Genotoksinost izazvana natrijum hipohloritom, hlor dioksidom i peracetnom kiselinom, detektovana Comet metodom i Saccharomyces cerevisiae D7 testovima

Mutagenost pijae vode ne javlja se samo zbog industrijskog, poljoprivrednog i urbanog zagaenja, ve takoe i usled nus-produkata dezinfekcije hlorom. tavie, rezidualna dezinfekcija se primenjuje da bi se obezbedila delimina odbrana protiv manjih kontaminacija i ponovnog razmnoavanja bakterija unutar jednog sistema distribucije. Ciljevi ove studije pored svega ovoga bili su i da se oceni genotoksini potencijal dezinfekcionih sredstava u irokoj upotrebi natrijum hipohlorita i hlor dioksida na humanim leukocitima pomou Comet metode i na soju D7 Saccharomyces cerevisiae ( mitotina gen konverzija, taka mutacije i promenljivost mitohondrija DNK, sa ili bez endogene metabolike aktivacije), i da se uporede njihovi efekti sa efektima peracetne kiseline, koja se predlae kao alternativno dezinfekciono sredstvo. Sva tri dezinfekciona sredstva su slabo genotoksina na humanim leukocitima (najmanja efikasna doza 0.2 p.p.m. za hlor dioksid, 0.5 p.p.m. za natrijum hipohlorit i peracetnu kiselinu). Rezultati kod S. Cerevisiae pokazuju genotoksini odgovor na krajnjim takama i smatraju se efikasnim samo u koncentracijama veim ( 5 ili 10 puta) od onih koje se normalno koriste za dezinfekciju vode ; natrijum hipohlorit i peracetna kiselina mogu da izazovu genotoksine efekte bez endogene metabolike aktivacije ( u fazi elijskog mirovanja)dok je hlor dioksid efikasan u fazi rasta elija. Comet metoda je osetljivija nego testovi sa gljivicama, sa efikasnim dozama u rangu normalnih koje se normalno koriste za procese dezinfekcije vode. Bioloka efikasnost sva tri dezinfekciona sredstva na S. Cerevisiae pokazala se da strogo zavisi od specifinih fiziolokih/biohemijskih uslova elija. Sve komponente deluju na DNK a peracetna kiselina pokazuje efikasnost slinu natrijum hipohloritu i hlor dioksidu. Uvod

Proces dezinfekcije je efikasna odbrana od mnogih patogena koji mogu dospeti u pijau vodu. Meutim, mnoge studije su otkrile prisustvo mutagena u vodi za pie, ne samo zbog razliitih izvora zagaenja ve i zbog razliitih tretmana dezinfekcije. Poznato je da hlor reaguje sa organskim materijama ( huminska i fulvinska kiselina dobijene iz dekompozicije biljaka) prisutnim u netretiranim povrinskim vodama pri emu nastaju nus-produkti dezinfekcije. tavie, rezidualna dezinfekcija se primenjuje da bi se obezbedila delimina odbrana protiv manjih kontaminacija i ponovnog razmnoavanja bakterija unutar jednog sistema distribucije. Zbog toga su dezinfekciona sredstva prisutna u vodi sa esme, zajedno sa dezinfekcionim nus-proizvodima. ak iako je nivo izloenosti nizak, prisustvo ovih komponenti u vodi za pie mora se uzeti u obzir zbog toga to vodu pijemo celog ivota. Hlor prua vrlo efikasnu zatitu od infektivnih bolesti koje se mogu preneti putem vode, ali ima nekih epidemiolokih izvetaja o riziku od pojave raka koji je povezan sa hlorisanom vodom. Problemi sa hlorom ( kao hipohlornom kiselinom HOCl i hipohlornim jonom OCl-) kao dezinfikatorom vode nastaju zbog formiranja

