BİYOTEKNOLOJİ I

2005-2006

Prof. Dr. Şule ARI

 Mikrobiyal teknoloji ile üretilen ürünler ve
biyoteknolojik alanların sınıflandırılması
1) Tüm hücre (Biyomas üretimi)
2) Düşük molekül ağırlıklı maddelerin üretimi
a- Primer metabolitlerin üretimi
b- Sekonder metabolitlerin üretimi
c- Organik bileşiklerin biyodönüşümü (biyotransformasyon)
• Yüksek molekül ağırlıklı maddelerin üretimi
A- Polisakkaritler
B- Lipidler
C- Proteinler

4) Genel mikrobiyal metabolizmaya ait prosesler

a-Atıkların yıkımı/oksidasyonu
b-Mineral özütlenmesi
 /SÜREÇ
M KROB YA L ÜRÜN ÖRNEK KULLANIM ALANI

Hücre kitlesi (biyomas) Tek Hücre Proteini Gıda

Dü ük molekül a ırlıklı maddeler Primer Metabolitler Gıda, Tıp

Yüksek molekül a ırlıklı maddeler
Ör: Amino asitler
Sekonder Metabolitler Tıp, Gıda, Tekstil
Ör: Antibiyotikler
Metabolik son ürünler Yakıt, Çevre, Kimya
Ör: EtOH
Biyodönü üm reaksiyonlarıyla Tıp, Kimya
üretilen organik maddeler
Ör: Steroidler
Proteinler Deterjan, Tekstil,
Ör: Enzimler Gıda, Tıp

Polisakkaritler Kimya, Gıda, Tıp

Ör: Ksantan
Atıkların yıkımı/ oksidasyonu Çevre

Mineral ekstraksiyonu Madencilik

Mikroorganizmaların ürettikleri
düşük molekül ağırlıklı
maddeler
 Mikroorganizmaların ürettikleri
düşük molekül ağırlıklı maddeler
ÇOK SAYIDA MADDE

1- Primer metabolitler
2- Sekonder metabolitler
3- Biyodönüşüm ( biyotransformasyon )
yoluyla metabolizmaları gereği enzimatik
olarak bir maddeyi benzerine dönüştürme
PRİMER (Birincil) METABOLİTLER
• Hücre üremesi ve yaşamını
sürdürebilmesi için esassiyel
metabolitler
– Makromoleküllerin yapıtaşları
• Amino asitler
• nükleotidler
– Koenzimler
– Vitaminler
– Temel metabolik yolların ara ürünleri
• Fumarik, sitrik asitler (Ör: krebs devri araürünleri)
PRİMER (Birincil) METABOLİTLER
• Organizmanın üremesine paralel üretim
• Fazla miktarda üretilmeleri enerji kaybına
neden olacağından üretimleri hücrede sıkı
biçimde düzenleme altındadır
• Hücrede fazla miktarda üretilmezler
• Üreme durunca sentezleri de durur
PRİMER (Birincil) METABOLİTLER
• Gerektiği kadar üretimleri
– Feed back inhibisyon : son ürün tarafından
anahtar enzimin aktivitesinin kontrolu
PRİMER (Birincil) METABOLİTLER
– Represyon: son ürün tarafından metabolik yol
enzimlerinin sentezinin baskılanması
PRİMER (Birincil) METABOLİTLER
• Fazla miktarda üretimleri
– Mutasyon: E.coli’de treonin overproduction
– Membran geçirgenliğinin bozulması:
Corynebacterium glutamicum’da glutamik asit
üretimi
– Rekombinant DNA Teknolojisi: Önemli
enzimlerin klonlanması, fazlaca katkısı yok
 PRİMER METABOLİTLER
AMİNO ASİTLER
Glutamik asit
• Endüstriyel olarak üretilen ilk amino asit
• Japonya, 1957
• Önceleri; asit hidrolizi ile üretim ve D ve L
formların oluşumu
• Etanol, organik çözücüler ve bazı
vitaminlerden sonra endüstiriyel olarak
üretildi
 AMİNO ASİTLER
Günümüzde amino asitler,
• Fermentasyon
• İmmobilize enzimlerle
üretilir
 AMİNO ASİTLER
• Gıda
– Tat artırıcı Ör. Glutamik asit
– Yem katkısı
• Öncül bazı maddelerin sentezi
Ör: Aspartam: fenil alanin ve aspartik asitten
üretilir
• Enzim eksikliği hastalıklarına bağlı olarak
besinlerden yararlanılamamsı durumunda
tedavi amaçlı
Amino asit Dünyada yıllık üretim (ton ) Kullanım alanı
L- alanin 130 Tat artırıcı
DL-alanin 700 Tat artırıcı
L- arginin 1000 njeksiyon, kozmetik
L- aspartat 4000 Tat artırıcı, aspartam üretimi
L-asparagin 50 Tedavi
L- cystein 700 Ekmek katkısı, antioksidan
L- glutamat 370.000 Tat artırıcı
L- glutamin 500 Tedavi
Glysin 6000 Organik sentezi
L-histidin 200 Tedavi
L-izolösin 150 njeksiyon
L- lösin 150 njeksiyon
L-lisin 70.000 Yem katkısı, injeksiyon
DL- metionin 70.000 Yem katkısı
L- metionin 150 Tedavi
L- ornitin 50 Tedavi
L- fenil alanin 30.000 njeksiyon, tedavi, aspartam
üretimi
L-prolin 100 njeksiyon
L-serin 50 Kozmetik
L-treonin 150 Yem katkısı
L- triptofan 200 njeksiyon terapi
L-tirozin 100 njeksiyon, L-DOPA sentezi
L-valin 150 njeksiyon
 AMİNO ASİTLER
• Yüksek hayvanlarda
ESANSİYEL AMİNO ASİTLER
Lisin, Metionin, Triptofan, Lösin, İzolösin,
Valin, Fenil alanin, Treonin, Arginin
sentezlenmez
• Tahıllar
– Ucuz A.A. Kaynakları
Lisin, Metionin, Triptofan oranları düşük
MISIRDA %0.2 lisin, ETTE %2.6
 AMİNO ASİTLER
E.coli’de birçok A.A.’in kontrolü
1. Sentezlenmiş enzimlerin aktivitelerinin
kontrolu
2. Yeni enzim sentezinin kontrolu
3. Attenüasyon
ENDÜSTRİYEL ÖLÇEK İÇİN
MİKROORGANİZMANIN ÜRETTİĞİ A.A.
MİKTARI YETERLİ DEĞİLDİR !!!
MİKTARLARI ARTIRILMALIDIR !!!!!
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
MEMBRAN GEÇİRGENLİĞİNİN
DEĞİŞTİRİLMESİ
• Corynebacterium-Brevibacterium
• Biotin açlığı membran geçirgenliğinin
artışı glutamat sekresyonu
Biotin: yağ asitleri sentez yolu ilk enzimi
asetil Co A karboksilazın prostetik grubu
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Ör. Treonin, triptofan üretiminde
Çok yararlı değil
• Her prototrofta A.A. sentez enzimleri var
• Negatif kontrol nedeniyle fazla miktarda
inhibe olmamış enzim miktarının artışına
gerek yok
• Sadece enzim değil aynı zamanda
prekürsör artışı da gerekli
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
ENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİ
aspartaz
L-Aspartik asit Fumarik asit + NH3
1 mM %95

