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J Fr. Ophtalmol., 2005; 28, 7, 691-698 Masson, Paris, 2005.

ARTICLE ORIGINAL

Microscopie confocale et pathologies de la surface oculaire : corrlations anatomo-cliniques


R. De Nicola, A. Labb, N. Amar, B. Dupas, C. Baudouin
Service dOphthalmologie III, Centre Hospitalier National dOphtalmologie des Quinze-Vingts, INSERM U598, UFR Paris-Ile de France Ouest. Correspondance : C. Baudouin, Service dOphthalmologie III, CHNO des Quinze-Vingts, 28, rue de Charenton, 75012 Paris. E-mail : baudouin@quinze-vingts.fr Reu le 20 janvier 2005. Accept le 10 mars 2005. In vivo confocal microscopy and ocular surface diseases: anatomical-clinical correlations R. De Nicola, A. Labb, N. Amar, B. Dupas, C. Baudouin J. Fr. Ophtalmol., 2005; 28; 7: 691-698
Purpose: To describe corneal and conjunctival epithelial changes in various ocular surface disorders with a new in vivo confocal microscope (Corneal HRT II module) and to compare these results with those obtained by immunohistology on impression cytology specimens. Methods: In this study, we investigated 36 eyes of 18 patients with ocular surface diseases such as corneal epitheliopathy induced by ocular rosacea (five patients), keratoconjunctivitis sicca related to tear evaporative condition in Meibomian gland dysfunction (eight patients), or tear-deficient dry eye in Sjgrens syndrome (five patients). In vivo confocal microscopy imaging (Heidelberg Retina Tomograph II Rostock Cornea Module) and impression cytology of the cornea and/or conjunctiva were performed. The images were analyzed for epithelial cell morphology at nuclear and cytoplasmic levels, in the cornea and the conjunctiva, number of goblet cells and their possible presence within the corneal epithelium, corneoconjunctival junction at the limbus, and density and presence of inflammatory cells within both epithelia. Results: Images obtained consisted of two-dimensional 400400m optical sections oriented parallel to the surface of the eye and compared with impression cytology. Conjunctival and corneal epithelia showed dramatic changes in ocular surface disease. In keratoconjunctivitis sicca, we found squamous metaplasia, inflammatory cell infiltration, goblet cell depletion, as well as a nuclear snake-like chromatin pattern. In rosacea associated with corneal epitheliopathy, a corneal conjunctivalization (goblet cells together with conjunctival epithelial cells within the corneal epithelium layer) was found. The images provided by this technique are in excellent correlation with the findings using impression cytology. Conclusion: The HRT II in vivo confocal microscope facilitates the study of both central and peripheral ocular surface epithelia compared to first-generation confocal microscopy devices. In vivo confocal microscopy, showing corneal and conjunctival epithelial structures in the live eye at the cellular level, is likely to open up a new promising way to investigate ocular surface involvement in complex diseases, providing a new insight on corneal and conjunctival disorders in the future.

INTRODUCTION
Lexamen des structures oculaires lchelon cellulaire a longtemps repos sur des mthodes de recherche exprimentale ou applique, ex vivo partir de prlvements oculaires, ou in vitro, sur des cultures cellulaires. Nous disposons aujourdhui dune technique rcente, la microscopie confocale, qui permet une tude in vivo des structures de la surface oculaire. Son principe, dcrit initialement par Minski en 1957, repose sur la focalisation de la lumire incidente du microscope dans le plan focal de la lentille de lobjectif. On obtient ainsi des images de haute rsolution dans les trois plans de lespace : images latrales (x, y rsolution : 1 2 m) ; images axiales (z rsolution : 5 m) [1]. Utilise initialement en biologie dans le cadre de la recherche, son champ dapplication sest largi depuis quelques annes vers le domaine clinique, en particulier celui de lOphtalmologie, avec lapparition dans les annes 90 des premires gnrations de microscopie confocale cornenne in vivo [2]. Les dveloppements actuels de cette technique ont dmontr que cet examen peut dsormais tre considr comme un outil performant pour le diagnostic et le suivi de pathologies de surface aussi diverses que les kratites infectieuses