trihalometana (THM) i ostalih potencijalno mutagenih/karcinogenih reakcija nusprodukata. Genotoksina aktivnost i karcinogeno delovanje hlorisane vode za pie se takoe smatraju posledicom samog jona Ocl-. Ipak, IARC ( International Agency for Research on Cancer Meunarodna agencija za istraivanje raka) smatra NaClO za ne-klasifikovane kada je u pitanju karcinogenost, iako je kod nekih kratkotrajnih testova mutagenosti dao pozitivne rezultate: Escherichia coli i Salmonella typhimurium ( takaste mutacije), kineski hrak (aberacija hromozoma), ljudski fibroblasti ( SCE-sistem zamene sestrinskih hromatida) i mi (morfologija sperme). tavie, za OCl- je utvreno da direktno izaziva razliite vrste oteenja DNK u elijskom sadraju. Poveana upotreba ClO 2 za tretman vode za pie opravdava potrebu za nadgledanjem nivoa moguih rizinih nus-proizvoda , ukljuujui hlorit (ClO2 - ) i hlorat (ClO3 - ). ClO2 se smatra efikasnijim baktericidom od vodenog hlora i redukuje formiranje hlorisanih organskih materija. Ni ClO2 ni njegovi nus-produkti ClO2- i ClO3- ne reaguju sa huminskom i fulvinskom kiselinom da bi formirali trihalometane, kao to je sluaj kod hlora u tretmanu vode za pie. Meutim, ClO2 je jak oksidans koji reaguje sa organskim materijama i proizvodi raznovrsne oksidizovane nus-proizvode. Amerika agencija za zatitu ivotne sredine svrstala je ClO2 u grupu D, tj. Ne-klasifikovani za izazivanje kancera kod ljudi , zbog neadekvatnih podataka o ispitivanjima na ljudima i ivotinjama i zbog toga to su podaci o genotoksinosti ClO2 jo uvek nesigurni i predmet su velikog broja kontroverzi.

Citotoksini i genotoksini efekti na D7 soj Saccharomyces cerevisiae

U ovom kontekstu, sproveden je projekat radi procene potencijalnih genotoksinih rizika po zdravlje oveka koje sa sobom moe nositi voda dezinfikovana hlorom, i radi razmatranja peracetne kiseline PAA kao dezinfekcione alternative hloru. Peracetna kiselina je vredna prouavanja za primene u dezinfikovanju vode za pie jer je ona moan antimikrobni agens i ima mnogo primena u bolnicama, laboratorijama i fabrikama, a pronala je primenu i kao efikasna biocidna komponenta za dezinfekciju otpadnih voda. Podaci iz studija koje su prouavale PAA nisu previe zabrinjavajui zbog mutagenosti, karcinogenosti ili reproduktivne toksinosti, smrtonosne doze kod eksperimentalnih vrsta uvek su bile vee nego doze koje su potrebne za proces dezinfekcije. Kao prvi korak inilo se zanimljivim odrediti i uporediti genotoksinu efikasnost tri dezinfektivna agensa NaClO, ClO2 i PAA. U studiji koja je ovde prikazana genotoksini efekti dezinfekcionih sredstava su procenjeni pomou standardizovanog kratkog testa na Saccharomyces cerevisiae i pomou Comet metode ili ogleda na ljudskim leukocitima. Ogled sa diploidnim D7 sojem Saccharomyces cerevisiae moe da pokae efekte na jezgro DNK, kao to su konverzija gena i takasta mutacija, i da proceni poetak mutacije u genomu mitohondrije. SCGE ili Comet metoda ili ogled je iroko rasprostranjeni metod za utvrivanje oteenja DNK ( prekid nizova, unakrsno povezivanje) i nekompletno uklanjanje popravljenih mesta u individualnim elijama. Materijali i metode Hemikalije Reagensi za Comet ogled i opte laboratorijske hemikalije dobijene su iz Sigme; agar za kulture S.cerevisiae iz Difco-a. Natrijum hipohlorit (NaClO) iz Solvay-a, hlor dioksid (ClO2) iz Caffaro-a i peracetna kiselina iz Promox-a. NaClO i ClO2 pre upotrebe se uvek ispituju zbog svoje nestabilnosti: NaClO jodometrijskim ispitivanjem a ClO2 DPD metodom. Biotestovi Saccharomyces cerevisiae Diploidni lanac D7 Saccharomyces cerevisiae koriten je za utvrivanje frekvencija reverzije na ilv1-92 lokusu, mitotike konverzije gena na trp5 lokusu i malim kolonijama, npr.mutabilnost DNK mitohondrija, sa ili bez endogene aktivacije. Kao alternativni sistem mikrosomalnom testu, elije kvasca su prikupljane tokom logaritamske faze rasta u 20% glukoze na maksimalnoj aktivaciji citohrom P450 kompleksa. I sa i bez endogene metabolike aktivacije (+/- P450) elije su tretirane dezinfektantima (u hermetiki zatvorenim test tubama) na 37 stepeni Celzijusa u trajanju od 2 sata: 2-aminofluoren i etilmetanesulfonat su koriteni kao pozitivna kontrola kada je zapoet citohrom P450. Saccharomyces cerevisiae nema sve humane P450 familije: identifikovani geni su CYP51, takoe prisutan i kod ljudi i specifian za sterolnu biosintezu, i CYP56 i CYP61 sa neodreenim specifikacijama. Meutim, efikasnost kvasca P450 u aktivaciji 2aminofluorena, pro-mutagene komponente koja je u irokoj upotrebi kao pozitivna kontrola u Ames testovima, naglaena je u ovoj studiji. Poetak mutacije DNK mitohondrija ocenjivan je u istom soju odreivanjem uestalosti kolonija sa respiratornim deficitom. Da bi se detektovali mali mutanti, posle 5 dana inkubacije na 28 stepeni Celzijusa, posude su prekrivene agarom koji

