ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN HORMON KÍCH THÍCH BAO

NOÃN (FSH) TRONG MỘT SỐ GIỐNG LỢN Ở VIỆT NAM

1 1 1 2
Nguyễn Thị Diệu Thúy , Nguyễn Thu Thúy , Nguyễn Văn Cường , A.W. Kuss , H.
2
Geldermann
1. Viện Công nghệ Sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2. Trường ĐH Hohenheim, Stuttgart, CHLB Đức.

Ở Việt Nam, lợn là vật nuôi quan trọng, cung cấp khoảng 75% tổng lượng thịt cho xã hội [5]. Cho
đến nay, ở nước ta các chương trình lai tạo và chọn giống lợn được sử dụng chủ yếu dựa trên
đặc điểm ngoại hình và một số chỉ tiêu sinh hoá. Quá trình chọn lọc dựa trên di truyền số lượng
này đã góp phần chọn lọc đàn giống lợn có những đặc điểm ưu việt hơn ví dụ như mức độ sinh
trưởng cao hơn, chất lượng thịt tốt. Tuy nhiên, quá trình này cần nhiều thời gian và trong một số
trường hợp kết quả chọn lọc không hoàn toàn chính xác. Trong khoảng hơn mười năm gần đây,
các nhà di truyền học đã nghiên cứu và phát triển các chỉ thị di truyền phân tử cũng như các gen
liên quan đến các tính trạng để hỗ trợ cho quá trình chọn lọc giống vật nuôi.

Việc tăng số lượng con sinh ra trong một lứa là một trong những tính trạng sinh sản của lợn rất
được quan tâm. Một số chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng này như ESR (Oestrogen
receptor gene) [4], PRLR (Prolactin receptor) [6], FSH (Follicle Stimulating Hormone β subunit
Gene) …đã được nghiên cứu ở một số giống lợn [2]. Gen kích thích bao noãn FSH nằm trên
nhiễm sắc thể số 2 và sản phẩm của nó là tiểu đơn vị β của hormone kích thích bao noãn. FSH
tương tác với thụ thể của nó (receptor) nằm trên các tế bào hạt và có tác dụng kích thích sự
trưởng thành và biệt hóa của các tế bào trứng. FSH cùng với LH (Lutein Hormone) giữ vai trò
quan trọng trong sự phát triển của trứng trước khi thụ tinh. Đa hình gen FSH đã được nghiên
cứu rất kỹ ở giống lợn Meishan, Landrace, Yorkshire và Duroc [2,3]. Kết quả của sự đột biến gen
này là sự xen vào của gen nhảy (transposon) chứa toàn bộ trình tự của RNA polymerase II cũng
như các vùng có thể sao chép. Gen nhảy này có độ dài 292 bp xen vào ở vị trí 809 bp, nằm giữa
Intron I và Exon II của gen FSH. Đột biến này liên quan đến số lượng con sinh ra trong 1 lứa.
Những cá thể mang gen nhảy thì số lượng con sinh ra trong 1 lứa ít hơn so với cá thể không
mang gen nhảy. Kết quả thực nghiệm từ 289 lợn nái Landrace và Yorkshire cho thấy những cá
thể đồng hợp tử không mang gen nhảy (NN) có số con sinh ra trong một lứa trung bình cao hơn
cá thể đồng hợp mang gen nhảy (TT) 1,5 con [3]. Sử dụng phương pháp này có thể dự đoán số
lượng lợn con sinh ra trong 1 lứa. Với mục đích là bước đầu ứng dụng các kết quả của di truyền
chất lượng vào công tác chọn lọc đàn giống, chúng tôi tiến hành khảo sát đa hình kiểu gen FSH
của một số giống lợn ở Việt Nam.

Vật liệu và phương pháp

- Các hoá chất sử dụng ở dạng tinh khiết dùng cho phân tích sinh học phân tử đặt từ các hãng
Alconox, Roth, Eppendorf, Pharmacia, Merk, Serva, Sigma, MBI Fermentas,…

- 302 mẫu máu thu được từ 7 giống lợn: Móng Cái (n=61) từ nông trường Thành Tô (Hải
Phòng), Mường Khương (n=73) từ huyện Mường Khương (Lào Cai), Mẹo (n=47) từ huyện Quỳ
Châu (Nghệ An), Cỏ (n=42) từ huyện Kon Kuông (Nghệ An), Tạp Ná (n=25) từ huyện Thông
Nông (Cao Bằng) và 2 giống lợn ngoại Landrace (n=24) và Yorkshire (n=17) đã nhập vào Việt
Nam trên 20 năm tại Trung tâm Nghiên cứu lợn Thụy Phương, Viện Chăn nuôi Quốc gia.