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Key-words: Confocal microscopy, HRT, impression cytology, keratoconjunctivitis sicca, ocular rosacea, stem cell deficiency. Microscopie confocale et pathologies de la surface oculaire : corrlations anatomo-cliniques
Objectifs : tudier la prcision anatomo-clinique des atteintes pithliales corno-conjonctivales au cours de diverses pathologies de la surface oculaire analyses in vivo laide dun microscope confocal de nouvelle gnration (Heidelberg Retina Tomograph II [HRT] Rostock Cornea Module), et comparer ces rsultats avec ceux obtenus en immunocytochimie sur empreinte cornenne ou conjonctivale.

R. De Nicola et coll.

J. Fr. Ophtalmol.

Patients et mthodes : Trente-six yeux de 18 patients, prsentant des pathologies de la surface oculaire diagnostiques cliniquement, ont t examins : pithliopathie cornenne secondaire une rosace oculaire (5 patients) ; syndromes secs par dficit lacrymal dans le cadre dun syndrome de Gougerot-Sjgren (5 patients), ou par hypervaporation secondaire un dysfonctionnement meibomien (8 patients). Les 18 patients ont bnfici dune tude au biomicroscope, au microscope confocal puis dune empreinte cornenne et/ou conjonctivale ralise sur le mme site dexamen. Les paramtres au cours de cette tude ont inclus au niveau cornen et conjonctival : la morphologie pithliale lchelle cellulaire ; la densit en cellules mucus et leur ventuelle prsence dans lpithlium cornen ou au limbe ; la prsence et la densit de cellules inflammatoires. Rsultats : Le microscope confocal a permis de raliser in vivo des coupes optiques de haute rsolution de toute la surface oculaire. Cet examen a objectiv, une chelle cellulaire, les modifications importantes de la surface oculaire lors des kratoconjonctivites sches, confirmant la perte en cellules mucus, la mtaplasie squameuse pithliale, les infiltrations de cellules inflammatoires et, mme dans certains cas, laspect de snakelike chromatin dcrit jusqualors uniquement en histologie. Au cours des pithliopathies cornennes secondaires une rosace oculaire, la conjonctivalisation de la couche cornenne pithliale pouvait tre bien identifie avec la prsence de cellules mucus et de cellules morphologiquement proches de lpithlium conjonctival envahissant un pithlium cornen mtaplasique. Lanalyse comparative entre les images obtenues in vivo avec cet appareil et in vitro par immunocytochimie sur empreinte corno-conjonctivale a mis en vidence une excellente corrlation anatomo-clinique dans chaque cas. Conclusion : La microscopie confocale HRT II in vivo permet ltude prcise de la corne centrale, du limbe et de la conjonctive, contrairement aux premires gnrations dappareils. Les images ralises avec cet examen dans le cadre des pathologies de la surface oculaire prsentent une excellente corrlation anatomo-clinique. Ce strict reflet de larchitecture cellulaire, dmontr in vitro sur empreintes corno-conjonctivales, valide la qualit de rsolution du microscope confocal et confirme le potentiel extrmement prometteur de cette nouvelle technique dexploration.

Mots-cls : Microscopie confocale, empreintes conjonctivales, kratoconjonctivite sche, rosace oculaire, dficit en cellules souches limbiques.

