1 - .

,- ,

MICOL. NEOTROP- APL. 2: 3-17, 1989-

PRODUCCION, CONSERVACION Y VIABILIDAD DE XNOCULO DE HONGOS

FILAMENTOSOS PARA LAS FERMENTACIONES SOLIDAS

S. ROUSSOS (11, M.A. AQUIAHUATL (2), M.A. BRIZUELA ( 3 ) , A - OLMOS

(2)r W - RODRIGUEZ (2) y G. VINIEGRA (2)

( 1 ) Institut Francais de Recherche Scientifique pour le Dvloppement en Coopration (ORSTOM), 213 Rue
Lafayette, 75010 Paris, Francia.
( 2 ) Departamento de Biotecnologa, Universidad Autnoma Metropolitana (UAM-I), Apartado Postal 55-535,
Iztapalapa, 09340 Mxico, D.F.
( 3 ) Instituto Cubano de Investigaciones de l o s Derivados de Ia Caa de AzGcar (ICIDCA), V a Blanca y
Carretera Central 804, San Miguel del Padron, Zona Postal 10, La Habana, Cuba.

PRODUCTION, CONSERVATION AND VIABILITP OF FILAMENTOUS FUNGI INOCULUM

FOR SOLID SUBSTRATE PERMENTATIONS

SUMMARY

The study of the sporulation physiology with regard to the

quantitative production of conidiospores, allowed to define the
environmental conditions and to optimize the media composition to
produce conidiospores of Aspergillus niger, A. terreus and
Trichoderma harzianum in bulk. The pilot plant scaxe production of
conidiospores of these fungi was carried out by two new methods: 1)
conidiospore production with disk fermenters and 2) conidiospore
production on a support. In disk fermenters, optimal production of
conidiospores was obtained after 7 days of incubation for A. terreus
and T. harzianum, yielding a particularly high sporulation of 3.5 x
101O-conidiospores per gram of substrate. In a column type reactor,
spore production of A. niger and 2. harzianum on a support was
studied, reaching yilds up to 1.1 ~ 1 0 spores ~ per gram of
substrate. Conidiospore conservation was carried out by
refrigeration ( 4 O C ) , freezing ( - 4 O C ) and drying ( 4 O O C ) . Best results
were obtained by conidiospore refrigeration. The kinetics of
viability of refrigerated conidiospores of A. niger, A - terreus and
-T . harzianum showed the possibility of a reliable utilization of
these strains with a 90% viability, even after two months of
harvesting.

RESUMEN
Cote p
El estudio de la fisiologia de la esporulacin, en relacin con la
produccin cuantitativa de conidiosporas, permiti definir las condi-
4 Si. Roussos et al.

ciones medio ambientales y optimizar la composicin de los medios de

c u l c i v c para la produccidn masiva de conidiosporas de Aspergillus
niger, A - terreus y Trichoderma harzianum. La produccin de
conidiosporas de 5. niger, R . terreus y T. harzianum a nivel 6e
planta piSoto; se realiz por medio de dos nuevos procedimientos: L j
p r c d u c c i n de canidiosporas en un fermentador de discos ?; lj
proBucci6n de conidiosporas sobre soporte. En e1 fermentador ide
discos, la prod~iccinijptiina de conidiosporas se obtuvo despuSs de 7
das 9 2 incubacien para- .; terreus y 2. harzianum, can un
rendimient3 de esporulacion particularmente elevado de 3.5 x 10'O
cJni3issporas por gramo de substrato. En el fermentador de tipc:
columna, se estudid la producci6n de esporas sobre soporte por 2 -
niqer y T. harzianum. Los rendimientos de esporulacin fueron
tambi En eTevadJs, con 1.1 x L O l o conidiosporas producidas. La
-..
i4nservacin de conidiosporas se realiz por refrigeracin (4% I
conc~slaci6n( - 4 O C ) y secado en rotavapor ( 4 0 C ) . Los mejores
rcsulta.5os d e conservacin, se obtuvieron en las conidiosporas
refrigeradas. Las cinticas de viabilidad de conidiosporas de 5.
-
niJer,- A. terreus y 2. harzianum conservadas en refrigeracin,
muestra~ q u e es posible la utilizacin confiabLe de stas cepas c o n
cn 3.3 3 l i e viabilidad, an despus de 2 meses de su cosecha.

