chứng bệnh trên còn phụ thuộc vào giống cây kí chủ, điều kiện môi
trường và chủng loại virus gây bệnh mà có sự biến đổi. Cùng một loại virus mà ở ba
nhóm chủng khác nhau có thể thể hiện thành nhiều nhóm triệu chứng khác nhau.
Bên cạnh đó các triệu chứng bệnh này không mang tính đặc thù, ví dụ như
virus bệnh đốm vòng thì vết bệnh cũng tương tự như bệnh đốm do một số loài nấm
gây nên. Do đó bệnh virus không chỉ khó phát hiện khi mới chớm bị, mà khi bị nặng
và có biểu hiện bệnh ra bên ngoài thì cũng rất dễ nhầm với bệnh do bệnh sinh lí, bệnh
nấm, hay một số tác nhân khác gây ra.
Tóm lại virus gây bệnh hại ở thực vật có một số đặc điểm sau:
Cây bị bệnh virus hiện nay thì không thể chữa được mà chỉ có thể làm ức chế
sự sinh sản của virus trong cây.
Bệnh virus gây thiệt hại lớn cho người trồng. Đối với những cây ngắn ngày
virus gây thiệt hại nhanh chóng. Ví dụ ở nước ta hiện nay, bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá
ở cây lúa do virus gây ra và lan truyền nhờ rầy nâu đang bùng phát, gây hậu quả nặng
nề cho bà con vùng đồng bằng Sông Cửu Long. Nhưng thiệt hại nặng nề hơn cả là
virus không làm cho cây trồng bị chết ngay khi còn nhỏ mà làm thoái hoá, giảm sức
sống, dần dần dẫn đến tàn lụi sau khi người trồng đã đầu tư rất nhiều vào việc chăm
sóc và nuôi dưỡng cây. Ví dụ ở Đà Lạt, có nhiều gia đình trồng địa lan đã mất 70%
đến 100% chậu địa lan đang trong giai đoạn có hoa.
Bệnh virus tồn tại lâu, khó phát hiện và triệu chứng bên ngoài không đặc thù
dễ gây nhầm lẫn. Việc chuNn đoán bệnh thì phức tạp, đòi hỏi kĩ thuật cao. Biểu hiện
bên ngoài của cây bị bệnh virus có chu kì biến đổi theo chu kì phát triển của virus,
theo tác động của yếu tố môi trường, đặc điểm sinh lí của cây chủ. Do đó những biểu
hiện bệnh bên ngoài của cây cũng thay đổi gây nhầm lẫn cho người trồng. Và đến khi
cây chủ không còn khả năng phục hồi theo chu kì bệnh thì cây sẽ hoàn toàn tàn lụi. Ví
dụ bệnh virus hại địa lan tại Đà Lạt, trong điều kiện mùa khô, nhiệt độ cao diễn biến
bệnh virus chậm chạp, nhưng vào mùa mưa lại bùng phát.
2.6 Virus hại địa lan
Những triệu trứng bệnh virus đầu tiên được miêu tả vào năm 1943 trước khi
Ivanopski phát hiện ra sự tồn tại của thế giới virus. Virus thực vật gây hại trên rất
nhiều loại cây trồng, có thể thấy trong tự nhiên đa số cây đều bị nhiễm virus. Ở nước
ta mà đặc biệt ở Đà lạt, trong những năm gần đây cùng với sự gia tăng về nhu cầu và
qui mô trồng lan thì bệnh virus hại lan cũng bùng phát và đã gây ra nhiều thiệt hại
nặng nề về kinh tế cho người trồng lan.
Theo ước tính thì đến nay có khoảng 25 loài virus hại lan. Những triệu chứng
biểu hiện bệnh virus gây hại trên lan rất đa dạng và không theo qui tắc nào cả. Đa số
virus thực vật gây vàng, chết mô hay hoại mô (thối nhũn) và biểu hiện ban đầu của

19
virus nhiều khi giống với bệnh sinh lí. Ví dụ: Bệnh trên địa lan do Cymbidium Mosaie
Virus gây ra, ban đầu giống với biểu hiện khi bón quá nhiều urê cho cây.
Trong họ lan thì địa lan là cây đặc thù của xứ lạnh và được trồng khá lâu ở Đà
lạt và có giá trị kinh tế cao. Ngày nay, dưới sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô,
việc mở rộng qui mô sản xuất lan đang gặp nhiều thuận lợi, bên cạnh đó thì việc lây
lan bệnh virus cũng đang là nguy cơ số một cho người trồng lan nếu cây lan không
sạch bệnh virus.
Trong số những loài virus hại địa lan hiện nay thì tại Đà Lạt có một số loài gây
hại chủ yếu: Cymbidium Mosaic Virus (CyMV), Tobaco Mosaic Virus (TMV),
Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), Cybidium Ringspot Virus (CyRV), Odotoglosum
(ORSV)...
2.6.1 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cymbidium Mosaic Virus trên cây
địa lan
Trên lá cây nhiễm bệnh ban đầu có nhiều chấm đen nhỏ, sau đó phát triển
thành vệt màu đen. Những vết bệnh lớn liên kết với nhau tạo thành những mảng đen ở
cả mặt trước và mặt sau.
Khi bệnh nặng thì những chấm đen ban đầu phát triển trên cả phần bẹ lá, toàn
bộ lá khô đi nhanh chóng và gây ra hiện tượng khô xám giả hành.
Trên những cây lan nhiều năm tuổi, trong cùng một chậu thì tất cả giả hành,
chồi non và phát hoa đều bị bệnh.
CyMV ngoài tác động làm khô lá thì còn gây thối theo đám từ gân lá ra ngoài
mép lá.
2.6.2 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tobaco Mosaic Virus orchid trên
cây địa lan
TMV orchid theo dòng vận chuyển vật chất lây lan khắp hệ thống cây trồng và
gây ra hiện tượng khảm lá, lùn cây, cây còi cọc.
Vết bệnh thường xuất hiện ở phần lá, ban đầu trên lá non xuất hiện một vài
đốm vàng xanh, sau đó các đốm xuất hiện ngày càng nhiều và gây hoại lá.
Với các lá bị nhiễm nhẹ, phiến lá nhỏ hẹp và mặt lá sần sùi.
Đặc điểm của vết bệnh là các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ
hẹp, xếp sít nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn bình thường.
2.6.3 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Tomato Spotted Wilt Virus trên cây
địa lan
Cây nhiễm virus TSWV có biểu hiện bệnh rõ rệt ở phần hoa, trên cả nụ non và
hoa đã nở, nhưng chủ yếu là hại ở phần nụ hoa. Các vết bệnh thường to và có màu
đen.

20
2.6.4 Đặc điểm về hình thái của bệnh do virus Cybidium Ringspot Virus (CyRV)
trên cây địa lan
Phần lá trên cây bị bệnh do virus CyRV thường có nhiều sọc vàng nhạt phân
biệt rõ với cùng xanh của phiến lá. Cây bị bệnh nặng thì các vết bệnh liên kết lại với
nhau làm cho cây bị vàng, các lá xếp sít với nhau và dựng thẳng đứng.
Bệnh thường xuất hiện ở cây con 6 tháng tuổi với bộ lá dày có màu vàng nhạt.
Trên cây lớn thì bệnh khiến cho phát hoa thấp ngắn, tuy có nụ hoa nhưng lại
không nở được.
2.7 Một số biện pháp đã được áp dụng để có cây sạch bệnh virus
Ngày nay, việc tạo ra các cây giống sạch bệnh để cung cấp cho người trồng là
vô cùng quan trọng và cần thiết. Hiện nay chỉ có hai phương pháp được sử dụng để có
cây trồng sạch bệnh là cây gieo từ hạt không bị tổn thương và phương pháp phục
tráng giống bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
2.7.1 Về phương pháp gieo hạt
Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là phương pháp nhân giống thường
được sử dụng cho lan. Đây là phương pháp tạo ra được số lượng lớn các cây con và
chủ yếu áp dụng với những cây mà thời gian tạo cây con bằng phương pháp nhân
giống vô tính là rất lâu và khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó để
nâng cao tỉ lệ hạt nảy mầm cho những cây có thể nảy mầm trong điều kiện tự nhiên
như lan, người ta gieo hạt trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Vấn đề quan trọng nhất trong phương pháp này là tìm ra môi trường gieo hạt
tối ưu để rút ngắn thời gian và tăng tỉ lệ hạt nảy mầm.
2.7.2 Về phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Đây là một trong những phương thức nuôi cấy mô trong phòng thí nghiệm
(nhân giống in- vitro). Nhân giống in- vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả
các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường
xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như
muối khoáng, các hormone tăng trưởng, carbon, và một số chất bổ trợ khác. Kĩ thuật
nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô
như lá, thân hoặc rễ.
2.7.3 Một số biện pháp bổ trợ khác
2.7.3.1 Phương pháp nhiệt độ
Thông thường, để ức chế sự tái bản của virus thì các mẫu thực vật được xử lí
với nhiệt độ ở 30 – 37 oC trong thời gian từ 10 - 14 ngày hay ở 40 – 55 oC trong 5 - 10
phút (Nguyễn Văn Tỵ, 2002).
Tuỳ vào loại mẫu cấy, kích thước mẫu cấy mà có thời gian và nhiệt độ xử lí
thích hợp. Sau đây là một số thí nghiệm đã tiến hành của nhiều tác giả với mục đích
ức chế sự nhân bản của virus bằng nhiệt độ là:
Để ức chế virus PVY - Potato Virus Y trên cây khoai tây, năm 1956 Thomson,
năm 1998 Leonhardt và cộng sự, tiến hành xử lí mẫu ở 35 – 38 oC trong 30 - 40 ngày.

21
 Walkey và Freeman xử lí mẫu với nhiệt độ 40 oC trong 16h có chiếu sáng và
22 oC trong 8 h tối, trên cây Nicotiana Rustica, để ức chế virus CMV - Cucumber
Mosaic Virus.
2.7.3.2 Phương pháp hoá học
Một trong những phương hướng khác trong việc ức chế sự tái bản virus trong
tế bào là sử dụng hoá chất mà đó là những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao đổi
chất axit nucleic.
Trong giai đầu của quá trình tìm kiếm, các nhà khoa học đã tìm thấy một số
hoạt chất như: Iot deoxyuridin, 2 - thiouracil,… Đây là những chất đồng dạng với
purin, pirimidin. Những chất này có tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thường
của các axit nucleic của virus. Bên cạnh đó những hoạt chất được tìm thấy trong thời
gian này tuy có tác dụng ức chế tác động của virus nhưng đồng thời cũng gây độc cho
tế bào.
Hợp chất được sử dụng sớm nhất trong là 2 – thiouracil, đựơc tìm ra vào năm
1952 do hai nhà khoa học là Commoner và Mercer. Từ lâu người ta đã biết đa số
virus có vật chất di truyền chứa uracil là một phần của acid nucleic. Do đó Commoner
và Mercer đã ức chế sự tái bản của virus trong cây thuốc lá bằng cách sử dụng 2 -
thiouracil.
Vào năm 1953, Jeener và Rosseels nhờ việc sử dụng đồng vị của sulfua (S35)
của 2 - thiouraci và chứng minh được rằng S35 đã tham gia vào acid nucleic của virus.
Sau đó hàng loạt những chất hoá học khác thuộc nhóm này được nghiên cứu.
Một số chất chất khác như 5- Fluorouracil (Heidelberger và cộng sự, 1957), 5 -
Chlorouracil, Azaguanin (Matthews, 1953),…
8 - Azaguanin là một hợp chất không có trong tự nhiên và được tổng hợp do
Matthews vào năm 1953. Matthews đã sử dụng 8 - Azaguanin trong thí nghiệm ức
chế sự nhân bản của virus CMV (Cucumber Mosaic Virus) và virus TMV (Tobaco
MosaicVirus).
Và thực tế là việc sử dụng 2 - thiouracil và một số chất hoá học khác thời kì
này đều không hiệu quả (Tam, 1959). Những chất này không chỉ ức chế sự tái bản
của virus mà đồng thời ức chế sự sinh trưởng và thậm chí gây chết đối với tế bào.
Nhưng dù sao, 2 - thiouracil khi sử dụng ở nồng độ phù hợp cũng thu được một số
thành công trong việc ức chế được sự tái bản của virus (Holmes,1955).
Ngày nay, ribazole là một hóa chất do con người tổng hợp được sử dụng rộng
rãi trong ức chế virus ở động vật và cả thực vật mà ít gây ảnh hưởng xấu lên tế bào
vật chủ nhất.
Ribazole là hợp chất thuộc nhóm kháng chuyển hoá nucleotide của virus do đó
có tác dụng ức chế sự nhân bản của virus trong tế bào.
Ribazole có công thức hoá học là C18H12N4O5 và cấu tạo hoá học như sau:

22
 Một số chế phNm có chứa ribazole là: Copegus, Rebetol, Ribasphere, Vilona,
và Virazole.
Ribazole là chất hoá học được tổng hợp nhân tạo, hiện chưa tìm thấy trong tự
nhiên, và lần đầu tiên được tổng hợp vào năm 1970 do nhà hoá học Joseph T.
Witkowski (Lau, 2002).
Vào năm 1972 Sidwell đã chứng minh rằng ribazole có thể ức chế hoạt động
của một số loài virus động vật mà ít gây độc cho tế bào.
Từ đó cho đến nay, ribazole đã đựơc chứng minh là không chỉ ức chế hoạt
động của rất nhiều loại virus động vật mà còn có tác dụng với cả virus thực vật. Theo
Simpkins và cộng sự (1981), theo Vicente De Fazio (1987), Chen và Sherwood
(1991) và gần đây là Fletcher cùng cộng sự (1998) đã cho thấy ribazole có tác dụng
ức chế virus thực vật nhân bản.
Việc ứng dụng ribazole trong nuôi cấy in- vitro để ức chế hoạt động của virus
thực vật trong việc làm sạch bệnh virus được bắt đầu từ những năm 1980 và đã được
áp dụng cho một số đối tượng thực vật. Đa số virus thực vật có vật chất di truyền là
ARN, một số ít còn lại có vật chất di truyền là ADN. Cả ADN và ARN đều có cấu tạo
từ các axit nucleotic. Mỗi nucleotid đều gồm có 3 phần là nhóm photphat, phân tử
đường 5 carbon và Bazơ nitơ. Có 5 loại bazơ nitơ là adenin, guanin, xitozin, timin,
uraxin. Trong đó ARN có 4 loại là adenin, uraxin, guanin, xitozin. Còn ADN có 4 loại
là adenin, timin, guanin, xitozin.
Ribazole có cấu tạo và tính chất hoá học tương tự cả adenosin lẫn guanosin.
Bên cạnh đó ribazole có thể hoạt động độc lập và tuần hoàn và đó là nguyên nhân mà
ribazole tham gia đồng hoá vào ARN và ADN của virus. Từ đó ribazole có một số tác
động chính sau:
Ribazole có thể ghép đôi với xitozine và uridine, từ đó gây rối loạn biến đổi sự
tổng hợp RNA của virus.
Thêm vào đó, dẫn xuất của ribazole là Ribazole 5’ monophotphat, Ribazole 5’
diphotphat, Ribazole 5’ triphotphat có tác dụng ức chế hoạt động của RNA
polymerase phụ thuộc vào ARN của virus.
Cuối cùng ribazole có thể cạnh tranh với Guanosin triphotphat, có tác dụng ức
chế hoạt động gen của virus thực vật.
Ribazole đã được áp dụng với rất nhiều cây trồng như khoai tây, thuốc lá,… và
mỗi loại cây trồng thích hợp với những nồng độ ribazole khác nhau.