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[3-5], les dystrophies de corne [6, 7], les pathologies dgnratives ou de surcharge [8], le suivi de la chirurgie rfractive [9], du port de lentilles de contact [10], ou de la chirurgie du glaucome [11]. Toutefois, les microscopes confocaux utiliss initialement ne permettaient quun examen de la corne centrale. Les progrs apports ces dernires annes dans linstrumentation autorisent aujourdhui un examen prcis du limbe et de la conjonctive, structures cibles au cours de processus pathologiques de types inflammatoires, toxiques ou dgnratifs. Nous prsentons dans cet article les rsultats obtenus sur une srie de patients dont latteinte de la surface oculaire a t analyse successivement in vivo par microscopie confocale et in vitro sur empreintes conjonctivales. Le but de cette tude tait de mettre en vidence une corrlation anatomo-clinique entre les images cellulaires obtenues au microscope confocal et celles, histologiques, observes sur les empreintes conjonctivales tudies par immunocytochimie et microscopie confocale.

Appareillage
Nous avons utilis le module cornen du Heidelberg Retina Tomograph II, le HRT Rostock Cornea Module (Heidelberg Engineering GmbH, Germany). Les images obtenues avec ce nouveau microscope confocal laser in vivo couvrent une surface de 400 m x 400 m, soit 384 x 384 pixels ; la rsolution optique thorique est de 2 m en longitudinal et 4 m en transversal. La source laser est un laser diode dont la longueur donde est 670 nm. Lappareil fournit galement la distance focale de limage obtenue, ce qui permet de dterminer la profondeur de la coupe observe, exprime en microns. Lajustement de lacquisition des images est contrl par une camra CCD (480 x 460 pixels, RGB, 15 images/s) place sur le ct de lappareil, donnant une image latrale de lil du patient. Avant de raliser lexamen, une goutte doxybuprocane 0,04 % et de Lacrigel (Europhta, Monaco) tait instille dans lil du patient. Une zone dtude tait slectionne au niveau de la surface oculaire ; dans cette rgion, plusieurs images de la conjonctive, du limbe et de la corne taient prises avec le HRT et une empreinte conjonctivale et/ou cornenne ralise selon les circonstances cliniques. Le mme protocole tait appliqu pour chaque patient.

PATIENTS ET MTHODES
Population tudie
Cette tude prliminaire a port sur 18 patients prsentant diffrentes pathologies de la surface oculaire : pithliopathie cornenne secondaire une rosace oculaire (5 patients) ; syndromes secs par dficit lacrymal dans le cadre dun syndrome de Gougerot-Sjgren (5 patients), ou par hypervaporation secondaire un dysfonctionnement meibomien (8 patients). Pralablement lexamen, une explication claire sur lintrt du prlvement et de la technique a t donne tous les patients afin dobtenir leur consentement clair.

Mthodes immunocytologiques
Technique de lempreinte conjonctivale
Aprs anesthsie topique par oxybuprocane 0,04 %, des empreintes ont t ralises en appliquant, sans pression, sur la conjonctive bulbaire suprieure, des filtres de polyther sulfone coups en deux (Supor pores de 0,2 m, Gelman Sciences, USA) ; les filtres taient immdiatement retirs, le soulvement de la conjonctive traduisant une bonne adhrence cellulaire. La qualit du prlvement tait vrifie en observant les cellules col-

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lectes jour frisant sur les membranes. Tout prlvement non recouvert sur plus de 50 % de sa surface tait complt par une nouvelle empreinte dans une autre rgion de la conjonctive. Les filtres ont ensuite t conservs au sec temprature ambiante dans lattente de limmunomarquage [12, 13].

Technique de lempreinte cornenne


Lempreinte cornenne tait ralise au niveau du limbe suprieur et de la corne adjacente ; la technique utilise tait identique celle de lempreinte conjonctivale.