je sadrao 2,3,5-trifenil tetrazolium hlorid za bojenje kolonije. Etidijum bromid (1 g/ml) koriten je kao pozitivna kontrola. Za izraunavanje specifine genotoksine aktivnosti koritena je analiza najmanje kvadratne linearne regresije. Rezultati svih ogleda podvrgnuti su analizi. Ako je dobijena znaajna F vrednost (P<0.05) podaci su dalje podvrgnuti Dunetovom C-testu. Humani leukociti. Za izolaciju leukocita, uzeta je krv tri zdrava davaoca nepuaa i centrifugirana u lizis puferu ( 155 mM NH4Cl, 5mM KHCO3, 0.005mM Na2EDTA, pH7.4), isprana sa fosfat-puferovanim slanim rastvorom i resuspenzovana u RPMI 1640 sredini. Alikvoti (10*6 elije) su tretirani ( 1h, 37 stepeni C) dezinfekcionim sredstvom ili etil metan sulfonatom ( pozitivna kontrola). Preivljavanje elija provereno je pomou fluorescen diacetat/etidijum bromid ogleda a Comet ogled je pokazao odrivost samo 70% uglavnom po Singu i ostalima: razgradnja elija na 4 stepena C preko noi ( 2.5 M NaCl, 10 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100 i 10% DMSO, pH 10), DNK raymotavanje za 20 minuta u elektroforetinom alkalnom puferu (1mM Na2EDTA, 300 mM NaOH, pH 13, 0 stepeni C), elektroforeza u trajanju od 20 minuta ( 0.78 V/cm, 300 mA) na 0 stepeni Celzijusa u istom puferu, praena neutralizacijom ( 0.4 M Tris-HCl, pH 7.5). DNK je pomeana sa 100 l etidijum bromida ( 2g/ml) pre prouavanja na 400 puta uveanju pod Leika DMLB fluorescentnim mikroskopom pomou sistema automatske analize slika. Migraciona distanca izmeu ivice glave komete i vrha repa obezbedila je reprezentativne podatke o genotoksinim efektima. Uzorci su kodirani i ocenjivani na slepo ( 50 elija za svaku od dve replicirane strane po podatku). Svi testovi su sprovedeni po najmanje tri puta. SPSS 11 statistiki paket je primenjen na podatke iz Comet ogleda. Statistike razlike izmeu kontrolnih i tretiranih uzoraka prvo su odreivane ne-parametarskim Wilcoxon rang suma testom za svaki eksperiment.

REZULTATI NaClO Stepen smrtnosti elija u zavisnosti od doze primeen je kao 1 i 5 p.p.m.kao najmanja efikasna doza kod statine i logaritamske faze rasta S.cerevisiae elija i to 1 ppm kod statine a 5 ppm kod logaritamske. Znaajniji genotoksini efekti primeeni su jedino kod statinih elija za konverziju gena ( 30 p.p.m.), reverziju ilv92 ( 10 p.p.m.) i kod respiratorno deficitarnih kolonija ( 20 p.p.m.). i konvertanti i frekvencije respiratornog deficita poveavale su se sa koncentracijom dezinfekcionog sredstva, dok je poetak revertanta do 10 p.p.m. bio ogranien odgovarajuom visokom citotoksinou. Znaajniji efekat ( P<0.001) na preivljavanje elija otkriven je na 1 p.p.m. ( 16% smrtnosti elija) u Comet ogledu. Najmanja efikasna doza za poetak znaajnog poveanja (P<0.05) u DNK migraciji je 0.5 p.p.m. ClO2 Statine S.cerevisiae elije pokazale su veu osetljivost na ClO2 toksinost nego logaritamske elije, sa znaajnijim efektima na 1 (P<0.05) i 5 p.p.m. ( P<0.01) i to statine 1 p.p.m. i logaritamske 5 p.p.m. Genotoksini efekti primeeni su samo na