23
 Ví dụ như đối với cây Allium Sativum L. thì nồng độ tối thích của ribazole
trong các thí nghiệm này là 205 µm (Hector Loszoya và Saldana; William. O
Dowson; T Murashige, 2006)
Đối với cây Oxalic Tuberosa Molina, Ullucus Tuberosus Caldas, Arraccia
Xanthorrhiza, thì nồng độ ribazole tối ưu là 50 mg/l môi trường nuôi cấy (Fletcher,
2001).
Đối với cây khoai tây, nồng độ ribazole được sử dụng trong khoảng 20- 30
mg/l môi trường MS có bổ sung kinetin, NAA và GA3.
Khi sử dụng ribazole trên cây chuối thì nồng độ ribazole là 50 mg/ l nhưng khi
sử dụng cho Nicotiniana Rustica thì nồng độ ribazole lại cao hơn là 100 mg/ l môi
trường nuôi cấy.
3. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc
3.1. Tình hình sản xuất hoa cúc
3.1.1. Trên thế giới
Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa cúc là loài quan trọng thứ hai sau hoa
hồng. Cúc còn được xem như là một trong những loài hoa trang trí được ưa chuộng
nhất trên toàn thế giới.
Ở Nhật Bản, hoa cúc là quốc hoa từ năm 910 (L.Naeve, và D. Nelson, 2005),
nên ngành sản xuất hoa cúc đã mang về lợi nhuận tăng hơn hai lần, chỉ trong vài thập
niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cũng như do nhu cầu thưởng
thức cuộc sống của người dân tăng nhanh. Hoa cúc ở Nhật Bản chiếm đến 35% tổng
sản phNm hoa cắt cành trong nước (Boase và cs, 1997).
Trên thế giới, hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều
nhất, với 2 tỉ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500
triệu; Hoa Kì:300 triệu (Boase và cs, 1997). Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành
quan trọng đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001).
Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng
làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25%
được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong
việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003).
Cải cúc (C.coronarium L.) được trồng rất phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc và
vùng Đông Nam Á, như một loại rau ăn hàng ngày khá phổ biến (Oka và cs., 1999).
Một số loài cúc khác có chứa một hàm lượng tinh dầu đáng kể, nên một số loài được
trồng để khai thác tinh dầu (Schwinn và cs., 1994).
3.1.2 Tại Việt Nam
Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi. Một số loài
được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ công anh (Lactuca laciniata
L.). Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu
thế kỉ XVI. Lúc đó chủ yếu dùng làm cảnh. Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như
một loại cây thương mại. Ở nước ta, Hà Nội là nơi có diện tích trồng hoa cúc nhiều
nhất, với diện tích 450 ha, sau đó là Thành Phố Hồ Chí Minh (370 ha). Đà Lạt là vùng

24
có diện tích trồng hoa cúc lớn thứ ba, với diện tích 160 ha ((N.Q. Trạch và Đ.V.Đông,
2002).
3.1.3 Tại Lâm Đồng
Hầu hết diện tích trồng hoa cúc ở Lâm Đồng tập trung ở thành phố Đà Lạt, ở các
huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương…diện tích không đáng kể. Mặc dù được
trồng từ khá lâu, nhưng hoa cúc trở thành một sản phNm thương mại mới từ năm 1995.
Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây. Diện
tích trồng hoa cúc chiếm đến 40-50% diện tích trồng hoa nói chung. Trong việc trồng
hoa cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp kĩ thuật, như dùng hệ thống đèn
chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính… Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng
với mục đích cắt cành. Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10-15 triệu cành.
Tại Đà Lạt, hiện có khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều
con đường khác nhau: chính thức và không chính thức. Do đó, việc xác định tên
thương phNm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khó khăn.
3.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) :
3.2.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại
Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978, họ cúc thuộc:
-Giới thực vật
-Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín)
-Lớp Magnoliopsida (Dicotyledonea) - Ngọc Lan (hai lá mầm)
-Bộ Asterales (cúc).
Bộ cúc có một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay Compositae) được xem
là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật nói chung. Bao gồm gần 1000 chi và
hơn 20 000 loài, có những chi có tới 1000 loài. Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên
Trái Đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường, đất đai khác nhau.
Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé.
(Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986).
Trong họ cúc được chia thành hai phân họ: hoa ống
(Asteroideae=Tubiliflorae) và thìa lìa (Cichorioideae=Liguliflorae).
Phân họ hoa ống có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm hoa đầu tiên hình ống
(ống phễu, ống sợi, ống hình chuông…), hoặc hoa hai môi, hoặc hoa có hoa hình ống
ở giữa và hoa thìa lìa giả xung quanh. Trong phân họ hoa ống có gần 740 chi, và rất
nhiều loài với các cây quen thuộc như là: ngãi cứu (Artemisia vulgaris L. var.indica
(Willd.) DC.), thanh hao (Artemisia carvifloria Wall.), nhọ nồi (Eclipta prostrata L.)
thược dược (Dahila pinnata Cav.)…
Trong đó, chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng
chậu hay hoa cắt cành. Hoa cúc là một loài hoa cắt cành phổ biến trên toàn thế giới,
nó đa dạng về các thứ và có hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985). Ngoài
ra một số loài khác trong chi này còn được dùng làm rau ăn, làm thuốc an thần, thuốc

25
chữa bệnh như là: cải cúc (C.coronarium L.), bạch cúc (C. moriforium Ramat), kim
cúc (C. indicum L.).
Phân họ thìa lìa có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm đầu tiên là hoa thìa lìa.
Phân họ này có ít loài hơn. Một số loài rất quen thuộc như là rau diếp, rau xà lách
(Lactuca sativa L.), rau diếp xoăn (Cichorium endivia L.), bồ công anh (Lactuca
laciniata L.) (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978).
3.2.2. Đặc điểm thực vật học
Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986;
N.Q. Trạch và Đ.V.Đông, 2002 thì cúc có các đặc điểm sau:
Rễ - Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm. rễ
cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn, nên khả năng hút nước và chất
dinh dướng rất mạnh. Do cúc được nhân giống bằng phương pháp vô tính, nên rễ mọc
ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất.
Thân - Thân hoa cúc là thân thảo nhỏ, nhiều đốt, mọng nước, giòn, dễ gãy. Trên thân
non một số loài có phủ một lớp lông tơ. Một số loài có dạng thân bò. Chiều cao thân
tuỳ loài. Nhưng đa số các giống nhập có thân to, thẳng, giòn. Còn các giống nội địa
có thân nhỏ, mảnh, cong.
Lá - Lá cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc so le. Bản lá có xẻ thuỳ hình
lông chim. Phiến lá mỏng, mặt dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn. Gân lá
hình mạng. Mỗi cây có khoảng 30 – 50 lá.
Hoa, quả - Hoa cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính. Hoa cúc có nhiều màu sắc khác nhau,
thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Hoa nhỏ, sít nhau và luôn luôn tập hợp thành cụm
hoa đầu, để một sâu bọ thụ phấn được cho nhiều hoa cùng một lúc. Đế hoa lồi lên.
Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả.
Ở cúc, quả là quả bế. Chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi dính
với vỏ quả. Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng không có nội nhũ. Quả phát tán nhờ
gió và động vật.

26
 Hình 1.1: Các dạng hoa cúc

(Nguồn:RHS A-Z Encyclopedia of Garden Plants (c) DK Images)

3.2.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Khí hậu - Đa số hoa cúc thích hợp với điều kiện khí hậu ôn hoà, mát mẻ, lượng mưa
đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới. Với nhiệt độ trên 250C, cúc sinh
trưởng và phát triển kém (L.Naeve, và D. Nelson, 2005).
Đất đai - Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai. Thích hợp với đất acid nhẹ, pH khoảng
6.0 - 6.5. Nhìn chung, cúc sẽ phát triển tốt trên đất có độ Nm tốt, thoáng khí, giàu chất
hữu cơ, đặc biệt là có phân chuồng. Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20-40
cm để đảm bảo độ thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ (M.N. Dana và B. R.
Lerner, 1996; M.Top và B. Tatura, 2002; L.Naeve, và D. Nelson, 2005).
Phân bón - Cúc là cây đòi hỏi một lượng phân bón khá lớn, vì vậy, cần bón 2 lần
NPK, với tỷ lệ 10:10:10. Mỗi lần bón khoảng 25 kg/ 100m2. Tốt hơn là bón lót trong
giai đoạn chuNn bị đất một lượng phân hữu cơ (M.N. Dana và B.R.Lerner, 1996;
M.Top và B. Tatura, 2002).
Cần chú ý không bón phân để cây bước vào giai đoạn ra hoa (L.Naeve, và D.
Nelson, 2005).
Nước tưới - Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu khô hạn kéo
dài sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy, tưới nước rất quan trọng
đối với cúc, nhất là trong mùa khô (L.Naeve, và D. Nelson, 2005).
Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước phải thấm sâu xuống
đất ít nhất 12-15cm. Cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước mạnh quá.
Những tổn thương này là nguyên nhân để các virus xâm nhập, các vi khuNn và nấm
phát triển (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996).
Sâu bệnh hại - Một số côn trùng gây hại trên cúc thường xuyên là rệp muội, sâu vẽ
bùa, nhện…Các bệnh thường gặp là: đốm lá, thối thân rễ, mốc sương…(M.N. Dana
và B. R. Lerner, 1996; L.Naeve, và D. Nelson, 2005).
Trong trường hợp sâu hại không nhiều lắm thì không cần thiết phải sử dụng
thuốc hoá học. Nên áp dụng biện pháp phòng ngừa tổng hợp, bằng thiên địch, bằng
bẫy côn trùng… (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996)

27
4. Virus và phương pháp ELISA
Virus rất nhỏ bé, chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Chúng
chưa có cấu trúc tế bào nên bắt buộc phải kí sinh nội bào trên cơ thể một sinh vật
khác (vi khuNn, nấm, động vật, thực vật). Chúng chỉ có cấu tạo bởi một vỏ protein
bao bọc bên ngoài một lõi acid nucleic. Chúng có đầy đủ các hoạt động sống như di
truyền, biến dị, tăng trưởng, sinh sản truyền nhiễm… mặc dù các hoạt động này đều
phải gắn liền với tế bào vật chủ.
Virus thực vật đã được phát hiện cách đây trên một thế kỷ và thu hút được sự
quan tâm của nhiều nhà sinh học. Ngành nông nghiệp hết sức lúng túng trước các
bệnh nghiêm trọng do virus gây nên vì cho đến nay vẫn chưa có thuốc phòng trừ đặc
hiệu (bệnh khảm thuốc lá, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở lúa…).
Cây bị bệnh virus có thể tàn lụi, chết. Một số bộ phận của cây như thân, hoa,
củ, quả, lá bị hủy hoại, cây phát triển kém dẫn tới năng suất giảm, chất lượng nông
sản về dinh dưỡng, cảm quan kém. Một số trường hợp bệnh hại cây có thể sinh ra
những độc tố gây ảnh hưởng xấu, trực tiếp đến sức khoẻ và đời sống của con người
và động vật.
Do tác hại của virus vô cùng to lớn nên cần có những biện pháp chuNn đoán và
phát hiện sớm để có biện pháp sử lý cho thích hợp. Hiện nay có nhiều phương pháp
chuNn đoán bệnh virus thực vật như phương pháp huyết thanh (trong đó phương pháp
DAS-ELISA là phương pháp huyết thanh hiện đại nhất), phương pháp cây chỉ thị,
phương pháp chuNn đoán bằng hiển vi điện tử, chuNn đoán phân tử (RT-PCR).
Phương pháp ELISA tới nay vẫn là phương pháp phát hiện virus hiệu quả,
nhanh chóng được sử dụng rộng rãi. Để thực hiện được phương pháp này cần phải
tách được protein của virus thực vật, bằng cách nghiền mẫu thực vật có chứa virus
trong dung dịch đệm nhằm giữ pH không đổi ở dịch chiết và thực hiện quy trình làm
tinh khiết virus.
ELISA là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thể đặc hiệu
chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu chứng hoặc ngay sau khi xuất hiện triệu chứng.
Kỹ thuật cho phép xác định kháng thể ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 µg/ ml).
Nguyên lý phương pháp này là kháng thể được đánh dấu bằng cách gắn với enzym.
Khi cơ chất thích hợp enzym sẽ phân giải, cơ chất cho sản phNm có màu. Đo cường
độ màu để biết mức độ phản ứng xảy ra.
Kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật “bánh kẹp”(sandwich), theo đó
kháng nguyên của cây bệnh (virus) được phản ứng với kháng thể sơ cấp đã biết, được
xác định khi cho thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzym.
Các bước thực hiện như sau:
- Cố định kháng thể sơ cấp (đã được biết) lên thành giếng
- Nạp dịch virus (kháng nguyên) vào giếng rồi ủ. Nếu kháng nguyên phù hợp sẽ
tạo phản ứng với kháng thể sơ cấp. Rửa nhẹ để loại bỏ kháng nguyên thừa.
- Thêm kháng thể thứ cấp có gắn enzym. Rửa nhẹ để loại bỏ kháng thể thừa.

28
 - Thêm cơ chất thích hợp với enzym. Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng
nguyên trong dịch chiết virus.
4.1. Bệnh khảm thuốc lá TMV (tobacco mosaic virus)
TMV là bệnh virus phổ biến ở các vùng trồng thuốc lá trên thế giới. Ở Việt
Nam bệnh gây hại nặng trên vùng trồng thuốc lá các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc
bộ. Cây bị nhiễm bệnh có thể giảm năng suất 35%, chất lượng thuốc lá cũng giảm
mạnh do hàm lượng nicotine giảm, lá dễ bị gãy nát.
Virus có khả năng truyền bệnh cao. Bệnh truyền chủ yếu qua con đường tiếp
xúc cơ học, các vết thương do xây xát. Virus vận chuyển trong cây theo hệ thống
mạch dẫn.
Bệnh Khảm thuốc lá có khả năng gây hại cho nhiều cây khác ngoài thuốc lá
như cây ớt, cà chua, địa lan, hoa cúc...
4.2. Bệnh khảm thuốc lá trên địa lan
Cây bệnh nhiễm hệ thống, gây hiện tượng khảm lún cây, cây còi cọc, xuất hiện
các vết chết hoại ở phần lá, trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng phiến lá nhỏ
hẹp, ,mặt lá sầm sùi. Các tế bào biểu bì trên phần sáng của vết bệnh nhỏ hẹp, xếp sít
nhau, ở phần xanh lam của vết bệnh tế bào biểu bì lớn hơn.
4.3. Bệnh khảm thuốc lá trên cúc
Trên lá non xuất hiện các lá xanh, vàng xen kẽ nhau, gân lá nhợt nhạt, lá nỏ
hẹp, cây chỉ bằng ½ cây khỏe, cây mất triệu chứng khi nhiệt độ giảm xuống 110C.
Cây nhiễm bệnh hệ thống.
Gây bệnh cho Cúc, Lan bao gồm nhiều yếu tố và nhiều nhóm vi sinh vật khác
nhau. Trong báo cáo này chúng tôi chỉ tiến hành test và đánh giá tác hại của virus
TMV. Bởi vì, TMV là một virus phổ rộng, đồng thới không phải là virus gây hại
chính cho các đối tượng trên. Do đó nếu các đối tượng trên nhiễm TMV thì xác suất
nhiễm các bệnh virus khác rất cao.

29
 Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:
2.2.1 Vật liệu ban đầu
Đặc thù của đề tài là nghiên cứu bảo tồn nguồn gen các giống cúc và hoa lan
cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt là sự đa dạng về giống, riêng giống cúc nhập
vào Đà lạt đã có hơn 70 giống. Chính vì vậy, trong phương pháp thực hiện nghiên
cứu chúng tôi chỉ nêu những phương pháp chung và trên một số giống làm chuNn, các
giống còn lại đều tuân thủ theo các bước sau đây:
a. Thu thập mẫu
b. Tách và nuôi cấy mô phân sinh.
c. Nhân nhanh protocorm (đối với địa lan), nhanh nhanh cây cúc in vitro
d. Chuyển protocorm và cây con sang môi trường xử lý virus
e. Tách lại mô phân sinh
f. Nhân nhanh và test virus
2.2 Phương pháp nghiên cứu
A. Phương pháp áp dụng trên đối tượng lan Cymbidium
Các thí nghiệm đã tiến hành sử dụng protocorm của ba giống địa lan sẵn có
trong phòng thí nghiệm. Ba giống đó là Trắng bệch, Tím hột, và Miretta xanh. Cả ba
gjống này đều cho hoa rất đẹp và các giống mà được trồng rộng rãi ở Đà Lạt.
1. Môi trường nuôi cấy
Trong các thí nghiệm đã thực hiện với môi trường khoáng Knudson C, MS và
1/2MS có bổ sung thêm các chất khác là:
Vitamin: các vitamin là myo - inositol, acid nicotinic, pyridoxine HCl,
Thiamin HCl. Đây là các vitamin được sử dụng trong môi trường MS.
Peptone được bổ sung với hàm lượng 2g/l.
Agar được bổ sung 8g/ l.
Chất điều hòa sinh trưởng bổ sung là BA: 0.5 mg/ l.
Đường saccharose với hàm lượng 30g/l.
2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.1. Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp và sử dụng ribazole hổ trợ
việc loại bỏ virus kết hợp với việc tách mô phân sinh đỉnh
 Các protocorme hình thành sau khi qua bước nuôi cấy đỉnh dinh trưởng, chúng
tôi tiếp tục bố trí nuôi cây trong các môi trường có hàm lượng khoáng MS, 1/2MS và
môi trường Knudson C.
Các thí nghiệm về tác động của của than hoạt tính, cytokinin (chọn BA),
cytokinin/auxin (chọn BA và NAA) đều sử dụng môi trường khoáng cơ bản là MS.
Cách bố trí thí nghiệm như sau:
- Thí nghiệm ảnh hưởng của BA: Chúng tôi bố trí 5 nồng độ khác nhau: 0, 0.5,
1.0, 1.5 và 2 mg/l.
- Thí nghiệm ảnh hưởng phối hợp giửa BA và NAA: này được thực hiện bởi
các protocorme nuôi cấy trong môi trường MS, có than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA
là 1ml/l và có bổ sung thêm các nồng độ NAA từ 0 – 2mg/l.
Chọn môi trường thích hợp từ các thí nghiệm trên để tiếp tục nghiên cứu tác
động của ribazole lên sinh trưởng của cây con. Chúng tôi sử dụng ribazole trong các
thí nghiệm với các nồng độ 0 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l và 150 mg/l. Dạng
ribazole đã sử dụng là chế phNm của Getz Pharma.
Các protocorm tái sinh trên môi trường đã xử lý ribazole, tiếp tục được cấy
chuyền để theo dõi khả năng phục hồi và test virus. Cây sạch bệnh tiếp tục được nhân
lên để giữ giống cũng như chuyển ra khảo nghiệm ở vườn ươm.
Các mẫu thí nghiệm trên được nuôi trong điều kiện phòng nuôi in- vitro với:
Thời gian chiếu sáng: 10h/ ngày.
Cường độ chiếu sáng: 45 micro mol m-2 s-1
Độ Nm trung bình: 75- 80 %
Nhiệt độ: 25- 27oC
Chỉ tiêu theo dõi:
Các chỉ tiêu được theo dõi là số mẫu cấy sống sót, số lượng protocorm mới
phát sinh sau 60 ngày nuôi cấy. Bên cạnh đó một số chỉ tiêu khác thường xuyên được
theo dõi là thời gian bắt đầu phát sinh protocorm mới, màu sắc mẫu cấy. Sau giai
đoạn xử lý, theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng của cây con (chiều cao, số lá, số rễ, trọng
lượng tươi sau ba tháng cấy chuyền…)
2.2. Nghiên cứu giá thể thích hợp cho cây lan con khi ra vườn ươm
Cây con sau khi rút khỏi môi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ,
nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể.
Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm
Với thí nghiệm giá thể: chúng tôi bố trí một số nghiệm thức sau:
Ký hiệu loại Loại giá thể
giá thể
I Dớn mút
II 3T