INTRODUCCION

Er: nuestros Laboratorios tres hongos filamentosos, a saber:

4. terreus y Trichoderma harzianuml s e utilizan
~ . s p e r 3 i l l u s niger I
ccn m6s frecuencia para las fermentaciones en medio slido;
;tilizsndo com,> substrat o soporte el bagazo de caiia de azcar, con
eL ztjjetl-;c d e prcducir biomasa o enzimas.

L 3 groduccidn de conidiosporas de 5 - niyer, 5 - terreus y

harzianum, s s lLe.73 a cabo durante la conidiognesis, etapa fisiol6-
x.
2 c3 import3nte de reproduccin asexual para esto; hongos
i m F e r f n c t o s . iiariqs factores fisico-qumicosr ambientales y nutri-
~cir~nslec i n f l u y e n sobre la produccin cuantitativa de las
con1di;sporaa; tales como fuentes de carbono y nitrdgeno
Martinelli, 1976; Vezina et al., 1365: Roussosr 1'385)I
concentrazi.Cn .Je sales minerales-y olrgoelamentos (Jerebzoff et al - ,
1 3 7 E ; Gindrat, 1'37?j, humedad y aereaci6n de los cultivos (Maheva &
-
a i . , lZi34; F ~ J U S ~ G 1985;
S, Roussos y Olmos, 1987).

Se cG5nocen diferentes tcnicas para La prGducCi6n de coni-

diosporas a nivel de planta piloto o industrial. Las ms antiguas se
refieren al U S G de botellas de Roux o de charolas (Vezini y Sing,
1,37".
,,l. En los ltimcjs 10 azos, se propusieron varios procesos nuevos
en fermentadores lquidos (Broderick y Greenshields, 1982), en fer-
mentadores de discos (Raimbault y R O U S S O S ~ 1 9 8 5 ) y sobre soporte
( R ~ i i s s sy Olmos I 1987 j .

La conservaci6n da conidiosporas Be hongos filamentosos para

cepas de colecciijn a nivel de laboratorio, se lleva a cabo mediante
congelacidn (-18C o -196C en nitrgeno lquido) y secado en suelo
 Inculo de hongos filamentosos 5

estril o liofilizacin (Butler, 1980; Tommerup y Kidby, 1979;

Dahmen et &.,1983). Estas tcnicas de conservacin, se utilizan
con xito para mantener pequeas cantidades de conidiosporas, pero
el elevado costo del equipo y funcionamiento, las hacen de uso
limitado para escalas mayores.

En este trabajo, se presenta una sntesis de los estudios rea-

lizados sobre la optimizacin de tres cepas de hongos filamentosos
(A. niger, 4. terreus y r. harzianum). A continuacin se presenta el
efecto de los principales factores que influyen en la esporulacin
de stas cepas. Asimismo, se desarrollan dos nuevos procesos de
produccin masiva de conidiosporas en un fermentador de discos y
sobre soporte. Para la conservacin de stas conidiosporas se
utilizaron diferentes tcnicas estudiando su viabilidad en cada caso.

MATERIALES Y METODOS

Mi cr oorg an ismos
Se estudiaron en este trabajo Aspergillus niger van Tieghem, cepa
ORSTOM-10 (Raimbault, 1980); 4. terreus Thom, cepa del ICIDCA
(Roussos et al., 1987) y la cepa CCMF-470 (CCM= Czechoslovak
Collection- of Microoganisms) de Trichoderma harzianum Rifai
ampliamente descrita por R o u s s o s (1985).