P-450 indukovanim elijama sa znaajem jedino na najveim dozama ( gen konverzija i reverzija, P<0.001; RD P<0.05). Nisu primeeni nikakvi znaajniji citotoksini efekti u Comet ogledu dok je znaajno poveanje DNK migracije (P<0.05) primeeno na 2 p.p.m. sa TL poveanjem/p.p.m. od 0.082 (R*2=0.75). Peracetna kiselina Smrtnost elija je u najveoj meri zavisila od fiziolokog stanja gljivica: kod P450indukovanih S.cerevisiae elija znaajan efekat (P<0.01) peracetne kiseline na preivljavanje elija primeen je samo na najveoj dozi (15 p.p.m.)dok je najmanja efikasna doza kod statinih elija 2 p.p.m. (P<0.01). Genotoksinost je takoe zavisila od stanja elija sa znaajnijim efektima samo na statinim elijama ( 10 p.p.m. za konverziju gena; 5 p.p.m. za reverziju, bez respiratorne deficijencije). Peracetna kiselina nije izazvala neku znaajniju citotoksinost u Comet ogledu; jedino su genotoksini efekti primeeni sa najmanjom efikasnom dozom od 0.5 p.p.m. (P<0.01) i TL poveanjem/p.p.m.=0.055 (R*2=0.62).

Diskusija

Kvalitet vode za pie bitan je u svim zemljama na svim nivoima ekonomskog razvoja a rizik koji nose mikrobi i njihovo prisustvo u vodi postali su glavna briga. Zato je dezinfekcija od neosporne vanosti za snabdevanje vode koja je bezbedna za pie. Proces dezinfekcije je efikasna barijera za mnoge patogene , posebno za bakterije, i treba je primenjivati za povrinske vode ali i za podzemne, koje mogu da budu zagaene fekalijama. Rezidualna dezinfekcija se koristi da bi se obezbedio delimini tit protiv kontaminacije nieg nivoa i ponovnog razmnoavanja bakterija unutar distributivnog sistema. Meutim, upotreba hemijskih dezinfekcionih sredstava u tretiranju vode obino rezultira stvaranjem nus-produkata koji mogu biti toksini i/ili mutageni. tavie, rezidualni dezinfektanti sami po sebi mogu da budu tetni, prvenstveno zbog produenog perioda izloenosti. Cilj ove studije bio je da proceni potencijalnu genotoksinost izazvanu pomou dva najire koritena dezinfekciona sredstva za vodu ( NaClO i ClO2) i da njihove efekte sa onima koje bi eventualno mogla da izazove peracetna kiselina, koja se predlae kao alternativni dezinfektant. Gljivica S.cerevisiae D7 predloena je kao elijski model za obezbedjivanje brzog skrininga razliitih biolokih aktivnosti hemikalija i prouavanje zaetaka rekombinacije. Kroz evoluciju su se u eukariotama ouvali mnogi sistemi za popravljanje DNK, pa je verovatno da e steeno znanje o izazvanim rekombinacijama kod gljivica biti primenljivo i na elije sisara pa tako i na ljude. Mnogi karcinogeni izazivaju rekombinacije i preureenja hromozoma. Razumevanje mehanizama pomou kojih genotoksini agensi izazivaju poveane nivoe rekombinacije igrae znaajnu ulogu u leenju kancera i u spoznavanju rizika kojima se ovek izlae izlaui sebe genotoksinim agensima. Podaci dobijeni iz ogleda sa S.cerevisiae pokazuju genotoksini odgovor na krajnjim takama ako se u obzir uzmu doze vee od onih standardnih potrebnih za dezinfekciju (1-2 p.p.m. za ClO2 i NaClO).