Immunomarquage des empreintes


Les cellules pithliales ont t pralablement fixes pendant 10 minutes au paraformaldhyde 0,5 %, puis rinces laide dun tampon phosphate (PBS, pH 7,2). Les membranes cellulaires ont alors t permabilises laide dune solution de Triton X100 (Sigma) dilue 0,1 %, pendant 5 minutes. Aprs rinage au PBS, les filtres taient incubs temprature ambiante pendant une heure avec de la phallodine conjugue lAlexa 488 (200 UI/ml, Molecular Probes, dilution 1:50), de manire colorer lactine intracellulaire, ou avec un anticorps primaire dirig contre la vimentine (anticorps monoclonal de souris type IgG Dako SA, dilution 1/100). Pour ce dernier marqueur, les cellules ont ensuite t laves deux fois au PBS, puis incubes avec lanticorps secondaire pendant une heure labri de la lumire (immunoglobuline de chvre anti-IgG de souris conjugue Alexa 488, Dako SA, dilution 1/1000). Deux nouveaux rinages au PBS taient effectus, puis les noyaux cellulaires taient rvls par une coloration liodure de propidium (Immunotech, Marseille). Les filtres taient finalement disposs entre lame et lamelle aprs adjonction dune goutte de milieu de montage (Vectashield H1000, Vector Laboratories, Burlingame) puis analyss au microscope confocal directement sur la membrane (Nikon PCM 2000).

squameuse, identifiables par leur grande taille et leurs noyaux hyper-rflectifs. Leur morphologie tait superposable celle des empreintes conjonctivales. La conjonctivalisation de la corne tait bien mise en vidence sur les images (fig. 2b) o se ctoyaient des cellules cornennes normales identifiables par leur petite taille, leur aspect sombre et group et un envahissement cornen par les cellules conjonctivales comme le prouvait la prsence de mucocytes. Une empreinte corno-conjonctivale ralise dans plusieurs cas au limbe (fig. 3) rvlait la transition entre lpithlium conjonctival pathologique dbordant sur la corne et les cellules cornennes normales. La frontire entre ces deux structures tait aisment reconnaissable par la diffrence de taille et labsence de mtaplasie au niveau de lpithlium cornen sain rsiduel.

Syndromes secs
Au cours des syndromes de Gougerot-Sjgren compliqus de kratite filamenteuse (fig. 4), lempreinte conjonctivale a montr une richesse importante en cellules pithliales, qui apparaissaient trs irrgulires et en mtaplasie squameuse, avec une paucicellularit en cellules mucus (fig. 5a). Lexamen au microscope confocal (fig. 5b) retrouvait cette anisocytose avec des cellules bien identifiables par leurs bords et leurs noyaux rfringents, dont laspect tait superposable celui observ en immunocytochimie. Par ailleurs, au cours du mme examen, nous avons pu mettre en vidence au niveau des cellules pithliales la prsence de chromatine en forme de serpent ( snake like chromatin ) (fig. 6a), aspect nuclaire vocateur mais non spcifique observ au cours des scheresses oculaires svres. La figure 6b montre un exemple de cette conformation nuclaire ex vivo par des techniques de colorations histologiques classiques, nous permettant de comparer et de corrler cette structure avec lobservation in vivo au microscope confocal. Nous avons galement examin des patients atteints de syndromes secs par dficit lacrymal qualitatif sur dysfonctionnement meibomien. Lempreinte conjonctivale (fig. 7a) a permis dobserver un tapis cellulaire riche, rgulier avec des cellules mucus nombreuses et bien identifiables : cellules rondes cytoplasme clair (immunomarquage la phallodine) et charg en mucus, avec un noyau de petite taille excentr en priphrie. Laspect en microscopie confocale de ces cellules tait similaire au sein du tapis cellulaire pithlial (fig. 7b) avec toutefois un cytoplasme trs rfringent, masquant les dtails nuclaires. Lultrastructure du mucocyte et sa richesse en mucines rendaient probablement compte de lhyper-rflectivit observe avec cet appareil.