31
 III 3T/dớn xay (1:1)
IV Xơ dừa
V Dớn xay/Xơ dừa (3/1)
VI Dớn xay/Xơ dừa (2/1)
VII Dớn xay/Xơ dừa (1/1)
VIII Dớn xay

Số lượng cây con/ khay: 100 cây

Độ Nm giá thể: 70 – 80%
Độ Nm không khí: 90 – 95%
Nhiệt độ nuôi trồng: 20-25oC
Ánh sáng: Độ che sáng > 70%
Số lần tưới/ngày: 3-5 lần
Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha loãng có EC 1.0 ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ
tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)
2.3. Nghiên cứu chế độ phân bón cho cây con giai đoạn ra vườn ươm
Cây con sau khi rút khỏi môi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ,
nhúng rễ cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể. Giá thể được chọn ra từ
những kết quả nghiên cứu giá thể để bố trí thí nghiệm.
Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm
Số lượng cây con/ khay: 100 cây
Độ Nm giá thể: 70 – 80%
Độ Nm không khí: 90 – 95%
Nhiệt độ nuôi trồng: 20-25oC
Ánh sáng: Độ che sáng > 70%
Số lần tưới/ngày: 3-5 lần
Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha loãng có EC thay đổi từ 0; 0.5; 1.0 và 1.5ds/m
phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần đầu tiên sau khi mới ra cây)
B. Phương pháp áp dụng trên đối tượng hoa cúc
Với các giống cúc chúng tôi chọn các giống hoa cúc được trồng khá phổ biến ở
Đà Lạt farm hồng, pingpong vàng, nút vàng, nút tìm, tia muỗng vàng. Các giống thu
thập còn lại đều theo một qui trình mẫu tương tự các giống nêu ra ở đây.
Trong đề tài chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là các đế hoa, được lấy từ các
vườn sản xuất của bà con nông dân trong địa bàn thành phố Đà Lạt.
Quy trình xử lý mẫu như sau:

32
 - Chọn đế hoa từ cây trồng trên vườn.
- Rửa bằng xà phòng và rửa lại bằng nước cất nhiều lần, đảm bảo sạch hết xà
phòng.
- Khử trùng mẫu bằng TTCA với nồng độ 15g/l, trong 10 phút. Trong quá trình
khử mẫu luôn lắc đều đặn, nhẹ nhàng để đảm bảo các mẫu được khử trùng đều.
- Đưa vào điều kiện vô trùng để rửa lại nhiều lần bằng nước cất (4-5 lần) , trước
khi đưa vào nuôi cấy trong môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA đã
chuNn bị sẵn.
Đế hoa sau khi nuôi cấy 30 ngày, có thể tiếp tục cấy chuyền trong môi trường
nhân nhanh (MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA) để đảm bảo số lượng đỉnh chồi cần thiết
cho thí nghiệm.

33
Môi trường nuôi cấy
Môi trường để nuôi cấy là môi trường MS (Murashige – Skooge, 1962), bổ
sung 30g/l đường, 8g/l agar, chất điều hoà sinh trưởng gồm có: 0.2mg/l IBA, 0.5mg/l
BA; và được bổ sung Ribazole ở các nồng độ khác nhau.
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH =5.8 bằng KOH (1N), hoặc HCL
(1N). Môi trường nuôi cấy được đun cho hoà tan các thành phần trước khi khử trùng
bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm trong 30 phút.
Sau khi khử trùng, môi trường được đổ vào bao nilon 500ml, chứa 100ml môi
trường. Bao nilon cũng đã được hấp vô trùng trong autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1 atm
trong 30 phút. Quá trình đổ môi trường vào bao nilon được tiến hành trong tủ cấy ở
điều kiện vô trùng.

Bảng 2.1 :Thành phần cơ bản của môi trường MS

Thành phần Nồng độ (mg/l)
CaCl2.2H2O 440
KH2PO4 170
Muối khoáng đa lượng KNO3 1900
MgSO4.7H2O 370
NH4NO3 1650
MnSO4.4H2O 22.3
ZnSO4.7H2O 8.6
H3BO3 6.2
KI 0.83
Muối khoáng vi lượng Na2MoO4.2H2O 0.25
FeSO4.7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
Cu SO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
Glyxin 2
Myo-inositol 100
Vitamin và các thành Acid nicotinic (Niaxin) 0.5
phần hữu cơ
Thiamin HCl (vitamin B1) 0.1
Pyridoxine HCl (vitamim B6) 0.5

34
Bảng 2.2 :Thành phần cơ bản của môi trường Knudson C (1946)
Ca(NO3)2 * 4 H2O 1000 mg
KH2PO4 250 mg
MgSO4 * 7 H2O 250 mg
(NH4)2SO4 500 mg
FeSO4 * 7 H2O 25 mg
MnSO4 * 4 H2O 7.5 mg
Sucrose 20 g
Agar 12-15 g

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn. Chọn mẫu cấy ban đầu (đế
hoa) có kích thước tương đối đồng đều. Mỗi bao nilon được cấy 9 mẫu, lặp lại 3 lần.
Sau khi cấy, các mẫu cấy được bố trí nuôi trong phòng cây, đảm bảo ánh sáng đồng
đều với thời gian chiếu sáng 16 giờ. Nhiệt độ trong khoảng 18-250C.
Phương pháp lấy chỉ tiêu và xử lý số liệu:
Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, chúng tôi tiến hành lấy số liệu gồm các chỉ
tiêu về số chồi/cụm chồi; chiều cao chồi (tính từ gốc đến ngọn) để nhận xét về mức
độ sinh trưởng và phát triển của cây dưới ảnh hưởng của Ribazole.
Số liệu được tính toán trên phần mềm EXCEL phiên bản 2003, của Microsoft.
Gồm có tính các số liệu trung bình trong mỗi nghiệm thức và dùng công cụ data
analysis để phân tích số liệu bằng bảng ANOVA.
Các thí nghiệm
- Ảnh hưởng của Ribazole lên sự sinh trưởng phát triển in vitro
Các cây in-vitro được nuôi cấy từ đế ban đầu, được dùng làm vật liệu cho thí
nghiệm. Từ các đỉnh chồi tách ra từ cây in-vitro, theo từng giống, sẽ được cấy vào các
lô nghiệm thức khác nhau. Trên mỗi giống, các lô thí nghiệm bao gồm:

Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4

Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100 150

Sau 30 ngày nuôi cấy, các cây sẽ được đo đạc các chỉ tiêu: số chồi/cụm, chiều
cao chồi và tỷ lệ sống.
Sự phục hồi của cây sau khi xử lý ribazole
Các cây sau khi đã xử lý ribazole, chúng tôi tiến hành tách đỉnh chồi, cấy
chuyền lại trong môi trường nhân nhanh bình thường, để kiểm tra sự phục hồi của cúc
sau khi xử lý ribazole.

35
 Do một số điều kiện khách quan, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự phục hồi sau
của cây còn sống ở tất cả các nồng độ đối với ba giống (tia muỗng vàng, farm hồng
và pingpong vàng); đối với hai giống còn lại (nút vàng và nút tím) chúng tôi kiểm tra
ở lô nghiệm thức R2 để so sánh với lô đối chứng.
Các chỉ tiêu quan sát cũng bao gồm: số chồi/cụm, chiều cao chồi và tỷ lệ sống
của mẫu cấy.
Phương pháp test virus
- Đối tượng là các cây hoa địa lan, hoa cúc có triệu chứng nhiễm bệnh virus
TMV điển hình theo mô tả trên và các mẫu cây trong ống nghiệm được sử lý
loại virus.
- Thời gian:
Đợt 1: 5//2006 – 6/2006
Đợt 2: 9/2007
- Địa điểm:
+ Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc
khoa Sinh học- Đại học Đà Lạt
+ Mẫu vật lấy tại một số vườn trồng Cúc và lan trên địa bàn Phường 8 – Tp Đà
Lạt và mẫu ở PNCM khoa Nông Lâm
Bộ kít và máy ELISA
- Mondel 680 Microplate Reader S/N/14172
- Kit. name : Full kit 1000 Tests (Bio – rad)
Quá trình tiến hành
b. Xử lý mẫu
Bước 1: Làm sạch mẫu
- Rửa mẫu sạch bằng nước
lau qua bằng cồn 700C
ngâm Javen (4%)
khoảng 5 phút (chú ý tránh để mẫu bị xây sát nhiều)
Rửa bằng nước cất vô
trùng 3 lần. Dùng giấy thấm vô trùng thấm khô.
- Cối sứ: ngâm Javen (4%) trong 5 phút
Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.
Bước 2: Tách chiết
- Mẫu thực vật: Cân 2 g mẫu lá cho mỗi giống trước khi đem xử lý.
- Nghiền mẫu trong cối sứ có chứa dung dịch đệm chiết (lượng đệm chiết tuỳ
thuộc vào lượng mẫu).
* Cách pha đệm chiết : 1g mẫu : 0,5 ml dịch đệm chiết : 9,5 ml nước cất vô
trùng
- Chiết lấy dịch nổi, bảo quản vào ở 2 -80C để dịch chiết lắng cặn. Sau đó hút ra
2 ống eppendorf (1ml/ống)
- Votext
Ly tâm 4500vòng /phút trong 5’ ở nhiệt độ 60C

36
 c. Test ELISA
Bước 1: Phủ kháng thể sơ cấp
- Đệm phủ (màu xanh) pha trong nước cất với tỷ lệ 1/5
- Kháng thể sơ cấp (Ab1) hòa trong đệm phủ với tỷ lệ 1/100. Vortex trước khi
sử dụng.
- Nạp vào mỗi giếng 100µl.
- Đậy Microplate bằng màng film, tiến hành ủ hỗn hợp trên trong 2 giờ ở 370C.
- Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn. Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ
kháng thể thừa và thấm khô giếng bằng giấy thấm.
Bước 2: Nạp mẫu
- Mẫu:
+ Mẫu dịch chiết (M) được chuNn bị ở phần tách chiết virus.
+ Chứng dương (+), chứng âm (-) được pha bằng nước cất vô trùng.
+ Chứng trắng (0): Nước cất vô trùng
+ Đệm cơ chất (không màu): pha loãng theo tỷ lệ 1:19

Vortex trước khi sử dụng
- Tiến hành nạp mẫu vào các giếng trong Micrplates
- Ủ mẫu ở 2 –80C trong 12 h (giếng được đậy bằng màng film)
- Rửa mẫu: sau khi ủ đổ và rảy khô giếng. Rửa 3 lần bằng PBS- Tween, 2 lần
đầu đổ rửa đổ ngay, lần 3 sau 3 phút mới đổ. Sau mỗi lần đổ thấm khô bằng
giấy thấm.
Bước 3: Phủ kháng thể thứ cấp
- Đệm cộng hợp (màu đỏ) được pha loãng trong nước cất với tỷ lệ 1/5.
- Kháng thể thứ cấp (Ab2) pha loãng trong đệm cộng hợp với tỷ lệ 1/100.
Vortex trước khi sử dụng
- Nạp vào mỗi giếng 100µl dung dich trên.
- Đậy màng film và ủ trong 2h ở 370C.
- Rửa 3 lần bằng PBS – Tween được pha sẵn. Quá trình rửa sẽ giúp loại bỏ
kháng thể thừa và thấm khô giếng bằng giấy thấm
Bước 4: Nạp cơ chất
- Pha loãng 2ml đệm cơ chất trong 8ml nước cất tiệt trùng (tỷ lệ 1/5).
- Dùng 2 viên cơ chất pha vào dung dịch đệm trên.
- Nạp vào mỗi giếng 100µl hỗn hợp trên.
- Đậy giếng bằng màng film và ủ ở 370C trong 30’
Bước 5: Đọc kết quả

37
 - Sau khi ủ, đưa mẫu vào máy ELISA, đọc kết quả lần thứ nhất.
- Đọc kết quả 3 lần, mỗi lần cách nhau 30’. Lần 3 cách lần 2 là 3h.
d. Phân tích kết quả từ máy đọc ELISA
- Kết quả thí nghiệm ELISA là sạch (âm tính) khi giá trị thu được của mẫu
bệnh ≤0.5 giá trị đối chứng sạch bệnh (chứng trắng hoặc nước)
- Kết quả ELISA là bị bệnh (dương tính) khi giá trị thu được của mẫu kiểm tra
≥1.5 lần giá trị đối chứng sạch bệnh.
- Kết quả thí nghiệm ELISA là nghi ngờ bị bệnh khi giá trị thu được của mẫu
kiểm tra lớn hơn giá trị đối chứng sạch bệnh từ 0.5 – 1 lần.
* Chú ý: trong báo cáo này, mẫu ghi ngờ bị nhiễm bệnh sẽ bị coi là có bệnh
Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel 2003 để phân tích và tổng hợp các số liệu thô thu thập
được từ các thí nghiệm.
Dùng phần mềm MSTATC phân tích thống kê các số liệu bằng ANOVA với
mức sai số có ý nghĩa là 0.01.

38
 Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

A. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC GIỐNG ĐNA LAN CẮT CÀNH
3.1 Kết quả điều tra các loài địa lan hiện có tại Đà lạt
Bảng 3.1. Danh mục các loài địa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt
STT TÊN THƯƠNG MAI STT TÊN THƯƠNG MAI
1 Hồng bệch 20 Tím họng vàng
2 Trắng Balkis 21 Hồng cánh sen
3 Trắng vằn 22 Hồng phấn
4 Trắng lá lúa 23 Tím hột
5 Trắng tím hoa cà 24 Hồng năm nghĩa
6 Trắng bảo trọng 25 Đỏ bà mai
7 Bạch hồng hoàng 26 Tím việt quang
8 Trắng neon 27 Đỏ toản
9 Liễu rũ 28 Xanh oliu
10 Vàng da beo 29 Cam lửa
11 BGH 30 Trắng bệt
12 Vàng chùm 31 Xanh lưỡi chấm
13 Vàng Ba Râu 32 Xanh lưỡi đỏ
14 Vàng lụa 33 Xanh ngọc
15 Vàng hải 34 Xanh cánh nhọn
16 Xanh chiểu 35 Vàng rút
17 Miretta xanh 36 Vàng chiêm
18 Vầng trăng 37 Hồng úc
19 Xanh olive 38 Hồng nhật
3.2 Khảo sát môi trường nhân giống
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đã xuất hiện và phát triển ở
nhiều phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Nhiều phương pháp nuôi cấy đã được áp
dụng nhằm mục đích nhân giống cây trồng, bảo tồn nguồn gen quý, lai tạo, đa dạng
hoá các kiểu di truyền thực vật. Phương pháp nhân giống vô tính in vitro được sử
dụng trong đề tài để nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng, vitamin, và chất điều hoà
sinh trưởng thực vật trên sự tăng trưởng của ba giống địa lan: Trắng bệt, Tím hột,
Miretta xanh.
Nhu cầu dinh dưỡng, điều kiện lý hoá với mỗi đối tượng thực vật khác nhau là
không giống nhau. Do đó không thể áp dụng quy trình nhân giống của đối tượng này
lên đối tượng khác. Khi nghiên cứu trên ba giống địa lan nói trên, việc tìm ra phương
pháp vô trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy thuận lợi cho sự tái sinh chồi, sự tăng
trưởng về kích thước, trọng lượng, chiều cao cũng như sự phân hoá của các cơ quan
góp phần xây dựng quy trính nhân ba giống địa lan nói trên.
 Thông qua việc bố trí 4 thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân
giống in vitro lên sự phát triển của địa lan, chúng tôi thu được kết quả sau.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường lên quá trình phát sinh chồi
Để khảo sát các protocorme được nuôi cấy trong các môi trường có hàm lượng
khoáng khác nhau, môi trường MS, 1/2MS và môi trường Knudson C, kết quả sau 2
tháng nuôi cấy chúng tôi ghi nhận kết quả trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường lên quá trình phát sinh chồi của ba
giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh

Đối tượng Môi trường Tỉ lệ chồi hình

thành (%)
MS 20
Trắng bệt 1/2MS 12
Knudson C 16
MS 19
Tím hột 1/2MS 12
Knudson C 16
MS 20
Miretta xanh 1/2MS 10
Knudson C 11
Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát từng loại môi trường có ảnh hưởng
như thế nào để số lượng chồi trên từng loại giống. Theo kết quả ở bảng 1, biểu đồ 1
và biểu đồ 2 chúng tôi thấy rằng: Với loại môi trường ½ MS thì cả ba giống đều cho
số lượng chồi không cao, chúng rất hạn chế trong sự phát sinh protocorme nhưng còn
đối với loại môi trường Knudson C thì số lượng chồi có phát triển nhiều hơn so với
môi trường ½ MS số lượng protocom phát sinh đáng kể nhưng protocom có nhiều
lông hút.
Còn loại môi trường MS thì lại là khả thi nhất loại môi trường này cho số
lượng protocom nhiều nhất, ít lông hút và protocom phát triển đều hơn, sinh trưởng
mạnh hơn. Do vậy, chúng tôi sử dụng môi trường MS làm môi trường cơ bản trong
quá trình nhân nhanh Cymbidium.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh chồi của
Lan Cymbidium
Than hoạt tính không phải là chất kích thích sinh trưởng nhưng khi bổ sung
vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và tác dụng khử độc trong môi trường, đặc biệt
là với các cây họ lan đặc biệt là nó có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Việc
hấp thu các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy hoặc từ mô cấy tạo điều kiện thuận
lợi cho sự sinh trưởng của Cymbidium sp.. Ngoài ra những nghiên cứu gần đây cũng
chỉ ra rằng quá trình thúc đNy cơ quan biệt hóa tạo rễ cũng chịu ảnh hưởng của than
hoạt tính. Kết quả nghiên cứu trên ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh sau 60
ngày cấy được thể hiện ở bảng 3.3.

