Salmonella and Salmonellosis

Abstract book
27 - 28 - 29 May 2013

Saint-Malo
FRANCE
 This symposium is arranged by:

French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety (ANSES),
French Institute for Public Health Surveillance (InVS),
French National Institute for Agricultural Research (INRA),
Institut Pasteur,
High Institute for Animal Production and Agro-Business (ISPAIA)
and ZOOPOLE.

Chairman: Pierre Colin - UBO Brest - France

Secretary-Treasurer: Geneviève Clément - ISPAIA-ZOOPOLE Développement - Ploufragan – France

Scientific Committee Organising Committee

Jean-Christophe AUGUSTIN (France) Anne Brisabois – ANSES Maisons Alfort

Anne BRISABOIS (France)
Marianne CHEMALY (France)
Axel CLOECKAERT (France)
Rob DAVIES ( United Kingdom)
Rene HENDRIKSEN (Denmark)
Michael HENSEL – (Germany)
Nathalie JOURDAN DA SILVA (France)
Bob TAUXE (USA)
Nicholas THOMSON – (United Kingdom)
Philippe VELGE (France)
Pierre WATTIAU (Belgium)
François Xavier WEILL (France)
Marcel ZWIETERING (the Netherlands)
Marianne Chemaly – ANSES Ploufragan
Axel Cloeckaert – INRA Nouzilly
Réjane Deluce – ISPAIA -ZOOPOLE Dév. Ploufragan
Nathalie Jourdan Da Silva – InVS
Renaud Lailler – ANSES Maisons Alfort
Simon Le Hello - Institut Pasteur
Gilles Salvat - ANSES Ploufragan
Véronique Vaillant - InVS
Philippe Velge - INRA Nouzilly
François-Xavier Weill – Institut Pasteur

Proceedings edited by:

Pierre COLIN
Geneviève CLEMENT
© 2013 by ZOOPOLE développement - ISPAIA

SYMPOSIUM SECRETARIAT
ISPAIA – BP 7 – 22440 PLOUFRAGAN – France
Tel. +33 2 96 78 61 30 - Fax; +33 2 96 78 61 31
ispaia@zoopole.asso.fr - www.zoopole.asso.fr
 Salmonella and Salmonellosis 2013

Massive parallel sequencing identify  
Salmonella single‐nucleotide polymorphism (SNP) markers  
for host origin and antimicrobial resistance 
Min YUE1, Robert SCHMIEDER2, Jeff WASHELESKI3, Shaohua ZHAO4, 
Robert A. EDWARDS2,5, George P. FRASER3, Patrick F. MCDERMOTT4, Shelley C. RANKIN1  
and Dieter M. SCHIFFERLI1, * 
1
Department of Pathobiology, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania,  
Philadelphia, PENNSYLVANIA, USA; 
2
Department of Computer Science, College of Sciences, San Diego State University, 
SAN DIEGO, California, USA; 
3
Pennsylvania Department of Health, Bureau of Laboratories, Exton, PENNSYLVANIA, USA; 
4
Division of Animal and Food Microbiology, Office of Research, Center for Veterinary Medicine, 
U.S. Food and Drug Administration, LAUREL, Maryland, USA; 
5
Mathematics and Computer Science Division, Argonne National Laboratory, 
ARGONNE, Illinois, USA 