aspartaz
L-Aspartik asit Fumarik asit + NH3
2 mM 2 mM
 ENZİMLERLE A.A. ÜRETİMİNİN
AVANTAJLARI
1. Yüksek miktarda üretim, Kolay elde
edilebilirlik
2. Reaksiyon ortamı reaktanları basit, kolay
saflaştırma
3. Yüksek verim
4. Küçük fermentasyon kullanımı
5. İmmobilizasyona kolay uygulama
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
MUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİ
Oksotrofik mutantlar

• Metabolik yolda bloke olmuş aşamadan

önceki ara ürünün birikimi
– Ara ürünün üretimi
– Ara ürünün başka bir metabolite
dönüştürülmesi
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
MUTANTLARLA A.A. ÜRETİMİ
Oksotrofik mutantlar
• Penisilin seleksiyonu
– Oksotrof seçimi
Ör: arginin oksotrofu seçimi
Mutasyon minimal besiyeri + penisilin
Bölünen hücrelerde hücre duvarı yapımının inhibisyonu
prototrofların ölümü
Ölmeyenlerin minimal besiyeri + arginin ortamında
seçilmesi
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• OKSOTROFİK MUTANTLAR
– Dallanmış yollara ait A.A’ler
– Dallanmamış yollara ait A.A.’ler

ÖR: L-Ornitin X L-sitrullin L-Arginin

Ornitin
L-sitrullin üretimi ile
birikimi
oksotrof seçimi
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• OKSOTROFİK MUTANTLAR
DEZAVANTAJLAR:
– Sentez edilemeyen ara ürünün eklenme
zorunluluğu
• Maliyet artışı
• Fazla ilave edilmesi durumunda negatif kontrol
nedeniyle sentezin durması
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• REGÜLATÖR MUTANTLAR
– Negatif regülasyon mekanizması bozulmuş
mutantlar
– Ucuz ve kompleks besiyerlerinde üretim
– Dallanmış ve dallanmamış yolara ait
regülatör mutantlar
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR
MUTANTLAR
Regülatör mutantlarda biyosentez yolunun ilk
kademesini şifreleyen enzim geni değişerek
feed back regülasyona duyarsız (feed back
insensitif) hale gelir
Bu nedenle son ürün veya son ürün
analoglarının fazla miktarda bulunmaları
halinde bile amino asitin fazla miktarda
üretimi mümükün olur
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• DALLANMAMIŞ YOLLARA AİT
REGÜLATÖR MUTANTLAR
Serretia marcesces’de prolin
overproduction

1. Mutasyonla sentezin ilk kademesini

şifreleyen enzim geninin (glutamat kinaz)
değişimi
2. Prolin analogları kullanımı
3. Analog varlığında yabani tiplerin ölümü
Analoğun glutamat kinazın allosterik
yerine ya da regülatör proteine
bağlanması, toksik etki nedeniyle
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• DALLANMIŞ YOLLARA AİT
REGÜLATÖR MUTANTLAR
– Aspartat familyası a.a’leri (lisin, metionin,
treonin, izolösin)
– Piruvat familyası a.a’leri (valin, lösin)
– Aromatik aile (triptofan, fenil alanin,
tirozin)
 AMİNO ASİT ÜRETİM YOLLARI
• DALLANMIŞ YOLLARA AİT REGÜLATÖR
MUTANTLAR
– Aspartat familyası a.a’lerinden lisin ve triptofanın
• PER (Protein Efficiency Ratio) değeri 0.85
• %0.004 lisin ve %0.007 triptofan ilavesiyle PER değeri
2.55
– Brevibacterium flavum’da oksotrofik mutantlarla
lisin overproducer’i 3g lisin/litre, PROSES PAHALI
– Regülatör mutantla yolun ilk enzimi asparto
kinazın lisin analoğu S-amino etil sistein (SAEC)
ile inhibe olmaması sonucu overproducer seçimi
60g lisin/litre