40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình phát sinh chồi của ba giống
Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh.

Đối tượng Hàm lượng Tỉ lệ chồi hình

than (g/l) thành (%)
0 11
0.5 13
Trắng bệt
1 21
1.5 22
2 19
0 11
0.5 12
1 18
Tím hột
1.5 15
2 2
0 8
0.5 8
Miretta xanh 1 18
1.5 10
2 11

Ở thí nghiệm này chúng tôi quan sát sự ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá
trình phát sinh chồi cho thấy: Với môi trường MS không bổ sung than hoạt tính thì số
lượng chồi không nhiều, hình thái cây sinh trưởng rất kém: cây, rễ có phát triển
nhưng lại còn rất nhỏ nên chúng sẽ bị ảnh hưởng trong quá trình sinh trưởng và phát
triển ở giai đoạn ex-vitro.
Môi truờng MS có bổ sung 0.5 g/l than hoạt tính thì cũng như môi trường MS
không bổ sung than hoạt tính số lượng protocorme còn rất thấp, nhưng hình thái có
thay đổi hơn là cây có phát triển, rễ cũng phát triển rất mạnh. Như vậy thì với nghiệm
thức này thì chủ yếu là rễ phát triển chứ chưa có sự phân chia mạnh để tạo lượng
protocorme thích hợp.
Còn môi trường MS có bổ sung 1.5 g/l than hoạt tính và 2g/l than hoạt tính thì
lượng protocorme tạo ra nhiều hơn 2 nghiệm thức vừa nói trên nhưng cây tạo ra cũng
chưa nhiều lắm và protocorme cũng không đông đều.
Với môi trường MS có bổ sung 1 g/l than hoạt tính thì lượng protocorme tạo ra
nhiều và vượt trội hẳn các nghiệm thức trên, cây, rễ phát triển mạnh và rất đều.
Qua thí nghiệm này chúng tôi thấy than hoạt tính cũng góp phần vào sự phân
chia tế bào để tạo ra số lượng protocorme thích hợp, để góp phần nhân nhanh
Cymbidium ứng với một lượng nhất định.

41
Thí nghiệm 3: Sự ảnh hưởng của các nồng độ BA đến quá trình phát sinh chồi
BA là một chất điều tiết sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Cytokinin, là nhóm
được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô hiện nay. Tác dụng chủ yếu
của nó là kích thích sự phân chia tế bào, thúc đNy sự hoạt động của chồi bên. Nồng độ
sử dụng khác nhau tuỳ đối tượng thực vật nuôi cấy, chẳng hạn ở nồng độ 22µM thích
hợp với sự phát triển chồi ở Cymbidium aloifolium, nhưng đối với Dendrobium
aphyllum và Dendrobium moschatum nồng độ thích hợp nhất cho sự phát triến của
chồi là 44µM (N.R.Nayak và cộng sự, 1997). Để tìm nồng độ phù hợp của BA lên sự
tạo protocorm của các giống Cymbidium sp. trong thí nghiệm này chúng tôi bố trí 5
nồng độ khác nhau: 0, 0.5, 1.0, 1.5 và 2 mg/l. Sau 12 tuần nuôi cấy, chúng tôi quan
sát và ghi nhận được kết quả ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt,
Tím hột, Miretta xanh

Đối tượng Hàm lượng Nồng độ Tỉ lệ chồi hình

than (g/l) BA (ml/l) thành (%)
1 0 8
1 0.5 10
Trắng bệt
1 1 20
1 1.5 14
1 2 12
1 0 10
1 0.5 13
1 1 28
Tím hột
1 1.5 16
1 2 16
1 0 6
1 0.5 7
Miretta xanh 1 1 20
1 1.5 14
1 2 9

Với thí nghiệm này thì giống Tím hột là loài thích hợp nhất cho sự tạo chồi,
đạt tới 41,5% nhưng số cây hoàn chỉnh thì lại rất ít, còn Trắng bệt và Miretta xanh thì
cả 2 loài này chiếm tỉ lệ ít hơn nhưng lại vừa tạo protocorm vừa tạo cây, Trắng bệt
chiếm 31,7% còn Miretta xanh chiếm khoảng 26,8%.
Với MS + 1g/l than hoạt tính và không bổ sung BA và môi trường MS + 1 g/l
tan hoạt tính + 0,5ml/l, với 2 nghiệm thức này thì sự thích nghi của các protocorme
còn rất kém, chứng tỏ đây không phải là nồng thích hợp chó các protocorme của Địa
Lan phát triển.
Tại môi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 2ml/l BA thí các protocorm phát
triển cũng không nhiều, tạo cây và rễ lại còn phát triển rất mạnh. Ở môi trường MS +
1g/l than hoạt tính + 1,5ml/l BA thì số lượng protocorm có phát triển hơn nhưng cũng

42
chủ yếu là tạo cây và rễ. Nen đây cũng chưa là môi trường thích hợp cho quá trình
nhân nhanh ở cây Địa Lan.
Môi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA lại cho số lượng protocorm là
nhiều nhất, một số tạo cây, rễ và một số khác tạo protocorme cũng mạnh , đều. Do đó
môi trường MS + 1g/l than hoạt tính + 1ml/l BA là môi trường thích hợp để tiếp tục
phục vụ cho quá trình nhân nhanh ở cây Địa Lan.
Thí nghiệm 4: Sự ảnh hưởng BA + NAA đến quá trình hình thành chồi
Thí nghiệm này được thực hiện bởi các protocorme nuôi cấy trong môi trường
MS, có than hoạt tính là 1g/l, nồng độ BA là 1ml/l và có bổ sung thêm các nồng độ
NAA khác nhau. Sau 2 tháng nuôi cấy, quan sát, ghi nhận được kết quả như ở bảng
3.5 sau:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA + NAA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống
Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh

Đối tượng BA (mg/l) NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi

hình thành (%)
1 0 11
1 0.5 15
Trắng bệt
1 1 22
1 1.5 16
1 2 17
1 0 9
1 0.5 11
1 1 17
Tím hột
1 1.5 12
1 2 12
1 0 12
1 0.5 21
Miretta xanh 1 1 27
1 1.5 23
1 2 24

Ngược lại với thí nghiệm 3: Miretta xanh nhường như không thích hợp với các
nồng độ của BA nhưng khi phối hợp với NAA thí các protocorme của Miretta xanh
lại phát triển rất tốt, tốt hơn cả Trắng bệt và Tím hột, chiếm tới 41,5% so với tỉ lệ chồi.
Với sự nghiên cứu của các chất điều hòa sinh trưởng thì Trắng bệt là loài ổn
định nhất , với thí nghiệm ảnh hưởng của BA thì Trắng bệt chiếm 31,7% còn ở thí
nghiệm ản hưởng của sự phối hợp của BA + NAA cũng chiếm với tỉ lệ tương đương
là 32,7%. Điều này cho ta thấy được đối với chất điều hòa sinh trưởng như BA hay
NAA thì các protocorme của Trắng bệt đều phát triển. Tím hột với thí nghiệm này chỉ
chiếm 26,8%. Qua thí nghiệm này ta thấy được sự thích hợp của các loài khác nhau
ứng với từng chất điều hòa sinh trưởng là khác nhau.

43
 Nồng độ BA + NAA 1: 0ml/l ở môi trường MS + 1g/l than hoạt tính thì lượng
protocorm tạo ra là kém, ở nồng độ BA + NAA 1: 0,5ml/l protocorme có phát triển
hơn BA + NAA 1: 0ml/l nhưng cũng không đáng kể, cũng cón hạn chế về lượng
protocorme.
Ở nồng độ BA + NAA 1:1,5ml/l và nồng độ BA + NAA 1: 2ml/l thì vừa tạo
protocorm lại vừa tạo cây. Ở 2 nồng độ này lượng protocorm tạo ra không hơn kém
nhau bao nhiêu. Còn ở nồng độ BA + NAA 1:1ml/l hầu hết các loài là thích hợp, số
lượng protocorme là cao nhất, một số tạo cây, rễ.

3.3. Khảo sát tác động của ribazole lên sự sinh trưởng của protocorm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát
sinh protocorm mới của ba giống địa lan tím hột, Trắng bệt và Miretta xanh của
Đà Lạt
Ribazole là hợp chất thuộc nhóm kháng chuyển hoá nucleotide của virus.
Ribazole có cấu tạo và tính chất hoá học tương tự cả adenosin lẫn guanosin. Bên cạnh
đó Ribazole có thể hoạt động độc lập và tuần hoàn và đó là nguyên nhân mà ribazole
tham gia đồng hoá vào ARN và AND của virus và ức chế sự nhân bản của virus thực
vật trong tế bào. Bên cạnh tác dụng ức chế sự nhân bản của virus thì bản thân ribazole
cũng gây ức chế lên sự sinh trưởng và phát triển của tế bào thực vật.
Trong thí nghiệm đã thực hiện với ba giống địa lan Trắng bệt, và Tím hột cho
thấy, ở nghiệm thức đối chứng có tí lệ mẫu sống đạt 100 %, trong khi đó khi nồng độ
ribazole tăng dần từ 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l có tỉ lệ sống giảm dần so
với đối chứng không sử dụng ribazole (Bảng 3.9 và 3.10). Đặc biệt ở nồng độ 100
mg/l và 150 mg/l thì tỉ lệ sống sót giảm rõ rệt.
Ở các nghiệm thức đối chứng số protocorm mới được tạo thành cao hơn hẳn các
nghiệm thức có sử dụng ribazole, nồng độ ribazole càng cao thì số protocorm mới
phát sinh trên những mẫu còn sống cũng thấp dần.
Nếu ta so sánh hệ số nhân tính theo những mẫu còn sống thì ở nồng độ 50 mg/l;
75 mg/l và 100 mg/l là khá cao. Tuy nhiên khi ta so sánh hệ số nhân này tính theo
tổng số mẫu ban đầu đưa vào ở nồng độ 100 mg/l của hai giống Trắng bệt và Tím hột
thì số protocorm mới thu được thấp hơn số tổng mẫu ban đầu.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm
của Trắng bệt
Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100 150
(1) (2) (3) (4) (5)
Tỉ lệ sống sót 100 94,4 83,3 61,1 44,4
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 2,9 1, 6 0,9 0,6 0.5
Trong quá trình theo dõi chúng tôi nhận thấy, thời gian bắt đầu phát sinh
protocorm mới trong nghiệm thức đối chứng ở cả ba giống là sớm hơn so với các
nghiệm thức còn lại. Ở nghiệm thức đối chứng, giống Trắng bệt bắt đầu phát sinh

44
protocorm mới sau 28 ngày; giống Miretta xanh - 22 ngày; giống tím hột thì sau 21
ngày.
Ở các nghiệm thức sử dụng nồng độ ribazole càng cao thì thời gian bắt đầu phát
sinh protocorm càng dài. Ở nghiệm thức (4) và (5) sự phát sinh protocorm mới thể
hiện không rõ ràng như nghiệm thức đối chứng, đặc biệt là ở nghiệm thức (5). Ở
giống Miretta xanh, các mẫu ở nghiệm thức đối chứng bắt đầu phát sinh protocorm
sau 22 ngày, ở nghiệm thức (2) (3) thì sau 31 ngày, ở nghiệm thức (4) thì sau 37 ngày.
Các mẫu protocorm ở nghiệm thức đối chứng có màu xanh đậm nhất còn các
mẫu còn sống ở nghiệm thức (5) chuyển sang màu vàng nâu và hầu như không còn
màu xanh.
Như vậy, ribazole không chỉ ức chế sự tái bản của virus, mà qua các thí nghiệm
đã thực hiện chúng tôi nhận thấy:
Ribazole ức chế sự sinh trưởng và phát triển của protocorm, ở những nghiệm
thức có nồng độ càng cao thì sự ức chế này càng thể hiện rõ ràng.
Không chỉ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các protocorm mà ribazole
còn có thể gây chết mẫu, nồng độ ribazole càng cao thì tỉ lệ mẫu chết càng cao.
Ribazole có mức độ tác động lên ba giống địa lan là không giống nhau. Giống
Tím hột có hệ số nhân trong các nghiệm thức có ribazole giảm rõ rệt so với đối chứng
hơn hai giống còn lại. Ribazole gây tác động ức chế với mức độ khác nhau cho những
cây trồng khác nhau.
Điều này cũng đúng với một số kết quả của một số tác giả khác như: Đối với
cây khoai tây, nồng độ ribazole được sử dụng trong khoảng 20- 30 mg/l. Khi sử dụng
ribazole trên cây chuối thì nồng độ ribazole là 50 mg/ l nhưng khi sử dụng cho
Nicotiniana Rustica thì nồng độ ribazole lại cao hơn là 100 mg/ l môi trường nuôi cấy.
Trong khi đó đối với cây Oxalic Tuberosa Molina thì nồng độ ribazole tối ưu là 50
mg/l môi trường nuôi cấy (Zapta và cs 1995).
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm
của Tím hột
Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100 150
(1) (2) (3) (4) (5)
Tỉ lệ sống sót 100 91,6 77,8 55,5 50.0
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 3,4 0,9 0,6 0,4 0,2
Qua thí nghiệm đã tiến hành với ba giống địa lan chúng tôi thấy trong khi nồng
độ ribazole tăng dần thì hệ số nhân của từng giống có sự giảm với mức độ khác nhau
so với đối chứng.
Ở giống Tím hột ở nghiệm thức (2) đã cho thấy sự giảm hệ số nhân so với
nghiệm thức đối chứng là cao hơn hẳn so với hai giống Miretta xanh và Trắng bệt.
Ở thí nghiêm với giống Trắng bệt và Tím hột, nghiệm thức (4) và (5) cho hệ số
nhân trên tổng số mẫu ban đầu là âm, điều này cho thấy tổng số protocorm thu được

45
sau 80 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 100 mg/l; 150 mg/ l thì số protocorm thu
được thấp hơn tổng số mẫu ban đầu đưa vào.
Như vậy trong cả 3 giống thì ở hai nghiệm thức (2) và (3) có bổ sung ribazole
mà vẫn thu được số protocorm sau thí nghiệm nhiều hơn số protorme mẫu ban đầu.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm
của giống Miretta xanh.
Nồng độ 0 50 75 100 150
(mg/l) (1) (2) (3) (4) (5)
Tỉ lệ sống sót 100 97,2 94,4 77,7 33,3
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 3,3 2,6 1,9 0,2 0,1