INTRODUCTION 
Salmonella enterica serovars form a group of pathogens that differ widely in their host range within 
mammals and other animals (4). The more than 2,600 different serovars can be subdivided into three 
groups  on  the  basis  of  host  prevalence.  The  first  group  consists  of  host‐restricted  serovars.  These 
typically cause systemic disease in a limited number of phylogenetically related species. For example, 
S. Typhi and Gallinarum are almost exclusively associated with systemic disease in humans and fowl, 
respectively. The second group includes host‐adapted strains. These are primarily associated with one 
or  two  closely  related  host  species  but  may  also  infrequently  cause  disease  in  other  hosts.  For 
example,  S.  Dublin  and  Choleraesuis  are  generally  associated  with  severe  systemic  disease  in 
ruminants  and  pigs  respectively.  The  third  group  comprises  broad  range  colonizers,  such  as  S. 
Typhimurium  that  usually  induce  gastroenteritis  in  a  variety  of  unrelated  host  species,  including 
humans, livestock, wild mammals and birds. However, even these serovars demonstrate specificity by 
behaving  differently  in  distinct  hosts,  S.  Typhimurium  causing  a  systemic  disease  in  rodents. 
Moreover, some strains of S. Typhimurium variants have a narrow host range, while others are clearly 
able to infect and persist in multiple species (5). Most intriguing are the invasive S. Typhimurium that 
are involved in bloodstream infection in African adults and children, with an associated case fatality of 
20‐25% (1), which suggests that specific strains of S. Typhimurium might have become host‐adapted, 
or  even  host‐restricted  in  Africa.  Although  evolution  to  host‐restriction  involves  a  genomic 
degradation, non‐synonymous SNPs might participate in this process. A typical example of the impact 
of allelic variants on host specificity is the FimH adhesin of S. Gallinarum type 1 fimbriae that mediates 
mannose‐resistant  binding  to  chicken  leucocytes  (2)  and  efficient  systemic  bacterial  dissemination 
and colonization of internal organs in chicks (3). Switching this FimH for the mannose‐sensitive type 1 
fimbrial adhesin, which  varies only by 5 amino acids, affected significantly all the latter phenotypes 
(3).  
The  hypothesis  of  this  study  is  that  the  genetic  variation  in  certain  colonization  factors,  including 
fimbrial adhesins, regulates host range and the degree of host adaptation.  We recently started to test 
this hypothesis by genome‐wide association studies with a focus on fimbrial adhesins. Eight adhesin 
genes of 48 S. Newport genomes were sequenced (6). The number of SNPs varied between 5 and 85 
for each of the 8 genes, whereas each adhesin was represented by 6 to 12 different alleles. Phylogenic 
trees clearly separated each of five adhesins into two separate groups. In support of our hypothesis, 

76 Table of contents >>

 Salmonella and Salmonellosis 2013

FimH of the two groups differentiated strains from bovine and non‐bovine origin. The allelic adhesin 
groups correlated also significantly with strains that did or did not show antimicrobial resistance (and 
with  or  without  mobile  DNA  elements  carrying  antibiotic  resistance  genes  such  as  plasmids  or 
integrons). This finding was consistent with a second hypothesis which suggested that adhesin alleles 
of persistently colonizing Salmonella optimize the opportunity for bacterial encounters and horizontal 
gene  transfer  (HGT)  in  intestines,  resulting  in  the  accumulation  of  antimicrobial  resistance  genes  in 
such strains.  
 
MATERIALS AND METHODS 
We  used  the  previously  developed  targeted  sequencing  strategy  with  the  Fluidigm  Access  Array 
system and the Roche 454 sequencer (6).  
 
RESULTS 
To test whether the potential associations of adhesin alleles with host or antibiotic resistance can be 
confirmed  with  another  Salmonella  serovar,  the  sequence  of  all  the  15  predicted  fimbrial  adhesin 
genes  detectable  in  S.  Typhimurium  (5)  and  of  three  genes  for  outer  membrane  proteins  with 
potential  adhesive  properties  were  determined  for  394  well‐characterized  S.  Typhimurium  isolates. 
The lpfD and fimH genes had the highest numbers of allelic variants (Table 1). 174 lpfD genes had a 
unique  7  base  pair  deletion,  resulting  in  a  pseudogene.  The  nucleotide  diversity  of  the  220  lpfD 
sequences  lacking  the  deletion  (*)  was  lower  (π=  0.0001050).  173  isolates  lacked  the  pefA  gene, 
suggesting that these strains also lacked the plasmid that normally carries the pef gene cluster. There 
was no association between the lpfD deletion and the absence of pefA. 
Phylogenetic grouping of strains with individual genes showed that there was a statistically significant 
association  of  the  FimH‐2  allele  with  horses.  Significant  associations  were  also  determined  for  the 
FimH‐3 or BcfD‐3 alleles and antibiotic resistance. The lpfD genes that encoded the full protein were 
positively associated with bovine and porcine hosts, while the presence of pefA correlated negatively 
with bovine hosts. 
The study was further expanded by collecting and analyzing a total of 1442 available Salmonella fimH 
sequences from 74 serovars (NCBI and Welcome Trust Sanger Institute). A total of 131 fimH and 90 
FimH  alleles  were  identified.  The  sequences  were  from  strains  collected  over  20  years  (Fig.  1)  and 
originated mainly from North America (Fig. 2).  
 