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RSULTATS
pithliopathie cornenne au cours des rosaces oculaires
Sur lempreinte conjonctivale avec immunomarquage la phallodine (fig. 1a), nous avons observ de nombreuses cellules pithliales de grande taille, polydriques, en mtaplasie squameuse (diminution du rapport nuclocytoplasmique et aspect en feuille morte ). Nous avons retrouv de mme sur lempreinte cornenne (fig. 1b) des cellules isoles, dallure conjonctivale en pleine desquamation, associes dans tous les cas des mucocytes, ce qui traduisait une conjonctivalisation pithliale de la corne. Lanalyse au microscope confocal (fig. 2a) montrait galement des cellules conjonctivales en mtaplasie

DISCUSSION
La microscopie confocale est une technique rcente dimagerie permettant lexamen microscopique de la

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Figure 1 : pithliopathie cornenne au cours dune rosace oculaire. Immunomarquage la phallodine du cytosquelette (fluorescence verte) des cellules pithliales. a) Empreinte conjonctivale : cellules pithliales conjonctivales polydriques, en mtaplasie squameuse. b) Empreinte cornenne : cellules pithliales cornennes dallure identique lempreinte conjonctivale traduisant une conjonctivalisation de la corne. Figure 2 : pithliopathie cornenne chez le mme patient examin en microscopie confocale cornenne in vivo (400 m 400 m) : conjonctivalisation avec prsence de cellules conjonctivales de grande taille, polydriques, en mtaplasie squameuse franchissant le limbe avec invasion cornenne. Les cellules cornennes normales sont identifiables par leur aspect plus sombre et leur petite taille.

surface oculaire. Cet examen dont la finesse de rsolution est de 2 5 m constitue un moyen dtude in vivo rapide et non invasif. Son innocuit et son utilit ont t dmontres dans lanalyse des structures cornennes au

cours de diffrentes affections telles que les dystrophies [6, 7], les pathologies de surcharge [8], les syndromes irido-corno-endothliaux [14], les modifications stromales aprs LASIK [9] et les modifications induites par

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Figure 3 : pithliopathie cornenne au cours dune rosace oculaire (mme patient). Empreinte corno-conjonctivale ralise au limbe. Immunomarquage la phallodine : identification de la transition entre lpithlium conjonctival pathologique dbordant sur la corne et les cellules cornennes normales. La frontire entre ces deux structures est aisment reconnaissable par la diffrence de taille et labsence de mtaplasie au niveau de lpithlium cornen sain rsiduel. Figure 4 : Syndrome de Gougerot-Sjgren. Kratoconjonctivite sche primaire avec kratite filamenteuse.

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le port de lentilles de contact [10]. Au cours des kratites infectieuses, la microscopie confocale a montr sa supriorit par rapport lexamen biomicroscopique, notamment dans la dtection des kystes dacanthamoeba lors des kratites amibiennes ou des filaments lors des kratomycoses [15]. Les avantages que prsente cet examen en font, notre point de vue, un outil privilgi dans la prise en charge diagnostique et thrapeutique des pathologies cornennes. Les premiers microscopes confocaux utiliss ne permettaient cependant quun examen de la corne centrale ; aussi ne trouve-t-on que peu de publications concernant la conjonctive et le limbe selon cette technique. Dans la prsente tude, lutilisation dun appareil moderne plus performant nous a permis lanalyse de deux pathologies qui, peu illustres ce jour, affectent ces deux structures : lpithliopathie induite par une rosace oculaire, impliquant une conjonctivalisation cornenne par dficit fonctionnel en cellules limbiques, et la kratoconjonctivite sche. En complment lanalyse au microscope confocal, nous avons choisi deffectuer une empreinte conjonctivale car la technique que nous avons dveloppe, grce limmunomarquage et lexamen direct de la membrane en microscopie confocale [12, 13] permet ltude histologique dun tapis cellulaire homogne tout en prservant son architecture et ses liaisons intercellulaires : la couche cellulaire tudie correspond alors exactement