46
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của ribazole tích luỹ lên sự sinh trưởng và
phát sinh protocorm mới của ba giống địa lan Tím hột, Trắng bệt và Miretta
xanh của Đà Lạt
Các mẫu protocorm sau khi đã qua môi trường đối chứng và môi trường có
ribazole với các nồng độ 50 mg/l, 75 mg/l, 100 mg/l trong 40 ngày được chuyển sang
môi trường hyponex cơ bản (môi trường sử dụng cho nghiệm thức đối chứng).
Để theo dõi sự ảnh hưởng của ribazole đã tích luỹ trong mẫu cấy lên sự sinh
trưởng và phát triển của các mẫu này trong lần cấy chuyền sang môi trường không
chứa ribazole lần thứ nhất.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Trắng bệt
Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100
(1) (2) (3) (4)
Tỉ lệ sống sót 100 100 100 100
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 1,9 3,6 3,8 4,7
Từ kết quả thu được ở thí nghiệm 2 sau 60 ngày theo dõi chúng tôi nhận thấy.
Các mẫu protocorm sống sót sau 60 được nuôi cấy trong môi trường có chứa ribazole
với các nồng độ 50 mg/l; 75 mg/l; 100 mg/l được chuyển qua môi trường không chứa
ribvirin thì 100 % mẫu sống sót.
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Tím hột
Nồng độ 0 50 75 100
Tỉ lệ sống sót 100 100 100 100
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 1,2 1,9 2,7 3,2
Trong lần cấy chuyền đầu tiên này, số lượng protocorm cũng như hệ số nhân của
các nghiệm thức (2), (3), (4) ở cả ba giống địa lan đều cao hơn so với nghiệm thức đối
chứng (1).
Tuy nhiên, các mẫu protocorm ở nghiệm thức đối chứng tuy có số lượng ít hơn
nhưng đều có kích thước lớn hơn hẳn các mẫu protocorm trong các nghiệm thức khác.
Những mẫu đã qua môi trường có ribazole với nồng độ 100 mg/l thì kích thước
nhỏ hơn các mẫu qua môi trường ribazole ở nồng độ 50 mg/l.
Bên cạnh đó mẫu đã qua môi trường có ribazole với nồng độ 100 mg/l và 75
mg/l thì không có màu xanh rõ ràng như các mẫu ở nghiệm thức đối chứng và các
mẫu qua môi trường ribazole ở nồng độ 50 mg/l.
Với giống Tím hột, ở thí nghiệm trước các mẫu trong môi trường có ribazole đã
giảm sự sinh trưởng rõ rệt so với nghiệm thức đối chứng hơn hai giống còn lại, thì ở
trong thí nghiệm 2 này hệ số nhân của các mẫu này cũng thấp hơn hẳn hai giống còn
lại. Qua thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy:

47
 Các mẫu sau khi qua môi trường có chứa ribazole thì ở lần cấy chuyền lần thứ
nhất này có sự khác biệt so với ở nghiệm thức đối chứng. Hay có sự tích luỹ ribazole
trong các mẫu đã qua ribazole.
Sự sinh trưởng của các mẫu có trong các nghiệm thức (2), (3), (4) cũng không
giống nhau. Tức là sự khác biệt về nồng độ ribazole trong thí nghiệm một đã ảnh
hưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của các mẫu này trong lần cấy chuyền thứ nhất.
Các mẫu ở nồng độ ribazole ở thí nghiệm một càng cao thì số lượng protocorm
mới phát sinh trong thí nghiệm hai càng tăng nhưng kích thước thì lại giảm so với đối
chứng.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Miretta xanh
Nồng độ (mg/l) 0 50 75 100
(1) (2) (3) (4)
Tỉ lệ sống sót 100 100 100 100
Hệ nhân (trên tổng mẫu) 1,7 1,9 2,2 2,6

Bảng 3.12. Sự sinh trưởng của cây con giống Trắng bệch sau khi xử lý
ribazole

Môi trường Số lá Dài lá (mm) Dài rễ (mm) Số rễ FrW (g)

MS 4.25 42.50 33.90 2.50 11.15
1/2MS 2.05 40.40 25.20 1.7 7.35
Knudson 2.10 50.05 28.75 2.45 10.20

Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con giống Tím hột sau khi xử lý ribazole

Môi trường Số lá Dài lá (mm) Dài rễ (mm) Số rễ FrW (g)

MS 3.83 37.35 28.40 2.90 10.25
1/2MS 2.80 40.40 10.50 1.15 7.15
Knudson 2.30 45.05 29.85 2.35 11.20

Bảng 3.14. Sự sinh trưởng của cây con giống Miretta xanh sau khi xử lý
ribazole
Môi trường Số lá Dài lá Dài rễ Số rễ FrW
(mm) (mm) (g)
MS 2.85 42.50 9.40 2.50 10.30
1/2MS 1.90 40.40 4.45 1.7 8.25
Knudson 2.25 50.05 6.45 2.45 10.00

48
3.4 Ảnh hưởng của các loại giá thể và EC ở giai đoạn vườn ươm
3.4.1 Nghiên cứu một số giá thể ở vườn ươm
Cây lan con ra rễ tốt trong điều kiện in vitro trên loại môi trường knudson C
bổ sung NAA 1 mg/l và than hoạt tính 1g/l môi trường, chúng tôi dùng để làm thí
nghiệm tiếp theo. Chúng tôi sử dụng 8 loại giá thể khác nhau làm thí nghiệm để tìm ra
loại giá thể thích hợp cho cây lan con.
Theo các nghiên cứu trước đây (2, 8, 53), Cymbidium sinh trưởng thích hợp
trên các giá thể có tính acid, thông thoáng và giữ được độ Nm cao. Giá thể thích hợp
để trồng lan thay đổi tuy theo loài và độ tuổi.
Nhiều báo cáo cho thấy hổn hợp vỏ cây nghiền nhỏ kết hợp 20 – 25% các loại
giá thể nhân tạo khác như perlite, than bùn thô, vỏ cây, vỏ bào đều được sử dụng
nhằm cải thiện độ thông thoáng và độ Nm trong giá thể. Vỏ cây nghiền nhỏ với kích
thước 0.25-0.5cm thường sử dụng để trồng lan con. Vỏ cây kích thước lớn hay các
loại giá thể quá thông thoáng đòi hỏi phải tưới nước thường xuyên để duy trì độ Nm,
trong lúc đó các loại giá thể quá mịn như bột xơ dừa, than bùn lại giữ nước quá lớn,
kém thông thoáng nên cây dễ bị thối rễ. Điều này cũng phù hợp với những kết quả
trên 7 loại giá thể đã đưa ra ở phương pháp thí nghiệm, cây con đều có khả năng sống
được nhưng tỉ lệ sống và khả năng sinh trưởng phát triển khác nhau (bảng 3.15).
Bảng 3.15. Tỉ lệ sống của cây lan Cymbidium sp. trêm các loại giá thể
khác nhau sau 3 tháng chuyển ra vườn ươm
Ký hiệu loại Loại giá thể Tỉ lệ sống % cây con
giá thể sống sót
I Dớn mút 65/70 92,85
II 3T 50/70 71.43
III 3T/dớn xay (1:1) 57/70 81.43
IV Xơ dừa 59/70 84.29
V Dớn xay/Xơ dừa (3/1) 53/70 75.71
VI Dớn xay/Xơ dừa (2/1) 63/70 90.00
VII Dớn xay/Xơ dừa (1/1) 56/70 80.00
VIII Dớn xay 52/70 74.29

Trên loại giá thể dớn xay, 3T có tỉ lệ sống của lan con là thấp nhất do loại giá
thể này không có chất dinh dưỡng cung cấp cho cây trồng ban đầu, đồng thời khả
năng giữ nước cũng kém hơn các loại giá thể phối trộn khác, cây sinh trưởng phát
triển kém. Ngược lại trên giá thể chỉ có bột xơ dừa cây có tỉ lệ chết cao, một phần do
độ thông thoáng của giá thể thấp, đồng thời khả năng giữ nước quá cao, gây hiện
tượng thối rễ.
Trên loại giá thể truyền thống đã dùng trước đấy là dớn mút cho kết quả tỉ lệ
sống cao nhất nhờ những tính chất vật lý vượt trội hơn các loại giá thể khác, loại giá
thể này giữ Nm tốt, có độ thoáng khí cao.

49
 Bên cạnh loại dớn mút, các loại giá thể phối trộn như 3T phối trộn xơ dừa tỉ lệ
1/1, dớn xay và xơ dừa tỉ lệ 2/1 và 1/1 cho tỉ lệ sống khá cao (trên 80%) nhờ cải thiện
được độ thông thoáng cũng như khả năng giữ Nm của nó.
Nếu tính hiệu quả kinh tế, việc sử dụng các công thức phối trộn 3T phối trộn
xơ dừa tỉ lệ 1/1, dớn xay và xơ dừa tỉ lệ 2/1 và 1/1 vẫn cho kết quả cao, các giá thể
này có thể thay thế dớn mút (loại giá thể hiện nay rất đắt và ngày càng khan hiếm) và
phù hợp với yêu cầu sinh trưởng của cây con lan con ở giai đoạn vườn ươm (bảng
3.15).
Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi đã sử dụng 3 loại giá thể (I, III và VI) để
tiếp tục theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lan con sau 12 tháng, kết quả thu
được ở các bảng 3.16; 3.17; 3.18.

Bảng 3.16. Sự sinh trưởng của cây con giống Trắng bệch trên 3 loại giá thể
khác nhau sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm
Môi trường Số lá Dài lá Dài rễ Số rễ FrW
(mm) (mm) (g)
I 3.83 37.35 28.40 2.90 10.25
III 2.80 40.40 10.50 1.15 7.15
VI 2.30 45.05 29.85 2.35 11.20

Bảng 3.17. Sự sinh trưởng của cây con giốngTím hột trên 3 loại giá thể khác
nhau sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm
Môi trường Số lá Cao Dài rễ Số rễ FrW
cây (mm) (g)
(mm)
I 4.25 42.50 33.90 2.50 11.15
III 2.05 40.40 25.20 1.7 7.35
VI 2.10 50.05 28.75 2.45 10.20

Bảng 3.18. Sự sinh trưởng của cây con giống Miretta xanh trên 3 loại giá thể
khác nhau sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm

Môi trường Số lá Dài lá Dài rễ Số rễ FrW

(mm) (mm) (g)
I 2.85 42.50 9.40 2.50 10.30
III 1.90 40.40 4.45 1.7 8.25
VI 2.25 50.05 6.45 2.45 10.00

Qua kết quả cho thấy, sự sinh trưởng, mức độ hình thành rễ thứ cấp, chiều dài lá
cũng như trọng lượng tươi ở các công thức giá thể không có sai khác đáng kể. Các
cây con sinh trưởng khá tốt trên các loại giá thể đã chọn để thực hiện nghiên cứu này.

50
3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EC lên giai đoạn đầu của cây ra rễ
Dựa vào kết quả nghiên cứu về loại giá thể nói trên, chúng tôi chọn một loại giá
thể đó là Dớn xay/Xơ dừa (2/1) để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất
dinh dưỡng nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của cây lan con
trong năm đầu sau khi ra vườn ươm.
Ảnh hưởng của nồng độ chất dinh dưỡng lên sinh trưởng của cây lan con được
đánh giá (Bảng 3.19).
Kết quả tốt nhất được ghi nhận ở chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi,
trọng lượng khô khi sử dụng nồng độ EC từ 1.0 -1.5 dS/m.
Rõ ràng trong giai đoạn cây con, nồng độ EC cao sẽ làm giảm sự phát triển của
cây và cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây trên các giống lan (15,27,42).
Nồng độ muối cao là nguyên nhân làm giảm sự sinh trưởng của cây mặc dù có
thể có những tác động liên quan khác làm ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng này.
Muối khoáng tích trữ lại trong nền cơ chất gây nên độ mặn thường xảy ra khi nồng độ
chất dinh dưỡng (EC) được cung cấp cao. Sự tích lũy này gây nên sự thiếu hụt nước ở
cây trồng do nó đã hạn chế khả năng hút nước của bộ rễ (33).
Cây trồng đã phản ứng lại liều lượng EC cao của chất dinh dưỡng bằng cách
giảm tốc độ hấp thu dinh dưỡng và nước, giảm tốc độ phát triển, giảm khả năng thNm
thấu của lá và diện tích lá (53, 54). Trong thí nghiệm của chúng tôi cũng có những kết
quả tương tự, qua khảo sát ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con (Tím hột)
trên các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng (mỗi tháng tưới dung dịch dinh dưỡng 2
lần) cho kết quả như sau ở các bảng 3.19; 3.20; 3.21.

51
 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giống Trắng bệch
trên các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng

EC Số lượng rễ sơ Số lượng rễ Chiều dài lá Trọng lượng

cấp thứ cấp trung bình tươi (g/cây)
(cm)
ĐC 5.1 ± 0.5 9.2 ± 0.7 13.2 ± 1.3 194.2 ± 13.3
0.5 6.2 ± 0.6 13.2 ± 1.3 15.7 ± 1.4 225.4 ± 12.6
1.0 6.4 ± 0.5 15.5 ± 1.5 16.6 ± 1.7 237.6 ± 11.7
1.5 6.1 ± 0.3 15.5 ± 1.2 15.3 ± 1.5 228.3 ± 12.5
2.0 6.0 ± 0.4 13.6 ± 0.9 14.3 ± 1.2 203.3 ± 11.6

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giốngTím hột trên
các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng

EC Số lượng rễ sơ Số lượng rễ Chiều dài lá Trọng lượng

cấp thứ cấp trung bình tươi (g/cây)
(cm)
ĐC 5.2 ± 0.7 10.2 ± 0.7 13.2 ± 1.3 190.2 ± 13.3
0.5 6.1 ± 0.5 15.2 ± 1.3 15.7 ± 1.4 221.4 ± 12.6
1.0 6.2 ± 0.3 15.3 ± 1.5 16.6 ± 1.7 235.6 ± 11.7
1.5 6.1 ± 0.3 15.8 ± 1.2 15.3 ± 1.5 227.1 ± 11.8
2.0 6.2 ± 0.3 14.8 ± 0.9 14.3 ± 1.2 200.4 ± 9.6

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giống Miretta
xanh trên các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng

EC Số lượng rễ sơ Số lượng rễ Chiều dài lá Trọng lượng

cấp thứ cấp trung bình tươi (g/cây)
(cm)
ĐC 5.0 ± 0.4 10.2 ± 0.9 12.4 ± 1.4 194.2 ± 13.3
0.5 6.2 ± 0.6 12.3 ± 1.1 14.6 ± 1.3 228.4 ± 12.6
1.0 6.4 ± 0.4 14.5 ± 1.3 16.5 ± 1.8 235.6 ± 11.7
1.5 6.1 ± 0.6 14.4 ± 0.9 15.8 ± 1.2 228.3 ± 10.5
2.0 6.2 ± 0.3 13.7 ± 0.8 14.3 ± 1.0 193.3 ± 10.6

52
Danh sách các giống địa lan (Cymbidium sp) đã được phục tráng và bảo tồn
Bảng 3.22.Các giống địa lan liệt kê sau đây đã được thu thập và phục tráng thành
công.
STT TÊN KHOA HỌC TÊN THƯƠNG MẠI
1 Cym. anita “ st. Helier” Hồng bệch
2 Cym. York “ever blooming” Liễu rũ
3 Cym. Bautista de auza”La Tullerie” Vàng da beo
4 Cym. Bengal Bay “ Golden hue” BGH
5 Cym. Sayonara “Rakitan” Vàng Ba Râu
6 Cym. Madrid “forest king” Xanh chiểu
7 Cym. Miretta “ cherob” Miretta xanh
8 Cym. Fanfare”st. Francis” Miretta xanh
9 Cym. Labell “anna belle” Tím hột
10 Cym. Featherhill “heritage” Đỏ bà mai
11 Cym Wallacia “Burnt Orange” Cam lửa
12 Cym. Mighty tracey “Moon walk” Trắng bệt
13 Cym. Paros paradise “haruka” Hồng úc
14 Cym. Enzan spring “in the mood” Hồng nhật

53
B. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC GIỐNG CÚC
3.5 Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro, đối với các
giống khác nhau
Sự có mặt của ribazole có tác dụng ức chế sự phân chia tế bào của virus, nó đã
hạn chế một lượng virus có trong mẫu cấy. Đồng thời nó cũng ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của cúc, trong quá trình nuôi cấy in-vitro.
Có thể nói, ribazole có ảnh hưởng độc hại đến cây in-vitro. Một số giống có
mức độ nhảy cảm với ribazole hầu hết bị chết ở nồng độ 100-150mg/l. Các giống có
khả năng thích nghi tốt hơn vẫn sống sót với một tỷ lệ nào đó.
Ribazole để lại nhiều dấu hiệu ảnh hưởng trên cây: sinh trưởng phát triển chậm,
khả năng phát sinh cụm chồi kém, lá và thân có biểu hiện bị ức chế: lá nhỏ, thân nhỏ,
chiều dài của đốt ngắn…Thời gian mà các dấu hiệu nảy thể hiện ra cũng khác nhau
tuỳ theo giống.
Giống pingpong vàng
Pingpong vàng là giống rất nhảy cảm với ribazole. 100% mẫu cấy ở lô nghiệm
thức R3 và R4 (có nồng độ 100 và 150mg/l) đều chết.
Trong những ngày của tuần đầu tiên, các mẫu cấy sinh trưởng và phát triển
như nhau, không có biểu hiện gì đặc biệt. Đến tuần thứ hai, sau khi hình thành được 2
lá ở lô thí nghiệm R3, và 3 – 4 lá ở lô R4 , chúng tôi nhận thấy các mẫu trong lô thí
nghiệm ngày có dấu hiệu ngừng sinh trưởng. Riêng ở lô thí nghệm R4, chồi ngọn có
biểu hiện như bị chết (thối hỏng) dần dần, bắt đầu xuất hiện ở tuần thứ ba.
Đối với lô nghiệm thức R1 và R2, trong hai tuần đầu, hầu hết các mẫu sinh
trưởng không khác biệt lớn so với lô đối chứng, chỉ có một vài mẫu có dấu hiệu
ngừng sinh trưởng, và có các dấu hiệu không thể sống sót nổi. Đến khoảng tuần thứ
ba, chúng tôi nhận thấy sự phát triển chậm lại so với lô đối chứng. Và một số mẫu bị
chết với triệu chứng như ở lô nghiệm thức R3 và R4. Tỷ lệ chết tăng theo nồng độ xử
lý. Các mẫu cấy trong lô nghiệm thức R1 và R2 mang đặc điểm của sự ức chế sinh
trưởng, như đã trình bày ở trên.
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống pingpong vàng
Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 3.15 2.89 2.45 0 0
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.19 0.84 0.33 0 0
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 72 44 0 0