Medios de cultivo y de esporulacin

Las cepas se resembraron cada 6 meses en papa dextrosa agar (PDA) y
se incubaron a 29% durante 7 das, para posteriormente conservarlas
en refrigeracin (4OC) durante mas o menos 6 meses.
Produccin de esporas en matraces
Se colocaron 20 q- de medio de cultivo con diferentes concentraciones
de fuentes de carbono, en matraces de 250 ml, los cuales se esteri-
lizaron a llOC durante 3 0 minutos. La composicin del medio de
cultivo puede observarse en la Tabla 1. Las fuentes de carbono
estudiadas fueron glucosa, sacarosa, celulosa, harina de yuca y
melaza. Los medios de cultivo esterilizados, todava lquidos, se
inocularon en masa con 1 x 1 0 6 esporas/matraz y se incubaron durante
una semana a varias temperaturas (29OC para r. harzianum, 35OC para
11- niqer, 30'~para A. terreus). Posteriormente, se agregaron loom1
de agua con Tween 80 y se contaron las esporas con una cmara de
Malassez. El indice de esporulacin (Ie) se determin como el nmero
de esporas producidas por gramo de fuente de carbono inicial.

Produccin de esporas en un fermentador de discos

El fermentador de discos rotatorios (Fig.l), as como su funciona-
miento, se han descrito ampliamente por Raimbault y Roussos (1985).
Este fermentador conteniendo 600ml de medio de cultivo, se esteri-
liza en un autoclave a 110OC durante 40min y se inocula en masa con
3 x l o 7 conidiosporas/g de substrat0 carbonado/ cuando la temperatura
del medio llega a mas o menos 45OC; posteriormente se homogeniza
mediante agitacin mecnica. Pasado el tiempo de incubacin de 7
dasl se cosechan las conidiosporas agregando al fermentador de
6 S. Roussos et al.
om
O
uld
m a
ld
.rf
a h
u
u-+
Ii@iIiB al"
w a
T
l
i B
U
 Inculo de hongos f i l a m e n t o s o s 7

Tabla 1. Composicin del medio de cultivo utilizado para la selec-

cin de la fuente de carbono mas adecuadar el cual se
ajust a un pH de 5.6.

SUBSTANCIA CANTIDAD

Fuente de carbono* 4.00 g

KH2P04 0.16 g
(NH4)2SO4 0.32 g
Urea 0.08 g
Agar 15.00 g
Agua 1000 ml

* Fuente de carbono: glucosa, sacarosa, celulosa, yuca, melaza.

discos 2 1 de agua estril adicionada con Tween 80(0.1%) y

agitndolo durante 10min.
Produccin de esporas sobre soporte
Se utiliz una mezcla de basazo de caa de azcar (70s) como sowor-
te y harina de yuca (309) como fuente de carbono. A dicha mezcla; se
le agreg una solucin de sales [KHzPOq, 1 - 5 9 : (NH4)2SO4, 3 9 ; Urea
0.75 g y CaC12, 2 g] con la cual se ajust la humedad de la mezcla
al 50 %. Despus de homogenizarla, se esteriliz en un autoclave a
llOC durante 30min. El medio de cultivo as preparado se inocul
con 3 x 1 0 7 conidiosporas/g de substrat0 en peso seco. 149 del medio
inoculado se repartieron en cada fermentador de tipo columna, los
cuales se colocaron en bao mara (29C para 2. harzianum, 3OoC para
A. terreus y 35OC para A. niger) para llevar a cabo la fermentacin
-
y los estudios de cinticas de produccin de conidiosporas, median-
te los dispositivos descritos por Raimbault y Alazard (1980).
Mtodos de conservacin
La suspencin de conidiosporas cosechada de un fermentador de
discos, se filtr con gasa estril y se separ en tres lotes. El
primer lote se distribuy en botellas o matraces previamente esteri-
lizadosr los cuales se mantuvieron en refrigeracin (4C): el
segundo lote se distribuy igual que el primero, pero mantenindose
en congelacin (-4y); mientras que el tercer lote se procedi a
secarlo en un rotavapor a diferentes temperaturas (30, 40r5 0 y
60C)r sin soporte y con soporte (1.59 de bagazo estril por 100ml
de una suspensin de conidiosporas). Como testigo se utiliz la
suspencin inicial de conidiosporas sin tratamientor la cual se tom
como referencia para el c&lculo del porcentaje de germinacin y
viabilidad de las mismas (Roussos et al., 1985).