celle prleve sur lil ; elle reprsente donc une image en miroir de ltat de la surface oculaire au niveau du prlvement. Limmunofluorescence effectue directement sur cette membrane permet de diffrencier les cellules pithliales proprement dites, des cellules mucus et des cellules dendritiques de Langerhans, effectrices de la rponse immunitaire locale. De plus, cette technique, ventuellement complte par la cytofluorimtrie en flux, permet une dtermination et une quantification prcises des populations cellulaires recrutes, ainsi que celle de certains marqueurs associs linflammation qui peuvent tre prsents soit la surface (HLA-DR), soit dans le cytoplasme des cellules (IL-6, IL-8) [16, 17]. Cette procdure in vitro prsente donc de nombreux avantages : elle est reproductible, fiable, standardise, rapide et indolore. Ainsi, les images obtenues in vivo avec le microscope confocal et in vitro avec les empreintes en immunocytochimie peuvent tre analyses, stockes et compares sur la base de critres objectifs. Nous avons pu mettre en vidence au cours de cette analyse comparative la corrlation anatomique troite qui existe entre les images obtenues in vivo avec le microscope confocal et in vitro avec les empreintes corno-conjonctivales. Lors des dficits en cellules souches limbiques, le microscope confocal permet de documenter, de manire prcise et superposable aux observations in vitro, les altrations morphologiques cellulaires

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Figure 5 : Syndrome de Gougerot-Sjgren (mme patiente que sur la figure 4). a) Empreinte conjonctivale et immunomarquage la phallodine : cellules pithliales trs irrgulires, mtaplasiques et cellules mucus absentes. b) Images de microscopie confocale conjonctivale in vivo (400 m 400 m) : aspect morphologique cellulaire superposable celui des empreintes. Figure 6 : Syndrome de Gougerot-Sjgren. a) Images de microscopie confocale conjonctivale in vivo (400 m 400 m) : identification de snakelike chromatin dans les cellules pithliales conjonctivales. b) Aspect histologique de snake-like chromatin .

de la surface oculaire avec notamment la conjonctivalisation pathologique de la corne, caractristique retrouve au cours de cette affection [18]. En ce qui

concerne les kratoconjonctivites sches, le microscope confocal a permis danalyser le degr de mtaplasie squameuse, en valuant lapparence des cellules pi-

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Figure 7 : Syndrome sec secondaire par dficit lacrymal qualitatif sur dysfonctionnement meibomien. a) Empreinte conjonctivale et immunomarquage la phallodine : identification des cellules mucus (cellules rondes, cytoplasme sombre et noyau excentr en priphrie). b) Images de microscopie confocale conjonctivale in vivo (400 m 400 m) : identification des cellules mucus dont les cytoplasmes apparaissent hyper-rflectifs.

thliales et la densit en cellules mucus. La comparaison de ces images avec celles obtenues in vitro nous a permis de confirmer leur prcision. Par ailleurs, ces deux lments cytologiques reprsentent les critres de classification des syndromes secs sur empreinte proposs par Nelson [19, 20]. Il apparat donc quune classification prcise et non invasive des kratoconjonctivites sches peut dsormais tre ralise au microscope confocal in vivo sans avoir obligatoirement recours lempreinte conjonctivale. De plus, nous avons pu identifier des cellules pithliales contenant une chromatine en forme de serpent (snake-like chromatin) dont la prsence est une caractristique particulirement vocatrice, quoique non spcifique, des scheresses oculaires svres [21]. notre connaissance, il sagit de la premire description in vivo de cette structure fine, intranuclaire, grce lutilisation de ce type dinstrument, cest--dire sans recourir un prlvement histopathologique. Cette tude avait pour objectif de savoir si une technique in vivo la microscopie confocale pouvait conduire des rsultats comparables ceux obtenus par la mthode de rfrence in vitro lempreinte corno-conjonctivale. Les rsultats obtenus, montrant lexcellente corrlation anatomo-clinique entre les deux techniques, nous conduisent valider cet examen comme outil diagnostique in vivo pour lanalyse morphologique de la surface oculaire et de ses pathologies. Son avenir semble donc prometteur dans ce domaine dinvestigation.