54
Hình 3.1 Các cây giống pingpong vàng sau khi xử lý ribazole 30 ngày

Giống tia muỗng vàng

Đây là giống có khả năng chịu đựng tốt ribazole, hầu hết các mẫu cấy đều sống
sót (ở lô R4, tỷ lệ sống đạt đến 81%).
Trong thời gian đầu sau khi xử lý, ở các nghiệm thức, các cây phát triển khá
đều, ít thấy sự khác biệt, nhất là nghiệm thức R1, R2 so với R0. Ở hai nghiệm thức còn
lại, cây phát triển chậm hơn.
Đến tuần thứ hai, sự phát triển của cây trong các nghiệm thức có sự khác biệt
lớn: ở lô đối chứng R0 cây tiếp tục sinh trưởng tốt, còn các nghiệm thức cây gần như
ngừng sinh trưởng. Sự phát sinh cụm chồi ở các nghiệm thức diễn ra chậm dần và yếu
ớt. Các chồi sinh trưởng chậm, nên có chiều cao hạn chế. Do ảnh hưởng của ribazole,
lá ở các lô thí nghiệm nhỏ.
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống tia muỗng vàng
Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 4.51 2.70 2.52 2.41 1.9
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.16 1.04 0.74 0.57 0.43
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 100 100 81

55
 Hình 3.2 Các cây giống tia muỗng vàng sau xử lý ribazole 30 ngày

Giống farm hồng

Farm hồng cũng là giống chịu được ribazole ở nồng độ khá cao. Ở nồng độ
100mg/l, mà tỷ lệ sống vẫn đạt mức 100%. Đây có lẽ là ngưỡng của giống này. Vì ở
nồng độ 150mg/l, tỷ lệ sống giảm xuống còn 44%.
Khả năng phát sinh cụm chồi của giống farm hồng không mạnh so với giống
tia muỗng vàng. Dưới tác động của Ribazole, cụm chồi phát sinh trong giống farm
hồng thấp (2-3 chồi ở lô R1 và R2).
Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy chiều cao chồi vẫn được duy trì so với R0. Đối
với lá vẫn bị ức chế, khiến cho lá không phát triển.
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống farm hồng
Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 3.15 2.63 2.22 1.85 1.58
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.72 1.95 1.3 0.9 0.47
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 100 100 44

56
 Hình 3.3. Các cây giống tia farm hồng sau xử lý ribazole 30 ngày

Giống nút vàng

Chúng tôi nhận thấy ribazole ảnh hưởng mạnh đến chiều cao cây, trong khi
khả năng phát sinh cụm chồi của cây ít bị ảnh hưởng hơn. Ở nồng độ 50mg/l, hầu như
khả năng phát sinh cụm chồi không đổi, nhưng chiều cao giảm mạnh:từ 2.06cm ở lô
nghiệm thức R0 xuống chỉ còn 0.8 cm ở lô nghiệm thức R1.
Tuy khả năng phát sinh cụm chồi ít bị ảnh hưởng, nhưng chúng tôi nhận thấy
các chồi kém phát triển, biểu hiện qua chỉ tiêu về chiều cao, kích thước lá nhỏ, sinh
trưởng chậm…
Từ nồng độ 75mg/l, chúng tôi cũng thấy xuất hiện các cây bị chết do ảnh
hưởng của ribazole, và tăng dần ở nồng độ cao hơn.
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống nút vàng
Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 2.78 2.6 2.31 1.52 1.36
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.06 0.8 0.52 0.24 0.29
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 78 63 44

Hình 3.4. Các cây giống nút vàng sau xử lý ribazole 30 ngày

57
Giống nút tím

Đây là giống khá nhảy cảm với ribazole so với các giống trong đợt thí nghiệm
này. Chỉ ở nồng độ 75mg/l đã bắt đầu có những cây bị chết. những cây bị chết này chỉ
sau 1-2 tuần nuôi cấy.
Ngay cả ở lô thí nghiệm R1, chúng tôi đã thấy dấu hiệu ảnh hưởng của ribazole
từ rất sớm, ngay tuần đầu tiên khá rõ rệt. Những dấu hiệu đó là: sinh trưởng chậm, lá
nhỏ. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy rằng ảnh hưởng của ribazole không mạnh lắm
đến quá trình phát sinh cụm chồi của cây (trung bình 3.48 chồi ở lô R0 , và 2.85 ở lô
R1).
Chiều cao của chồi cũng bị ảnh hưởng khá lớn, ở lô nghiệm thức R1, chiều cao
chỉ bằng một nữa so với chiều cao cây ở lô đối chứng.
Cũng chính vì sự nhảy cảm với ribazole, nên ở giống này, chúng tôi nhận thấy
được những dấu hiệu ảnh hưởng rất rõ ràng của ribazole, về sự ức chế đến quá trình
sinh trưởng của cây.
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống nút tím
Lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 3.48 2.85 2.27 1.95 0
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.46 1.03 0.68 0.36 0
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 96 74 0

Hình 3.5. Ảnh hưởng của Ribazole đối với giống nút tím

3.6 Sự phục hồi của cây sau khi xử lý ribazole

Sau khi xử lý ribazole, các cây con sinh trưởng sau thời gian một tháng sẽ
được cấy chuyền trở lại trong môi trường nhân nhanh bình thường. Mục đích giai
đoạn này là nhân nhanh các cây đã được xử lý và giúp cây phục hồi khả năng sinh
trưởng. Lúc này, ribazole vẫn còn tồn dư trong cây, nên cũng còn ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng và phát triển của cây. Sự ảnh hưởng này tuỳ theo lượng tồn dư (phụ thuộc
vào nồng độ xử lý) và tính nhảy cảm của mỗi giống với ribazole.

58
Giống tia muỗng vàng
Giống này chịu đựng khá tốt với Ribazole, cũng có nghĩa là ít chịu ảnh hưởng
của Ribazole, do đó, khi cấy chuyền trở lại, khả năng phục hồi của cây trong các
nghiệm thức khá tốt. Chúng tôi nhận thấy rằng sự phát triển của cây gần như là đồng
đều nhau.
Bảng phân tích ANOVA cũng cho ta thấy được điều đó: sự khác biệt giữa các
nghiệm thức là không có ý nghĩa (đối với bảng phân tích chiều cao chồi, F tính là
0.0125; F bảng ở mức ý nghĩa 95% là 2.39). Sự khác biệt về sự phát sinh của cụm
chồi cũng tương tự, số lượng chồi trung bình trong các nghiệm thức khác biệt nhau
một cách không có ý nghĩa. (bảng phân tích ANOVA – Phụ lục).
Bảng 3.28. Sự sinh trưởng của các cây giống tia muỗng vàng trong môi
trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Từ lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3 R4
Số chồi trung bình/cụm 4.41 4.04 3.96 3.74 3.55
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.25 2.25 2.24 2.45 2.23
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 100 100 100

Hình 3.6: Các cây giống tia muỗng vàng 30 ngày sau khi cấy trở lại trong
môi trường nhân nhanh

Giống farm hồng

Do là giống chịu khá trước ảnh hưởng của ribazole, nên khi cấy chuyền trở lại
trong môi trường nhân nhanh, sự có mặt của một lượng nhỏ ribazole tồn dư trong
mẫu chỉ tác động rất nhỏ đến sự sinh trưởng của cây.
Chúng tôi chú ý theo dõi quan sát sự sinh trưởng của các cây trong quá trình
nuôi cấy, và nhận thấy sự sinh trưởng khá đều về sự phát sinh cụm chồi cũng như về
chiều cao của chồi.
Ngoài ra, từ những kết quả phân tích số liệu cho thấy sự khác nhau giữa các
nghiệm thức là không có ý nghĩa.

59
 Bảng 3.29. Sự sinh trưởng của các cây giống farm hồng trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Từ lô nghiệm thức R0 R1 R2 R3
Số chồi trung bình/cụm 3.22 3.15 3.11 3.07
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.62 2.57 2.48 2.46
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 100 100
Giống pingpong vàng

Các cây trong giống pingpong vàng chịu những tác động khá lớn của ribazole
trong quá trình xử lý, nhưng khi cấy chuyền trở lại, các cây đã nhanh chóng phục hồi
sự sinh trưởng và phát triển.
Chúng tôi quan sát thấy trong tuần đầu, các mẫu ở lô R1 và đặc biệt ở lô
nghiệm thức R2 phát triển tương đối chậm so với các mẫu ở lô đối chứng. Điều này
được lý giải là do ảnh hưởng của ribazole trong mẫu vẫn còn tác động ức chế lên mẫu,
nên một thời gian, cây mới phục hồi trở lại được.
Bảng 3.30. Sự sinh trưởng của các cây giống pingpong vàng trong môi
trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Từ lô nghiệm thức R0 R1 R2
Số chồi trung bình/cụm 3.74 3.74 3.66
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.17 2.09 2.01
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100 100

Hình 3.7. Giống pingpong vàng ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy
trong môi trường nhân nhanh
Giống nút vàng
Vì một số điều kiện, chúng tôi chỉ cấy chuyền lại các cây ở lô nghiệm thức R2
và lô đối chứng R0.
Trong quá trình xử lý ribazole, giống nút vàng bị ức chế mạnh về sự phát triển
chiều cao của chồi. Chúng tôi tạm cho rằng ribazole ảnh hưởng mạnh đến sự phát
triển về chiều cao của chồi. Tuy nhiên, kết quả thu được từ thí nghiệm này đã cho ta
thấy sự phục hồi khá tốt về yếu tố chiều cao của chồi.

60
 Chúng tôi cũng quan sát thấy các cây ở lô R2 vẫn còn bị ức chế trong thời gian
đầu nuôi cấy, nhưng rồi cũng phát triển gần bằng với các cây ở lô đối chứng.

Bảng 3.31. Sự sinh trưởng của các cây giông nút vàng trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 này nuôi cấy
Từ lô nghiệm thức R0 R2
Số chồi trung bình/cụm 2.81 2.67
Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.05 2.03
Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100

Hình 3.8 Giống nút vàng ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy trong
môi trường nhân nhanh
Giống nút tím

Cũng do một số điều kiện chúng tôi chỉ nuôi cấy được các cây trong hai lô
nghiệm thức R2 và lô nghiệm thức đối chứng.
Giống nút tím là giống chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi tác động của ribazole.
Chính vì thế, quá trình phục hồi của cây trong môi trường nhân nhanh là khá chậm.
Do đó, các cây ở nghiệm thức R2 phát triển chậm hơn khá rõ rệt so với cây ở lô đối
chứng.
Bảng 3.32. Sự sinh trưởng của các cây nút tím trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Từ lô nghiệm thức R0 R2

Số chồi trung bình/cụm 3.63 3.37

Chiều cao trung bình của chồi(cm) 2.46 2.06

Tỷ lệ sống của chồi(%) 100 100

61
 Hình 3.9 Giống nút tím ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy trong môi
trường nhân nhanh

3.2.1 Giống tuapin hồng

Giống này có khả nãng chịu đựng khá tốt với ribazole, do đó khi cấy chuyền
trở lại khả nãng phục hồi của cây khá tốt.
Ở lô nghiệm thức R1 va R2 (nồng độ 50 và 75 mg/l) 100% cây sống sót.
Chúng tôi nhận thấy rằng sự phát triển của cây gần nhý là đồng đều nhau ở hai
chỉ tiêu chiều cao trung bình của chồi và số chồi trung bình/cụm.Tuy nhiên ở lô
nghiệm thức R3 có hiện týợng mẫu bị chết và sự phát triển của cây không đồng đều.

Bảng 3.33. Sự sinh trưởng của các cây giống tuapin hồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(%)
chồi(cm)
R1 3.5a 4.6a 100
R2 3.4a 4.0a 100
R3 1.8b 2.0b 89
CV% 13.86 13.58
LSD0,05 0.61 0.73

62
 Hình 3.10. Các cây giống tuapin hồng sau xử lý ribazole 60 ngày
3.2.2 Giống nút nghệ:
Là giống có khả nãng chống chịu tốt, cũng có nghĩa nút nghệ là giống ít chịu
ảnh hưởng của ribazole. Ở các nồng độ, các mẫu đều sống với tỷ lệ 100%. Nhýng sự
phát triển của cây không được đồng đều, thể hiện ở bảng số liệu về chỉ tiêu số chồi
trung bình/cụm, chiều cao trung bình của chồi.
Bảng 3.34. Sự sinh trưởng của các cây giống nút nghệ trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy.
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.9b 6.5a 100
R2 1.9b 7.1a 100
R3 2.4a 3.1b 100
CV% 9.61 7.46
LSD0,05 0.29 0.62

Hình 3.11. Các cây giống nút nghệ sau khi xử lý ribazole 60 ngày

63
3.2.3 Giống tiger đồng

Tỷ lệ sống của các cây trong giống tiger đồng là 100% ở lô nghiệm thứ R1 và
R2. Và chết nhiều ở nghiệm thức R3.
Ở nồng độ ribazole cao các cây giống tiger đồng chịu ảnh hưởng khá lớn. Các
cây sinh trưởng và phát triển không đồng đều.
Bảng 3.35. Sự sinh trưởng của cây giống tiger đồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.3b 4.6b 100
R2 1.9a 7.1a 100
R3 0.3c 1.0c 16
CV% 25.34 19.42
LSD0,05 0.45 1.24

Hình 3.12. Các cây giống tiger đồng sau khi xử lý Ribazole 60 ngày
3.2.4 Giống pha lê xanh

Giống này khá nhạy cảm với ribazole, các mẫu cấy có tỷ lệ sống sót không cao
ở các nồng độ. Cây sinh trưởng và phát triển không đồng đều.
Chúng tôi quan sát thấy rằng các mẫu cấy ở các lô nghiệm thức phát triển
tương đối chậm. Điều này được lý giải là do ảnh hưởng của ribazole trong mẫu vẫn
còn ức chế lên mẫu, nên một thời gian cây mới phục hồi trở lại được .

64
Bảng 3.36. Sự sinh trýởng của các cây giống pha lê xanh trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.2a 5.9a 95
R2 0.9a 3.3b 79
R3 0.8a 3.5b 74
CV% 39.74 32.03
LSD0,05 0.60 2.02

Hình 3.13. Các cây giống pha lê xanh sau khi xử lý ribazole 60 ngày

3.2.5 Giống pha lê cam

Trong quá trình xử lý ribazole, giống pha lê cam bị ức chế mạnh về sự phát
sinh chồi. Tỷ lệ sống của mãu không cao.
Chúng tôi quan sát và nhận thấy rằng cây giống pha lê cam phục hồi trong thời
gian khá nhanh.