- DNA được tách chiết từ máu qua các bước: tiêu hoá bằng ProteinaseK và làm sạch bằng
Phenol, Chloroform theo phương pháp được mô tả trong [1].

- Trình tự ADN của đoạn gen FSH cần nhân lên và trình tự cặp mồi đặc hiệu được trình bày
dưới đây:
 Trong đó: P1 và P2 là trình tự mồi đặc hiệu với đoạn gen FSH
Đoạn viết ở dạng chữ in là trình tự đoạn gen nhảy dài 292 bp.

- Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen FSH được ghi trong bảng 2 và 3.

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR

Bảng 3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn FSH

- Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium Bromide và phát hiện
dưới ánh sáng UV.
Kết quả và thảo luận

Kết quả PCR nhân đoạn gen FSH

Trước tiên, chúng tôi phải tiến hành tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR, trong đó quan trọng
nhất là 2 yếu tố nồng độ MgCl2 và nhiệt độ bám. Phản ứng PCR được tiến hành trên máy
Gradient Cycle PTC-100 với gradient nồng độ MgCl2 từ 1,5mM đến 3,0mM và nhiệt độ bám từ
0 0
50 C đến 62 C. Kiểm tra sản phẩm PCR trên agarose 1,5% cho thấy ở điều kiện nhiệt độ bám
0
55 C và nồng độ MgCl2 1,5mM là cho kết quả tốt nhất, sản phẩm PCR có 1 vạch rõ và duy nhất
có kích thước 540bp tương ứng với cá thể có mang đoạn gen nhảy.
Kết quả phân tích kiểu gen FSH bằng PCR trong 7 giống lợn Móng cái (MC), Mường Khương
(MK), Mẹo (ME), Cỏ (CO), Tạp Ná (TN), Landrace (LR) và Yorkshire (YS) được trình bày ở hình
1. Sản phẩm PCR thu được có độ dài khác nhau, phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của
gen nhảy ở 1 hoặc cả 2 nhiễm sắc thể. Những cá thể mang gen nhảy được ký hiệu là T tương
ứng với sản phẩm PCR có độ lớn là 540bp, những cá thể không mang gen nhảy ký hiệu là N
tương ứng với sản phẩm PCR có độ lớn là 248 bp. Sản phẩm PCR ở các giếng 4,5,6 là 1 băng
ADN có độ lớn tương ứng với 248 bp, tức là những cá thể này có kiểu gen đồng hợp tử NN, sản
phẩm PCR ở các giếng 1,2,3 là 1 băng ADN có độ lớn tương ứng với 540 bp, tức là những cá
thể này có kiểu gen đồng hợp tử TT, sản phẩm PCR ở các giếng 7,8,9,10,11 xuất hiện 2 băng
ADN tương ứng với 540bp và 248 bp, đó là các cá thể có kiểu gen dị hợp tử TN.

Hình 1: Kết quả điện di agarose 1,5%

M: ADN chuẩn 100bp

1-3: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có kiểu gen TT (540bp)
4-6: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có kiểu gen NN (248 bp)
7-11: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen FSH của các cá thể có kiểu gen TN (540bp và 248bp)

Tần suất xuất hiện kiểu gen FSH trong một số giống lợn

Trong 61 MC có 59 con mang kiểu gen đồng hợp tử TT chiếm 96,7%; 2 các thể mang kiểu gen
đồng hợp tử NN chiếm 3,3% và không có cá thể nào mang kiểu gen dị hợp tử TN. Trong số 73
cá thể giống lợn MK tần số kiểu gen đồng hợp tử NN là 11% (8 cá thể), dị hợp tử TN 21,9% (16
các thể) là cao hơn so với MC, còn lại là 49 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử TT chiếm 67,1%.
Còn đối với các giống lợn Yorkshire và Landrace nhập vào Việt Nam thì tần số kiểu gen NN, TN
và TT lần lượt là 76,5%, 79,5%; 5,9%, 8,3% và 17,6%, 12,5%. Kết quả bảng 1 cho thấy tần số cá
thể không mang gen nhảy tức là kiểu gen NN ở các giống lợn ngoại nhập cao hơn hẳn so với
các giống lợn nội Việt Nam. Trong số các giống lợn nội thì không có cá thể nào của giống lợn CO
mang kiểu gen NN, và chỉ có 2,1% và 4% giống lợn ME và TN mang kiểu gen đồng hợp tử NN.
Kết quả này chỉ ra rằng với giống lợn ngoại đã được chọn lọc thì tần số kiểu gen NN (không
mang gen nhảy) cao hơn hẳn các giống lợn nội, liên quan số lợn con sinh ra trong một lứa nhiều
hơn. Điều này có thể do các giống lợn ngoại YS và LR là các giống nhập ngoại vì thế đã qua quá
trình chọn lọc nhân tạo của con người, còn các giống lợn nội (MK, ME, CO, TN) còn hoàn toàn
chăn nuôi tự nhiên.