Actuellement, de nombreux travaux sont en cours concernant lextension de ses indications en dehors de lanalyse cornenne dans les domaines des pathologies infectieuses, dystrophiques ou aprs chirurgie rfractive. Une tude rcente ralise dans le cadre de la chirurgie du glaucome montre que lanalyse de la bulle de filtration au microscope confocal permet dtablir des critres dvaluation prcis de la cicatrisation conjonctivale, prdictifs de son fonctionnement long terme [11]. Ceci suggre, outre une meilleure comprhension physiopathologique des phnomnes cicatriciels, lintrt de cet examen pour la surveillance thrapeutique des patients oprs. Les limites actuelles du microscope confocal sont constitues par labsence didentification prcise du phnotype cellulaire, comme peut le faire une analyse en immunomarquage. En effet cette tude est fonde sur lanalyse de critres purement morphologiques que nous avons corrls dun point de vue anatomique grce la technique dempreinte conjonctivale. Les similitudes importantes entre les aspects obtenus par les deux techniques montrent toute la valeur de la microscopie confocale in vivo. Toutefois, nous ne pouvons tablir de manire formelle la nature exacte des populations cellulaires tudies. Ceci est notamment le cas en ce qui concerne la conjonctivalisation pathologique de la corne dans les dficits en cellules souches limbiques : Estce que les cellules de morphotype conjonctival observes in vivo et in vitro sur la corne reprsentent bien des lments conjonctivaux ayant migr secondairement sur

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2. Masters BR, Bohnke M. Confocal microscopy of the human cornea in vivo. Int Ophthalmol, 2001;23:199-206. 3. Cavanagh HD, McCulley JP. In vivo confocal microscopy and Acanthamoeba keratitis. Am J Ophthalmol, 1996;121:207-8. 4. Rosenberg ME, Tervo TM, Muller LJ, Moilanen JA, Vesaluoma MH. In vivo confocal microscopy after herpes keratitis. Cornea, 2002;21:265-9. 5. Winchester K, Mathers WD, Sutphin JE. Diagnosis of Aspergillus keratitis in vivo with confocal microscopy. Cornea, 1997;16:27-31. 6. Werner LP, Werner L, Dighiero P, Legeais JM, Renard G. Confocal microscopy in Bowman and stromal corneal dystrophies. Ophthalmology, 1999;106:1697-704. 7. Hernandez-Quintela E, Mayer F, Dighiero P, Briat B, Savoldelli M, Legeais JM et al. Confocal microscopy of cystic disorders of the corneal epithelium. Ophthalmology, 1998;105:631-6. 8. Ciancaglini M, Carpineto P, Zuppardi E, Nubile M, Doronzo E, Mastropasqua L. In vivo confocal microscopy of patients with amiodarone-induced keratopathy. Cornea, 2001;20:368-73. 9. Pisella PJ, Auzerie O, Bokobza Y, Debbasch C, Baudouin C. Evaluation of corneal stromal changes in vivo after laser in situ keratomileusis with confocal microscopy. Ophthalmology, 2001;108:174450. 10. Patel SV, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. Confocal microscopy in vivo in corneas of long-term contact lens wearers. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002;43:995-1003. 11. Labb A, Dupas B, Hamard P, Baudouin C. tude en microscopie confocale in vivo des bulles de filtration aprs chirurgie du glaucome. J Fr Ophtalmol, 2004;27:1083-9. 12. Pisella PJ, Brignole F, Debbasch C, Lozato PA, Creuzot-Garcher C, Bara J et al. Flow cytometric analysis of conjunctival epithelium in ocular rosacea and keratoconjunctivitis sicca. Ophthalmology, 2000;107:1841-9. 13. Brignole-Baudouin F, Ott AC, Warnet JM, Baudouin C. Flow cytometry in conjunctival impression cytology: a new tool for exploring ocular surface pathologies. Exp Eye Res, 2004;78:473-81. 14. Grupcheva CN, McGhee CN, Dean S, Craig JP. In vivo confocal microscopic characteristics of iridocorneal endothelial syndrome. Clin Experiment Ophthalmol, 2004;32:275-83. 15. Kaufman SC, Musch DC, Belin MW, Cohen EJ, Meisler DM, Reinhart WJ et al. Confocal microscopy: a report by the American Academy of Ophthalmology. Ophthalmology, 2004;111:396-406. 16. Baudouin C, Brignole F, Becquet F, Pisella PJ, Goguel A. Flow cytometry in impression cytology specimens. A new method for evaluation of conjunctival inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997;38:1458-64. 17. Baudouin C, Hamard P, Liang H, Creuzot-Garcher C, Bensoussan L, Brignole F. Conjunctival epithelial cell expression of interleukins and inflammatory markers in glaucoma patients treated over the long term. Ophthalmology, 2004;111:2186-92. 18. Gatinel D, Hoang-Xuan T. Le dficit en cellules souches limbiques. J Fr Ophtalmol, 2000;23:718-28. 19. Nelson JD, Wright JC. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol, 1984;102:1049-51. 20. Nelson JD. Impression cytology. Cornea, 1988;7:71-81. 21. Knop E, Reale E. Fine structure and significance of snakelike chromatin in conjunctival epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994;35:711-9. 22. Elder MJ, Hiscott P, Dart JK. Intermediate filament expression by normal and diseased human corneal epithelium. Hum Pathol, 1997;28:1348-54.