65
 Bảng 3.37. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê cam trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.1b 4.8a 89
R2 2.1a 3.2b 84
R3 1.3b 4.6ab 95
CV% 23.72 23.64
LSD0,05 0.53 1.50

Hình 3.14. Các cây giống pha lê cam sau khi xử lý ribazole 60 ngày

Giống tuapin hồng

Các cây giống Tua pin hồng có số chồi trung bình/cụm thấp và khá đồng đều
nhau. Tuy nhiên chiều cao của chồi lại chênh lệnh nhau, có những mẫu phát triển khá
cao.
Bảng 3.38. Sự sinh trưởng của cây giống tuapin hồng trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.4a 7.6a 100
R2 1.6a 2.6c 100
R3 1.2a 4.6b 100
CV% 22.45 9.72
LSD0,05 0.47 0.72

66
Giống nút nghệ
Là giống chịu đựng tốt ở các nồng độ ribazole. Nên khi cấy chuyền lại vào môi
trường nhân nhanh thì lýợng ribazole tồn dý trong cây ít, không còn đủ để ảnh hưởng
đến cây. Các cây sinh trýởng và phát triển khá đồng đều nhau. Và tỷ lệ sống vẫn đạt
mức 100%.
Bảng 3.39. Sự sinh trưởng của cây giống nút nghệ trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.3a 3.5b 100
R2 1.4a 5.2a 100
R3 1.5a 5.1a 100
CV% 26.84 5.50
LSD0,05 0.56 0.38

Giống tiger đồng

Các mẫu cấy trong các nghiệm thức sinh trýởng và phát triển bình thýờng. Cây
khỏe mạnh và đồng đều nhau về các chỉ tiêu số chồi trung bình và chiều cao trung
bình.
Bảng 3.40. Sự sinh trưởng của cây giống tiger đồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.6a 4.2a 100
R2 1.7a 4.3a 100
R3 1.4a 4.2a 100
CV% 18.58 14.20
LSD0,05 0.44 0.90

67
 Giống pha lê xanh

Pha lê xanh là giống cũng chịu được ribazole ở nồng độ khá cao. Khả nãng phát
sinh chồi cụm không mạnh.
Bảng 3.41. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê xanh trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo.
Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.8a 2.8a 100
R2 1.9a 3.1a 100
R3 1.3b 2.8a 100
CV% 13.55 8.25
LSD0,05 0.35 0.36

Giống pha lê cam

Cây giống pha lê cam có độ nhạy cảm khá cao với ribazole. Khi đem cấy
chuyền lại thì cây có các chỉ tiêu về số chồi trung bình và chiều cao trung bình của
chồi thấp.
Bảng 3.42. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê cam trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo
Nghiệm thức Số chồi trung Chiều cao trung Tỷ lệ sống của
bình/cụm bình của chồi(cm) chồi(%)
R1 1.3a 4.0a 100
R2 1.3a 4.0a 100
R3 1.4a 4.3a 100
CV% 24.60 7.48
LSD0,05 0.50 0.50

68
C. Thí nghiệm thử nghiệm Test ELISA một số giống hiện đang sản xuất và một
số giống đã qua phục tráng
Sau khi test ELISA các mẫu trên, chúng tôi tính toán số liệu và so sánh với các
chứng (+) và chứng (-), chứng trắng, nước cất đã thu được những kết quả sau
Đợt 1
Kết quả test TMV trên một số giống cúc có triệu chứng bệnh virus. Sau thời
gian tính toán và phân tích chúng tôi có được bảng sau:
Hoa cúc

Bảng 3.43: Kết quả test ELISA ở các giống cúc

Kết quả
STT Tên đối tượng Nguồn test
lần 1
1 Cúc nút, lá bệnh Mẫu lá bệnh +
2 Cúc đại đóa Mẫu lá bệnh +
3 Cúc thọ vàng Mẫu lá bệnh -
4 Cúc vàng Mẫu lá bệnh -
5 Cúc pha lê, mẫu lá thường Mẫu lá bệnh +
6 Cúc vàng chưa ra hoa, lá bệnh Mẫu lá ngẫu nhiên -
* Mẫu (+): lá bị bệnh * Mẫu (-): Lá không bị bệnh
Từ bảng trên, ta thấy đã có dấu hiệu dương tính với virus ở một số cây cúc
(cúc nút và cúc đại đóa). Mà nguồn cúc kiểm tra lấy từ khu vực NTL, nên khả năng
lây nhiễm là rất lớn sang những giống chưa có bị nhiễm bệnh như cúc vàng. Cúc pha
lê bắt đầu có giấu hiệu nghi nhiễm.
Hoa lan
Bảng 3.44. Kết quả test ELISA ở các giống lan
Nguồn Kết quả
Stt Tên đối tượng khảo sát
test lần 1
1 Lan tím nghĩa, 383 NTL Lá bệnh -
2 Lan tuyết ngọc xanh 382B, NTL Lá bệnh +
3 Trắng bệch 397/57 NTL Lá bệnh +
4 Trắng Bà Rịa, 397/57 NTL Lá bệnh -
5 Miretta xanh, 387 NTL Lá bệnh -
6 Tím hột, 382 B NTL Lá bệnh +
7 Tím hột 396 Võ Trường Toản Lá bệnh -
8 Lan vầng trăng, 403/57 NTL Lá bệnh -
 9 Cam lửa, 403/57 NTL Lá bệnh +
10 Tím hột 397/57 NTL Lá bệnh +
11 Trắng bệch 382B NTL Lá bệnh +
12 Trắng bệch, 396 Võ Trường Toản Lá bệnh -
13 Tím hột, 383 NTL Lá bệnh -

Đối với hoa lan, tình hình nhiễm bệnh nhiều, sau hai lần test những giống lan
bị nhiễm bệnh và nghi nhiễm chiếm 62%, đây là một tỉ lệ khá cao.
Các giống lan không nhiễm bệnh cùng nằm trong khu vực của các giống lan bị
bệnh, nên khả năng bị nhiễm virus là rất cao.
Cần phải có các hình thức test lại các giống lan hiện đang sản xuất tại các cơ
sở để có các hình thức bảo vệ ban đầu thích hợp.

Đợt 2: Khảo sát một số mẫu cây sau khi đã tách và xử lý mẫu để phục tráng lại
giống
Bảng3.45. Kết quả test đợt 2 của 2 giống cúc và lan
Nguồn Kết quả
Stt Tên đối tượng khảo sát
test lần 1

Hoa cúc

1 Cúc nút Lá -

2 Cúc đại đóa Lá -

3 Cúc thọ vàng Lá -

4 Cúc pha lê Lá -

5 Tiger đồng Lá -

Hoa lan

6 Trắng bệch Lá -

7 Tím hột Lá -

8 Miretta xanh Lá -

9 Lan vầng trăng Lá -

70
 10 Cam lửa Lá -

11 Bay Golden Hill (BGH) Lá -

12 Xanh chiểu Lá -

Các mẫu hoa lan và hoa cúc trong PTN sau khi được sử lý tách virus không có
trường hợp nào test có nhiễm virus rõ ràng. Tuy nhiên kết quả này cũng chưa đánh
giá đúng hoàn toàn vì còn nhiều nghuyên nhân khác anh hưởng đế kết quả trên.
Bảng 3.46. Danh sách các giống cúc cắt cành có giá trị đã được phục tráng
và bảo tồn
STT Tên giống STT Tên giống
1 Nút tím 28 Saphia nghệ
2 Nút vàng 29 Caraven
3 Farm tím 30 Farm trắng
4 Tia muỗng vàng 31 Thọ đỏ mới
5 Pingpong vàng 32 Thọ vàng nghệ
6 Thọ xanh 33 Thọ vàng chanh
7 Tia muỗng hồng 34 Thọ vàng nhị xanh
8 Đoá trắng 35 Phalê trắng
9 Đoá đồng 36 Phalê cam
10 Đóa hồng 37 Phalê xanh(tua xanh)
11 Farm vàng 38 Vàng óng
12 Thọ vàng 39 Tia trắng
13 Thọ tím 40 Tia đồng
14 Pha lê 41 Tia muỗng vàng tươi
15 Tím huế 42 Tia muỗng trắng
16 Pingpong trắng 43 Tia muỗng tím
17 Nút tím 44 Mai xanh
18 Tiger đồng 45 Mai đỏ
19 Đoá vàng 46 Mai vàng
20 Lys 47 Ngọc bích hồng
21 Lisa trắng 48 Ngọc bích vàng
22 Nút nghệ 49 Indo cam
23 Nút trắng 50 Indo hồng
24 Tison 51 Nữ hoàng đỏ
25 Tuabin hồng 52 Nữ hoàng tím
26 Đỏ nhí 53 Nữ hoàng vàng
27 Saphia vàng 54 Nữ hoàng hồng trắng

71
 Qui trình đề nghị sử dụng trong nhân giống địa lan
Qui trình nhân giống địa lan sạch bệnh hiện nay đã trở thành phổ biến với những
thành công nhất định và không sai khác nhau nhiều tại nhiều phòng thí nghiệm nhân
giống. Trong đó việc áp dụng biện pháp bổ trợ trong việc loại bỏ virus của địa lan
thường chỉ sử dụng xử lý nhiệt. Trong điều kiện Việt Nam, chưa thấy có tài liệu sử
dụng hóa chất bổ trợ, vì vậy trong qui trình này, nét khác biệt là áp dụng hóa chất
(ribazole) trong việc tạo cây con sạch bệnh.

Đỉnh chồi (1) Đỉnh sinh trưởng (2) Tạo thể protocorme (3)

Tạo cụm chồi (4)

Tách chồi (5)

Trồng lan con

Cây trưởng thành (8) trong vĩ xốp (7) Cây con (6)

Qui trình nhân giống in vitro cây Địa Lan

(1) Lấy chồi từ cây lan trưởng thành (Khử trùng theo phương pháp thường qui và
vào mẫu trong môi trường MS + 0.1mg/l BA + 1gAC + 75mg virazole), khi
mẫu đã phục hồi có thể xử lý nhiệt độ tăng dần từ 25 đến 37oC và giữ ở nhiệt
độ này trong vòng 3-5 tuần.
(2) Tách lại mô phân sinh (0,25-0,5mm) và cấy lại vào môi trường ở bước 1
không có virazole.
(3) Và (4) Protocorm hình thành trong bước (2) tiếp tục cấy chuyền sang môi
trường mới (3 tháng/lần)
(4) Cấy chuyền tiếp tục để tăng số lượng protocorm cũng như chồi cây.
(5) Tách các chồi từ cụm chồi cấy sang môi trường Knudson C + 0,5-1mg/l BA +
0,5-1mg/l NAA + 1mg AC.
(6) Bước chuyển cây con ra vườn ươm – mở nắp bình cấy và để trong điều kiện
vườn ươm từ 5-7 ngày để cây thích nghi với điều kiện tự nhiên.
(7) Trồng cây con vào khay hay vĩ xốp
Sử dụng giá thể là dớn mút hay dớn xay + xơ dừa (1:1), xử lý qua thuốc diệt
nấm (Mancozeb) và sau đó ngâm vào nước sau đó mới cho giá thể vào khay
hay vĩ. Rút cây con ra khỏi bình cây, rửa nhẹ nhàng qua nước máy để loại bỏ
thạch khỏi rễ, sau đó trồng vào khay với mật độ 5×5cm.
Để khay cây con trong điều kiện độ Nm cao (≥ 90%), che sáng (≥ 70%) và
phun sương đều từ 3-4 lần mỗi ngày.

72
QUI TRÌNH CHUYỂN CÂY LAN CON IN VITRO RA VƯỜN ƯƠM
Cây con sau khi rút khỏi môi trường in vitro cần rửa sạch agar bám vào rễ, nhúng rễ
cây con với Mancozeb rồi mới trồng vào giá thể.
Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm
Giá thể: Dớn mút; 3T/dớn xay (1:1) hoặc Dớn xay/Xơ dừa (2/1).
Số lượng cây con/ khay: 100 cây
Độ Nm giá thể: 70 – 80%
Độ Nm không khí: 90 – 95%
Nhiệt độ nuôi trồng: 20-25oC
Ánh sáng: Độ che sáng > 70%
Số lần tưới/ngày: 3-5 lần
Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha loãng có EC = 1,0ds/m phun mỗi tuần 2 lần (trừ tuần
đầu tiên sau khi mới ra cây
Phòng trừ sâu bệnh hại lan: Nhện: Kasuarane (mỗi tuần phun 1 lần)
Nấm: Mancozeb (mỗi tuần phun 1 lần)
Sâu xanh: Semi-alpha (mỗi tuần phun 1 lần)

73
 Qui trình đề nghị sử dụng trong nhân giống cúc
Qui trình nhân giống cúc sạch bệnh hiện nay đã trở thành phổ biến với những
thành công nhất định và không sai khác nhau nhiều tại nhiều phòng thí nghiệm nhân
giống. Trong đó việc áp dụng biện pháp bổ trợ trong việc loại bỏ virus của cúc
thường chỉ sử dụng xử lý nhiệt. Trong điều kiện Việt Nam, chưa thấy có tài liệu sử
dụng hóa chất bổ trợ, vì vậy trong qui trình này, nét khác biệt là áp dụng hóa chất
(ribazole) trong việc tạo cây con sạch bệnh.

Đỉnh chồi
Đế hoa (1) Đỉnh sinh trưởng (2)

Tạo cây con (3) Cấy chuyền (4)

Trồng cây con

Cây trưởng thành (7) trong vĩ xốp (6) Cây con (5)

Qui trình nhân giống in vitro cây Cúc

(1) Lấy chồi từ cây cúc trưởng thành hoặc đế hoa (Khử trùng theo phương pháp
thường qui và vào mẫu trong môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA + 50-
75mg virazole), khi mẫu đã phục hồi có thể xử lý nhiệt độ tăng dần từ 25 đến
37oC và giữ ở nhiệt độ này trong vòng 3-4 tuần.
(2) Tách lại mô phân sinh (0,25-0,5mm) và cấy lại vào môi trường ở bước 1
không có virazole.
(3) Cây con hình thành trong bước (2) tiếp tục cấy chuyền sang môi trường mới
(mỗi tháng/lần)
(4) Cấy chuyền tiếp tục trong môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA để tăng
số lượng cây con in vitro.
(5) Tách các đốt từ cây con cấy sang môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA
khoảng 1 tuần trước khi đưa cây con ra vườn ươm.
(6) Trồng cây con vào khay hay vĩ xốp
Sử dụng giá thể là peatmoss, xử lý qua thuốc diệt nấm (Mancozeb) cho giá thể
vào khay hay vĩ. Rút cây con ra khỏi bình cây, rửa nhẹ nhàng qua nước máy để
loại bỏ thạch khỏi rễ, sau đó trồng vào khay với mật độ 3×3cm.
Để khay cây con trong điều kiện độ Nm cao (≥ 90%) trong 3 – 5 ngày, che sáng
(≥ 70%) và phun sương đều từ 3-4 lần mỗi ngày.

74
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHN

1. KẾT LUẬN:
- Các giống lan cắt cành hiện nay tại Đà Lạt có khoảng 38 giống, trong đó có
khoảng 14 giống có giá trị và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng.
- Các giống cúc cắt cành nhập vào Đà Lạt có trên 70 giống, tuy nhiên nhiều
giống đã bị lãng quên. Qua điều tra và thu thập chỉ còn khoảng 54 giống và trong số
đó chỉ có một số giống hiện đang được sản xuất với số lượng lớn là: Cúc nút, cúc đại
đóa, thọ vàng, pha lê, cúc vàng, tuapin hoàng, nuùt ngheä, tiger ñoàng, pha leâ xanh, pha
leâ cam.
Các thí nghiệm khảo sát môi trường nhân giống lan cho thấy, môi trường MS
+ 1 g/l than + 1 ml/l BA + 1ml/l NAA thì chúng tôi thấy sự phát triển của các chồi đi
theo chiều hướng rất thuận lợi, tạo ra một lượng protocorm cũng rất nhiều.
- Ribazole gây ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trong điều
kiện nuôi cấy in-vitro. Cây sinh trưởng kém, chiều cao của chồi nhỏ, lá kém phát triển.
Và ở nồng độ cao hơn dẫn đến cây bị chết.
- Sự ức chế gây ra bởi ribazole lên cây cúc theo các mức độ khác nhau, tùy
theo giống khác nhau. Nồng độ xử lý ribazole tương đối thích hợp đối với năm giống
cúc trong thí nghiệm này là trong khoảng 75-100mg/l.
- Cây con cả các giống lan cũng như các giống cúc trong nghiên cứu này sau
khi qua xử lý ribazole kết hợp việc tách đỉnh sinh trưởng đã cho kết quả tốt.
2. KIẾN NGHN:
- Tiếp tục kiểm tra các giống cúc và lan khác.
- Ngoài virus TMV, ta cần phải test các loại virus khác gây hại cho cúc và hoa.
- Nhà nước cần có sự hổ trợ kinh phí hàng năm để duy trì và bảo tồn các giống
hoa cắt cành của Đà Lạt, đây là một nguồn giống có giá trị trong việc phát triển nền
nông nghiệp rau hoa của Tỉnh nhà nói riêng và trong cả nước nói chung