Genotoksini efekti NaClO bez endogene metabolike aktivacije (u fazi mirovanja elija) ne vrede nita. U stvari, sam OCl- ulazi u reakciju sa DNK da bi formirao oksidizovane baze i halogenizovane baze. Ponaanje peracetne kiseline slino je ponaanju NaClO, sa genotoksinim efektima izazvanim jedino u fazi mirovanja elija. Zaista, u vodenom rastvoru ona reaguje i tako nastaje, zajedno sa acetnom kiselinom, hidrogen peroksidom, jedinjenje koje moe da nanese direktno oteenje na DNK. Odsustvo efekata na logaritamske elije gljivica moglo bi se objasniti udnim metabolizmom koji imaju gljivice. Tokom disanja, mitohondrije su primarni izvori reaktivnih vrsta kiseonika u elijama, pod uslovom da je respiratorni lanac mitohondrije endogeni izvor reaktivnih vrsta kiseonika. Meutim, S.cerevisiae iz 20% glukoze dobijaju svoje zalihe energije preko fermentacije, i zbog toga mogu koristiti antioksidantne mehanizme za detoksifikaciju oksidantnih ksenobiotika. S druge strane, genotoksinost ClO2 kod S.cerevisiae utvrena je samo sa endogenom metabolikom aktivacijom ( u fazi rasta elija). Pronaeno je da hlor dioksid poveava reverznu mutaciju kod S.typhimurium sa aktivacijom. Meutim, vodeni uzorci dezinfikovani hlor dioksidom ne izazivaju reverzne mutacije kod S.typhimurium sa ili bez aktivacije. tavie, studije ogleda sa Salmonella mikrozomom sa ClO2, ogleda sa produktima reakcija sa nekim peptidima ( Laspartyl-L-fenilalanin metil estar, npr aspartam, L-glicil-L-triptofan i L-triptofil glicin) i amino kiselinama ( hidroksiprolin i tirozin) pokazuju mutagenu aktivnost u prisustvu i odsusutvu jetre pacova S9 mix. Ovi podaci su nesigurni i stoga je mehanizme delovanja ClO2 nemogue potpuno razumeti. Peracetna kiselina je negativna u ogledu respiratorne deficijencije i kod statinih i kod logaritamskih elija, uprkos velikoj reakciji mitohondrijske DNK. tavie, podaci pokazuju da tretman sa ClO2 izaziva samo blago poveanje u mutiranim elijama respiratorne deficijencije (P<0.05), dok je efekat odgovora na dozu jasan kod elija tretiranih NaClO. Svi dezinfektanti reaguju kao oksidansi, ali halogenizovana jedinjenja kao to su 8-hloradenin i 4-N-hlorocitozin su takoe pronaeni posle izloenosti OCl-. Efikasnost NaClO na mitohondrijsku DNK mogla bi biti se javljati uglavnom usled proizvodnje halogenatnih baza dok se oksidativno oteenje moe delimino (ClO2) ili potpuno (PAA) spreiti visoko aktivnim mitohondrijskim odbrambenim mehanizmima protiv vrsta koje reaguju na kiseonik kod gljivica, ukljuujui Mn superoksid dismutazu, citohrom c peroksidazu i glutation peroksidazu. DNK oteenje, izmereno Comet ogledom na humanim leukocitima nakon 1 sata tretmana, pokazuje da su sva tri dezinfektanta u stanju da izazovu genotoksinost ( 0.5 p.p.m. bila je najmanja efikasna doza za NaClO i peracetnu kiselinu a 0.2 p.p.m. za ClO2). Iako je poveanje u migraciji DNK malo, merei direktno krajnju taku kao to je DNK oteenje, vrednosti efikasnih doza su nie u ovom testu i u spektru koncentracija koje se koriste za dezinfekciju vode. Razliita osetljivost sa sve tri ispitane komponente pronaena u Comet ogledu relativna je u odnosu na testove na gljivicama, sa veoma velikim razlikama (> od 50 puta) u najmanjoj efikasnoj dozi. Izbor krajnje take je odluujui korak u studijama genotoksinosti , analizama efikasnih doza i procenama graninih vrednosti. Nekoliko faktora, kao to su biodostupnost, metabolika aktivacija/inaktivacija, DNK obnavljanje, apoptoza i preivljavanje elija mogu izmeniti krajnji efekat na analiziranom nivou krajnje take. Ovi koncepti su oigledni u poreenju Comet ogleda, jednostavnog sistema kod koga krajnje take odgovaraju ciljnim (DNK oteenje), sa S.cerevisiae testom,

kod koga je krajnja taka zatvorena ali ipak razliita od ciljne (takasta mutacija, konverzija gena i mitohondrijska promena). Comet ogled je osetljiviji nego test gljivica, verovatno zbog prisusutva elijskog zida kod gljivica, koji moda titi eliju tako to inhibira prihvatanje jedinjenja koja se testiraju. S druge strane, bioloka efikasnost ova tri dezinfekciona sredstva na S.cerevisiae pokazala se da strogo zavisi od specifinih elijskih fiziolokih i biohemijskih uslova. Podaci dobijeni iz razliitih biotestova daju bolji i iri genotoksikoloki profil analiziranih jedinjenja. Ako uporedimo sve rezultate ove studije, sva jedinjenja utiu na DNK a potencijalni alternativni dezinfektant peracetna kiselina pokazuje efikasnost slinu natrijum hipohloritu i hlor dioksidu. U ovom prvom delu istraivanja dolo se do rezultata prouavanja genotoksinosti istih jedinjenja. Studija o genotoksinim efektima nus-proizvoda koje potencijalno mogu izazvati ova tri dezinfektanta kada se pomeaju sa huminskom kiselinom, je u toku.