le versant cornen ? Nous pouvons galement mettre lhypothse que ces cellules sont dorigine cornenne et quelles ont subi une mtaplasie secondaire in situ sous linfluence de facteurs environnementaux pathologiques. La mme question peut se poser pour les kratoconjonctivites sches o laspect mtaplasique des cellules cornennes les rend morphologiquement trs voisines des cellules conjonctivales. Lutilisation de marqueurs spcifiques sur les empreintes, tels que certaines cytokratines [22], nous permettra de prciser les phnotypes exacts cornen ou conjonctival par immunofluorescence des cellules cornennes dans ces pathologies. Lors de cette tude, nous nous sommes concentrs sur laspect architectural en utilisant des anticorps dirigs contre le cytosquelette des diffrentes populations cellulaires. Ceci est li au fait que nous ne pouvons utiliser que deux ou trois marqueurs au maximum par prlvement, ce qui rend la technique des empreintes dlicate et en limite les informations. Une analyse prospective, portant sur un nombre suffisant de patients et en utilisant ces marqueurs plus spcifiques, est en cours, qui devrait nous permettre de prciser et de conforter ces premiers rsultats.

CONCLUSION
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La microscopie confocale de nouvelle gnration est une mthode in vivo non invasive et rapide. Les images obtenues grce son haut pouvoir de rsolution sont excellentes. Aussi, lensemble de ses qualits rend cet examen incontournable pour ltude physiopathologique des atteintes de la surface oculaire. Les rsultats que nous avons obtenus prouvent que les images ralises avec cet examen dans le cadre des pathologies de la surface oculaire refltent bien larchitecture cellulaire observe in vitro sur empreintes corno-conjonctivales. Cette excellente corrlation anatomo-clinique confirme lintrt majeur de la microscopie confocale pour ltude morphologique prcise des structures cellulaires conjonctivales, limbiques et cornennes. Cet outil ouvre des perspectives de recherche diagnostiques et thrapeutiques extrmement prometteuses.

RFRENCES
1. Jalbert I, Stapleton F, Papas E, Sweeney DF, Coroneo M. In vivo confocal microscopy of the human cornea. Br J Ophthalmol, 2003;87:225-36.