75
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Võ Văn Chi và Dương Tiến Đức, 1978. Phân loại thực vật (thực vật bậc
cao). Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp.
2. Nguyễn Duy Hạng và Cs., 2006. Nghiên cứu sản xuất giá thể tổng hợp
phục vụ trồng hoa lan và các loại hoa cảnh có giá trị kinh tế tại Lâm Đồng.
Thuộc dự án sản sản xuất thử nghiệm. Sở Khoa học Công Nghệ Lâm Đồng.
3. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại học
Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
4. Trần Hợp, 1993. Cây hoa cảnh Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
5. Trần Văn Minh, 1997. Công nghệ tế bào thực vật. Giáo trình cao học. Viện
sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh.
6. Hoàng Thị Sản và Phan Nguyên Hồng, 1986. Thực vật học phần phân loại.
Nhà xuất bản Giáo dục.
7. Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông, 2002. Cây hoa cúc và kỹ thuật
trồng, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
8. Đoàn Huy Tràng và Cs., 2008. Nghiên cứu sản xuất giá thể trồng địa lan đa
thành phần theo công nghệ nhiệt hóa lò quay. Sở Khoa học Công Nghệ
Lâm Đồng.
9. Nguyễn Văn Uyển, 1999. Các chất sinh trưởng trong nông nghiệp. Nhà
xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh.
10. Nguyễn Văn Uyển và cs., 1984. Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác
giống cây trồng. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh.
11. Vũ Văn Vụ và cs., 2003. Sinh lý học thực vật. Nhà xuất bản giáo dục.
12. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thực vật ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
13. Arditti, J., 1992. Fundamentals of Orchid Biology. John Wiley & Sons,
Canada.
14. Arditti, J. and R. Ernst, 1993. Micropropagation of orchids. John Wiley &
Sons, Canada, pp. 467-520.
15. Belitsky, I. and V.N.A. Bersenev, 1999. Jewel Orchids. In: Orchids.
Magazine Am. Orcchid Soc. pp. 33-37.
16. Bhojwani, S.S. and M.K. Razdan, 1996. Plant tissue culture: Theory and
practice, a revised edition. Elsevier Science B.V. The Netherlands.
17. Boase MR, Miller R, Deroles SC. 1997. Chrysanthemum systematics,
genetics, and breeding. In : Jamick J, editor. Plant breeding reviews, vol 14.
New York: Wiley; p. 321-61.
18. Plants through Tissue Culture. Hughes, K.W., Henker, R. and Constantin, M.
(Eds.). Conf. 7804111. Technical Inf. Center, U.S. Dep. Energy, Springfield,
VA p. 44-58.
19. Cieslinska M., 2002. Elimination of apple chlorotic leaf spot virus (aclsv)
from pear by in vitro thermotherapy and chemotherapy. Electronic Jounal of
Biotechnology Vol.1 No.3, p. 343-350.
20. Cockshull, K., 1985. Chrysanthemun morifolium. In: HALEVY, A.H. CRC
handbook of flowering. Boca Raton: CRC Press, v.2, p. 238-257.
21. D'Angelo, G. and P. Titone. 1988. Determination of the water and air
capacity of 25 substrates employed for the cultivation of Dieffenbachia
amoena and Euphorbia pulcherrima. Acta Hort. 221:175-182.
22. Ernst, R., 1974. The use of activated charcoal in asymbiotic seedling culture
of Paphiopedilum. Am. Orhid Soc. Bull. 43:35-38.
23. Evans, M.R. and H.S. Robert, 1996. Growth of bedding plants in sphagnum
peat and coir dust-based substrates. J. Env. Hort. 14:187-190.
24. Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe, and I. K. Vasil, 1976. Plant
tissue culture media. In Vitro 12:473–8.
25. George, E.F. and P.D. Sherrington, 1984. In: Plant Propagation by Tissue
Culture. Exegetics Ltd., Eversley, England, pp. 324-366.
26. Gisler¢d, H.R., L.M. Mortensen, and A.R. Selmer-Olsen, 1986. The effect of
air humidity on growth and nutrient content of some greenhouse plants. Acta
Hort. 178:181-184.
27. Heo, J.W., C. Kubota, and T. Kozai, 1996. Effect of CO2 concentration,
PPFD and sucrose concentration on Cymbidium plantlet growth in vitro. Acta
Hort. 440: 560-565.
28. Jaime A. Teixeira da Silva, 2003. Chrysanthemum: advances in tissue culture,
cryopreservation, postharvest technology, genetics and transgenic
biotechnology, biotechnology advances 21: 715-766.
29. Jones, E.D. and Mullin, J.M. 1974. The effect of potato virus X on
susceptibility of potato tubers to Fusarium roseum “Avenaceum”. Am.
Potato J.51: 209-251.
30. Kassanis B. 1949. Potato tubers freed from leaf roll virus by heat. Nature
164:881.
31. Kenneth L. Brown, Janette M. Hakimi, Debra M. Nuss, Yolanda D.
Montejano, and Donald W. Jacobsen, 1983. Acid-Base Properties of α-
Ribazole and the thermodynamics of Dimethylbenzimidazole Association in
Alkylcobalamibs, Inorg. Chem. 1984, 23, 1463-1471.
32. Kano, K., 1965. Studies on the media for orchid seed germination. Mem. Fac.
Agric. Kagawa University 20:1-68.

77
33. Ket, N. V, E., J. Hahn, S. Y. Park, D. Chakrabarty and K. Y. Paek., 2004.
Micropropagation of an endangered orchid Anoectochilus formosanus.
Biologia Plantarum 48.,3: 339-344.
34. Knudson, L., 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seed.
Am. Orhid Soc. Bull. 15:214-217.
35. Linda Naeve, and Diane Nelson, 2005, Growing Chrysanthemum in the
garden, plant new divition lowa State University o Science and Techonology,
Ames, lowa.
36. Margit Nothnagl, 2006, Interaction between greenhouse grown
Chrysanthemum and Frankliniella occidentalis, Doctoral thesis Swedish
University of Agricultural Sciences.
37. Michael N. Dana and B. Roise Lerner, 1996, Chrysanthemums, Press of
Department of Horticuture, Purdue University, West Lafayette, IN
38. Morel, G. and Martin, C. 1952. Virus-free Dahlia through meristem culture.
C.R. Hebd. Seances Acad. Sci. Paris 235: 1324-1325.
39. Murashige, T. 1980. Plant growth substances in commercial uses of tissue
culture. In: Plant Growth Substances 1979. Skoog, F. (Ed.) Springer-Verlag,
Berlin. Pp. 426-434.
40. Murat Top and Bill Tatura, 2002, Growing Chrysanthemum, Agriculture
Note Farm Diversiffication Service (Bendigo) March, 2002.
41. Nayak, N.R., S.N. Patnaik, and S.P. Rath. 1997a. Direct shoot regeneration
from foliar explants of an epiphytic orchid, Acampe praemorsa (Roxb.)
Blatter and McCann. Plant Cell Reports 16:583-586.
42. Nayak, N.R., S.P. Rath, and S.N. Patnaik. 1997b. In vitro propagation of
three epiphytic orchids, Cymbidium aloifolium (L.) Sw., Dendrobidium
aphyllum (Roxb.) Fisch. and Dendrobidium moschatum (Buch-Ham) Sw.
through thidiazuron-induced high frequency proliferation. Scientia Hort.
71:243-250.
43. Nyland G. and Gohen AC., 1969. Heat therapy of virus disease of perennial
plants. Annual Review of Phytopathology 7: 331-354
44. Oka S, Muraoka O, Abe T, Nakajima S., 1999. Adventitious bud and
embroid formation in garland chrysanthemum leaf culture. J Jpn Soc Hortic
Sci. 68:70 – 2.
45. Pan, M.J. and J. van Staden, 1999. Effect of activated charcoal, autoclaving
and culture media on sucrose hydrosis. Plant Growth Reg. 29:135-141.
46. Paek, K.Y. and Yeung, E.C., 1991. The effects of 1-naphthaleneacetic acid
and N6-benzyladenin on the growth of Cymbidium forrestii rhizomes in vitro.
Plant Cell Tiss. Org. Cult. 24:65–71.
47. Pierik, R.L.M., 1987. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff
Publishers, Dordrecht. The Netherlands.

78
48. Powell, W. and Uhrig, H., 1987. Anther culture of Solanum genotypes. Plant
Cell Tissue Organ Culture. 11: 13-24.
49. Prakash S., M.I. Hoque, T. Brinks, 2002, culture media and containers,
Proceedings of a Technical Meeting organized by the Joint FAO/IAEA
Division of Nuclear Techniques in Food and Agricultureand held in Vienna,
26 -30 August 2002 p.29-40.
50. Rajapakse, N.C. and Kelly, 1995. Spectral filters and growing season
influence growth and carbohydrate status of Chrysanthemum. J. Amer. Soc.
Hort. Sci. 120:78-83.
51. Rout GR, Das P., 1997. Recent trends in the biotechnology of
Chrysanthemum: a critical review. Sci Hortic; 69:239-56.
52. Schmidt J., E. Wihem, V.A. Savangikar, 2002, Disease detection and
elimination, Low cost options for tissue culture technology in developing
countries, Proceedings of a Techniques in Food and Agricultureand held in
Vienna, 26-30 August 2002 p 55-62.
53. Van Huylenbroeck, J.M. and P.C. Debergh. 1996. Physiological aspects in
acclimatization of micropropagated plantlets. Plant Tiss. Cult. Biotech.
2:136–141.
54. Verdonck, O., D. Vleeschauwer, and M. De Boodt. 1981. The influence of
the substrates on plant growth. Acta Hort. 126:251-258.
55. Yogesh Parmessur and Asha Saumtally, 2001. Elimination of sugarcane
yellow leaf virus and sugarcane bacilliform virus by tissue culture, Food and
Agriculture Research Council, Reùduit, Mauritiu p. 127-134.
56. Zapata, C., Miller Jr., J.C. and Smith, R.H. 1995. In vitro eradication of
viruses from potato. In vitro Cell Dev. Biol. Plant. 31:153-159.

79
 Phụ lục và hình ảnh minh họa

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Hình (a, b, c, d, e, f). Minh họa các cây lan con nuôi cấy in vitro

80
 (g) (h)

(i) (j)

(k) (l)
Hình (g, h, I, j, k, l). Minh họa các cây lan con trồng trong vườn ươm

81
Hoa BGH Hoa Xanh chiểu

Hoa Miretta xanh Hoa Trắng bệch

Cành hoa Tím hột Cành hoaTrắng bệch

i
 MỤC LỤC
Mở đầu ........................................................................................................................... 2
Các từ viết tắt ................................................................................................................. 3
Chương 1. Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 4
1. Sơ lược về cấy mô trong công tác nhân giống cây trồng ........................................... 4
1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mô ............................................ 4
1.2 Công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống cây trồng ....................................... 5
1.3 Vai trò của chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô ........................................ 5
1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation)............................................................. 7
2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) và chi địa lan (Cymbidium sw.)11
2.1 Khái quát chung ..................................................................................................... 11
2.2 Một vài nét về địa lan Đà Lạt................................................................................. 12
2.3 Hình thái bên ngoài của địa lan.............................................................................. 13
2.4 Phân loại địa lan. .................................................................................................... 14
2.5 Virus hại thực vật ................................................................................................... 15
2.6. Virus hại địa lan .................................................................................................... 19
3. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc ................ 24
3.1. Tình hình sản xuất hoa cúc .................................................................................. 24
3.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) : .................................... 25
4. Virus và phương pháp ELISA.................................................................................. 28
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 30
2.1 Đối tượng nghiên cứu: ........................................................................................... 30
2.2 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 30
Chương 3. Kết quả và thảo luận................................................................................... 39
A. Kết quả nghiên cứu trên các giống địa lan ............................................................. 39
3.1 Kết quả điều tra các loài địa lan hiện có tại Đà lạt ................................................ 39
3.2. Khảo sát môi trường nhân giống........................................................................... 39
3.3. Khảo sát tác động của Ribazole (Ribazole) lên sự sinh trưởng của protocorm .... 44
3.4. Ảnh hưởng của các loại giá thể và EC ở giai đoạn vườn ươm ............................ 49
B. Kết quả nghiên cứu trên các giống cúc ................................................................... 54
3.5. Ảnh hưởng của Ribazole lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro, đối với các
giống khác nhau ................................................................................................... 54
3.6. Sự phục hồi của cây sau khi xử lý Ribazole ......................................................... 58
Kết luận và kiến nghị ................................................................................................... 72
Tài liệu tham khảo........................................................................................................ 76
Phụ lục và hình ảnh minh họa ...................................................................................... 80

ii
 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Danh mục các loài địa lan cắt cành hiện đang sản xuất tại Đà Lạt ...... 39
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường lên quá trình phát sinh chồi của ba giống
Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh ...................................................................... 40
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình phát sinh chồi của ba giống
Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh. ..................................................................... 41
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống Trắng bệt,
Tím hột, Miretta xanh ......................................................................................... 42
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA + NAA lên quá trình phát sinh chồi của ba giống
Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh ...................................................................... 43
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của
Trắng bệt ............................................................................................................. 44
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của
Tím hột ................................................................................................................ 45
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ribazole lên sự sinh trưởng và phát sinh protocorm của
giống Miretta xanh. ............................................................................................ 46
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Trắng bệt .................................................................................... 47
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Tím hột ....................................................................................... 47
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ribazole tích lũy lên sự sinh trưởng và phát sinh
protocorm của Miretta xanh .............................................................................. 48
Bảng 3.12. Sự sinh trưởng của cây con giống Trắng bệch sau khi xử lý ribazole .. 48
Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con giống Tím hột sau khi xử lý ribazole ........ 48
Bảng 3.14. Sự sinh trưởng của cây con giống Miretta xanh sau khi xử lý ribazole 48
Bảng 3.15. Tỉ lệ sống của cây lan Cymbidium sp. trêm các loại giá thể khác nhau
sau 3 tháng chuyển ra vườn ươm ...................................................................... 49
Bảng 3.16. Sự sinh trưởng của cây con giống Trắng bệch trên 3 loại giá thể khác
nhau sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm .......................................................... 50
Bảng 3.17. Sự sinh trưởng của cây con giốngTím hột trên 3 loại giá thể khác nhau
sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm .................................................................... 50
Bảng 3.18. Sự sinh trưởng của cây con giống Miretta xanh trên 3 loại giá thể khác
nhau sau 12 tháng chuyển ra vườn ươm .......................................................... 50
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giống Trắng bệch trên
các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng ........................................................... 52
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giốngTím hột trên các
nền giá thể khác nhau sau 12 tháng .................................................................. 52
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của EC lên sinh trưởng cây lan con giống Miretta xanh
trên các nền giá thể khác nhau sau 12 tháng.................................................. 523
Bảng 3.22. Các giống địa lan đã được thu thập và phục tráng .............................. 524
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống pingpong vàng .......................... 54
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống tia muỗng vàng ......................... 55
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống farm hồng ................................. 56
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống nút vàng .................................... 57

iii
Bảng 3.27. Ảnh hưởng của ribazole đối với giống nút tím ....................................... 58
Bảng 3.28. Sự sinh trưởng của các cây giống tia muỗng vàng trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy .................................................................... 59
Bảng 3.29. Sự sinh trưởng của các cây giống farm hồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................. 60
Bảng 3.30. Sự sinh trưởng của các cây giống pingpong vàng trong môi trường
nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy .................................................................... 60
Bảng 3.31. Sự sinh trưởng của các cây giông nút vàng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 này nuôi cấy ............................................................................... 61
Bảng 3.32. Sự sinh trưởng của các cây nút tím trong môi trường nhân nhanh, sau
30 ngày nuôi cấy ................................................................................................. 61
Bảng 3.33. Sự sinh trưởng của các cây giống tuapin hồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................. 62
Bảng 3.34. Sự sinh trưởng của các cây giống nút nghệ trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy. ............................................................................ 63
Bảng 3.35. Sự sinh trưởng của cây giống tiger đồng trong môi trường nhân nhanh,
sau 30 ngày nuôi cấy .......................................................................................... 64
Bảng 3.36. Sự sinh trýởng của các cây giống pha lê xanh trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................. 65
Bảng 3.37. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê cam trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy ............................................................................. 66
Bảng 3.38. Sự sinh trưởng của cây giống tuapin hồng trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo .............................................................. 66
Bảng 3.39. Sự sinh trưởng của cây giống nút nghệ trong môi trường nhân nhanh,
sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo ........................................................................... 67
Bảng 3.40. Sự sinh trưởng của cây giống tiger đồng trong môi trường nhân nhanh,
sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo ........................................................................... 67
Bảng 3.41. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê xanh trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo. ............................................................. 68
Bảng 3.42. Sự sinh trưởng của cây giống pha lê cam trong môi trường nhân
nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy tiếp theo .............................................................. 68
Bảng 3.43: Kết quả test ELISA ở các giống cúc........................................................ 69

iv
 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Các cây giống pingpong vàng sau khi xử lý ribazole 30 ngày .................. 55
Hình 3.2 Các cây giống tia muỗng vàng sau xử lý ribazole 30 ngày ....................... 56
Hình 3.3. Các cây giống tia farm hồng sau xử lý ribazole 30 ngày.......................... 57
Hình 3.4. Các cây giống nút vàng sau xử lý ribazole 30 ngày .................................. 57
Hình 3.5. Ảnh hưởng của Ribazole đối với giống nút tím ........................................ 58
Hình 3.6: Các cây giống tia muỗng vàng 30 ngày sau khi cấy trở lại trong môi
trường nhân nhanh ............................................................................................ 59
Hình 3.7. Giống pingpong vàng ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy trong
môi trường nhân nhanh ..................................................................................... 60
Hình 3.8 Giống nút vàng ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy trong môi
trường nhân nhanh ............................................................................................ 61
Hình 3.9 Giống nút tím ở nghiệm thức R0 và R2 30 ngày sau khi cấy trong môi
trường nhân nhanh ............................................................................................ 62
Hình 3.10. Các cây giống tuapin hồng sau xử lý ribazole 60 ngày .......................... 63
Hình 3.11. Các cây giống nút nghệ sau khi xử lý ribazole 60 ngày ......................... 63
Hình 3.12. Các cây giống tiger đồng sau khi xử lý Ribazole 60 ngày ...................... 64
Hình 3.13. Các cây giống pha lê xanh sau khi xử lý ribazole 60 ngày .................... 65
Hình 3.14. Các cây giống pha lê cam sau khi xử lý ribazole 60 ngày ..................... 66