Although  most  serovars  were  carrying  different  fimH  alleles,  many  of  them  were  mainly  associated 
with one to two of these alleles (Fig. 3). One to five additional alleles per serovar represented typically 
less than 10% of all the alleles. Thus each serovar carried only a selected small group of fimH allele, 
some only one (e.g. S. Dublin). Conversely, several fimH alleles were serovar‐specific, being identified 
only  or  mainly  in  one  or  two  serovars.  The  data  also  highlighted  large  numbers  of  negative 
associations between specific serovars and fimH alleles.  
Fig.  4  confirms  well‐known  serovar  specificities  for  hosts  (e.g.  S.  Enteritidis  and  the  chicken‐egg‐
human  link).  Moreover,  fimH  SNPs  were  associated  with  original  hosts,  clinical  relevance  or 
environments.  Most  noticeable  was  the  preponderance  of  the  fimH2  (which  also  serves  as  the 
reference  allele)  for  serovar  Typhimurium  in  humans  and  all  studied  farm  animals.  This  was  in 
contrast with fimH1, which was not found on equine isolates. In contrast to the nonsynonymous (ns) 
fimH SNPs for the human specific serovars, several ns SNPs were associated with bovine, equine and 
porcine isolates or with plants (not shown). 
 

77 Table of contents >>

 Salmonella and Salmonellosis 2013

CONCLUSION 
In addition to previous findings with the fimH of S. Gallinarum, the presented results further support 
our hypothesis that allelic variation of Salmonella adhesins participate in specific binding phenotypes 
that are directed towards preferential host species or environmental niches, potentially favoring the 
accumulation of antibiotic resistance genes by HGT. Identified allele‐host associations should serve as 
diagnostic and epidemiological tools to confirm and complement serotyping.  

ACKNOWLEDGMENT:  
Funding from NIH NIAID:AI098041 (to D.M.S.), NSF DBI:0850356 (to R.A.E.), and Wellcome Trust 
(DECIPHER project). 

REFERENCES:
1. Feasey, N. A., G. Dougan, R. A. Kingsley, R. S. Heyderman, and M. A. Gordon. 2012. Invasive non‐typhoidal
salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet 379:2489‐99. 
2. Guo, A., S.  Cao, L. Tu, P.  Chen, C. Zhang, A.  Jia,  W. Yang, Z. Liu, H. Chen,  and D. M. Schifferli. 2009. FimH
alleles  direct  preferential  binding  of  Salmonella  to  distinct  mammalian  cells  or  to  avian  cells.  Microbiology 
155:1623‐33. 
3. Kuzminska‐Bajor,  M.,  M.  Kuczkowski,  K.  Grzymajlo,  L.  Wojciech,  M.  Sabat,  D.  Kisiela,  A.  Wieliczko,  and M.
Ugorski.  2012.  Decreased  colonization  of  chicks  by  Salmonella  enterica  serovar  Gallinarum  expressing 
mannose‐sensitive FimH adhesin from Salmonella enterica serovar Enteritidis. Vet Microbiol 158:205‐10. 
4. Rabsch,  W.,  H.  L.  Andrews,  R.  A.  Kingsley,  R.  Prager,  H.  Tschape,  L.  G.  Adams,  and  A.  J.  Baumler.  2002.
Salmonella enterica serotype Typhimurium and its host‐adapted variants. Infect Immun 70:2249‐55. 
5. Yue, M., S. C. Rankin, R. T. Blanchet, J. D. Nulton, R. A. Edwards, and D. M. Schifferli. 2012. Diversification of
the Salmonella Fimbriae: A Model of Macro‐ and Microevolution. PLoS ONE 7:e38596. 
6. Yue, M., R. Schmieder, R.  A.  Edwards,  S. C.  Rankin,  and D. M. Schifferli. 2012. Microfluidic PCR  Combined
with  Pyrosequencing  for  Identification  of  Allelic  Variants  with  Phenotypic  Associations  among  Targeted 
Salmonella Genes. Appl Environ Microbiol 78:7480‐2. 

Table  1.  Sequence  diversity  for  15  Table 2. FimH dominant alleles.  Table 3. BcfD dominant 

genes  of  394  S.  Typhimurium  alleles.  
isolates.  m,  number  of  sequences; 
A,  number  of  predicted  allelic 
genes;  S,  number  of  segregating 
sites (sum of positions with SNPs);  
π, nucleotide diversity. 

78 Table of contents >>

 Salmonella and Salmonellosis 2013

Fig. 1: Numbers of Salmonella strains   Fig. 2: Percentages of Salmonella strains 
sampled per year.  sampled per geographic region 

Fig. 4. Genetic relation of major allele, and their host and reservoir distribution. 

Fig. 3. Most frequent fimH and FimH alleles versus specific serovars. The reference  
allele fimH2 is from S. Typhimurium strain SL1344. 

79 Table of contents >>