Bảng 4. Tần suất các kiểu gen FSH trong một số giống lợn

I. Kết luận

- Đã nhân được đoạn gen đặc hiệu của gen FSH có độ dài 540 bp trong trường hợp có mang
gen nhảy và độ dài 248 bp trong trường hợp không mang gen nhảy bằng kỹ thuật PCR.

- Đã khảo sát đa hình di truyền gen FSH của 7 giống lợn trong đó có 5 giống lợn nội và 2
giống lợn ngoại nhập vào Việt Nam. Kết quả cho thấy hai giống lợn ngoại Yorkshire và Landrace
có tần số kiểu gen không mang gen nhảy cao hơn hẳn các giống lợn nội Việt Nam.
II. Tài liệu tham khảo

1. Frederich M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman,
John A. Smith, and Kevin Struhl. Shrort Protocols in Molecular Biology, Third Edition.
2. Li, N., Zhao, Y.F., Xia, L., Zhang, F.J., Chen, Y.Z., Dai, R.J., Zhang, J.S., Shen, S.Q., Chen,
Y.F. and Wu, C.X. 1998. Candidate gene approach for identification of genetic loci controlling
litter size in swine. Proc 6th World Congress Quatitative Genetics of Livestock 26: 183-186.
3. Li et al. DNA marker for pig litter size. United States Patent, September 18, 2001.
4. Max Rothschild et al. The estrogen receptor locus is associated with a major gene
influencing litter size in pigs. 1996. Proc. Natl. Acad. USA. Genetics. Vol. 93, 201-205.
5. Nguyễn Văn Đức, Tạ Thị Bích Duyên, Giang Hồng Tuyến, Nguyễn Văn Hà và Lê Viết Ly.
2000. Kết quả chọn lọc dòng lợn Móng Cái về tăng trọng, tiêu tốn thức ăn và tỷ lệ nạc. Tóm tắt
báo cáo khoa học năm 1999. Viện Chăn Nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 3-5.
6. Vincent, A.L., Short, T.H., Eckardt, G.R., McLaren, D.G., Southwood, O.I., Plastow, G.S.,
Tuggle, C.K. and Rothschild, M.F. 1998. The prolactin gene receptor is associated with increased
litter size in pigs. Proc 6th World Congress Quantitative Genetics of Livestock 27: 15-18.

SUMMARY

Genetic frequency of follicular stimulating hormone gene in pig breeds in VietNam.

Nguyen Thi Dieu Thuy et al.

Institute of Biotechnology.

The follicular stimulating hormone gene (FSH) plays an importance role in the development of the
oocyte before fertilization by interacting with its receptor on granular cells to promote the
maturation and differentiation of ovarian follicles. The association between litter size and the
polymorphism of porcine FSH beta-subunit gene was confirmed. A mutation caused by an
insertion of a transposon which contains a complete promoter for RNA-polymerase II and other
possible transcription regions, in the FSH-beta subunit gene has been identified. The litter size in
pigs carrying the mutation is significantly lower than those of pigs lacking the mutation. To
analyze the frequency of follicular stimulating hormone gene in pig breeds in Viet Nam we have
screened the mutated FSH-gene in 302 individuals belonging to 5 local pig breeds (Muong
Khuong, Mong Cai, Meo, Co and Tap Na) and 2 exotic pig breeds (Yorkshire and Landrace) by
polymerase chain reaction (PCR). Two specific primers (P1: 5’-ccttnnagacagtcaatgg-3‘; P2: 5‘-
ccagtnnttcaaggtttggtca-3‘) have been used for PCR amplification of mutated and unmutated DNA
fragment in the FSH gene. PCR condition was optimized on MgCl2 and annealing temperature.
0
The PCR condition of 1.5mM MgCl2 and 55 C gave the best result. The mutated and unmutated
allele was identified as allele “T” and “N”. The homozygote (TT) and (NN) will present one bands
of 540bp and 248bp, respectively. The heterozygote (TN) will present two bands of 540bp and
248bp. Analysis of FSH gene polymorphism on Landrace, Yorkshire, showed that the frequencies
of the homozygote (NN) were 79.2% and 76.5%, respectively. In digenous pig breeds, the
frequencies of the homozygote (NN) were very low, even in case of Co breed no animal has been
detected. Among the local pig breeds, the highest frequency of the homozygote (NN) and the
heterozygote (TN) was found in Muong Khuong breed and have the value of 11% and 21.9%,
respectively. The frequency of homozygote (NN) in exotic breeds is higher than in indigenous
breeds. The preliminary results are consistent with the fact that the exotic breeds were selected
for reproductive trait, while indigenous breeds were not.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS.TS. Nguyễn Kim Độ.