Evaluacin de la viabilidad
La viabilidad de las conidiosporas mantenidas en conservacin, se
evalu mediante la enumeracin (cuenta indirecta) de las colonias de
a S. Roussos et al.

A. terreus y r. harzianumr que aparecen sobre el medio de Douglas

-
-
al., (19791, despugs de sembrar 0.21111de diluciones sucesivas de la
suspencin original e incubndolas a 29OC, durante 2 a 4 dzas- Al
evaluar la viabilidad, se realizaron tambin conteos directos de
esporas en cmara de Malassez. El porcentaje de viabilidad, se de-
termin mediante la relaciBn del nmero de esporas viables deter-
mLnadas aL tiempo del muestrau, ion ssgecto de aquellas
determinadas al inicio del perodo de conservacin.

RESULTADOS Y D I S C U S I O N

Se ha demostrado que la manera de inoculacin de los rnedios de

cultivo (en la superficie o en la masa del medio), tiene influencia
sobre la produccin de conidiosporas de Trichoderma harzianum
(Roussos, 1385). E n este trabajo, se inocularon los medios en la
masa y se estudi6 la produccin de conidiosporas en matraces, en
fermentador de discos y sobre soportes. Tambin se estudiaron los
principales factores (fuente de carbono, relacin carbonoinitrgeno
y tiempo de incubacin) que influyen sobre la conidiognesis de
Aspergillus terreus y
vacin de esporas.
r-
harzianum, as como l o s mtodos de conser-

Produccin de esporas en matraces

Varios autores han demostrado la imnurtancia de la fuente de carbono
sobre la conidioggnesis de hongos filamentosos (Vezina et al., 1965;
Martinelli, 19763. En la Tabla 2, puede observarse que los mejores
indices de esporulacin (Ie) de J. terreus se obtuvieron con harina
de yuca o con melaza, lo cual coiilcide con los resultados obtenidos
por Rairnbault (1980) para 4. niger y por Roussos (1955) para 2.
haczianum.

El efecto de la concentracin de la fuente de carbono sobre el

Ie, de A . terreus y E . karzianum, se presenta en la Tabla 3. Las
altas czncentraciones de substrato (supriares a 20 g i l l en los
medios de cultivo, ejercieron una inhibicidn de la esporulacin en
ambas especies. Aunque no se obser~i59el mismo efect.:,para 8. niger,

Tabla 2 - Indice de ssporulacien (Ie ~10'') y produccin de coni-

diosporas de Aspergillus terreus en matraces, utilizando
diferentes fuentes de carbono.

Indice de F u e n t e de Carbono
e s p a r ill ac i;.' n c 1u c o3 a S ac a ros a Welaza Yuca Celulosa

If? K LO? 20.3 14.1 41.6 26.7 2 7 * -10

 Indculo de hongos filamentosos 9

Tabla 3. Efecto d e la concentracin del substrato sobre el indice de

esporulacin (Ie) de Aspergillus terreus y Trichoderma
harzianum.

Concentracin del -
A. terreus -
T. harzianum
substrata* (g/l)
1e x io9 Te x io9

1 1.95 26.66
5 9.95 13.01
10 14.20 16.20
20 10.80 4.62
25 8.32 5.95
40 0.76 9.12
50 0.73 8.24
100 0.33 1.34

* Melaza p a r a A. t e r r e u s y h a r i n a de yuca p a r a L. harzianum.

donde los valores de Ie no son afectados a concentraciones altas del

substrato ( l O O g / l ) .

Cuando la relacin C/N es aproximadamente de 20, se obtuvieron

los mejores Ie para r.
harzianum (Tabla 4). En l o s valores de C/N
menores a lor se obtuvo un Ie muy bajor despus de 7 o 20 das de
incubacin. En este casor la concentracin elevada de nitrgeno
podrra ejercer algn tipo de inhibicin an no definida sobre la
esporulacin. En cambior cuando los valores de C/N eran mayores de
30r se observ un retardo importante en la etapa de conidiognesis,
la cual se llev a cabo hasta los 14 dlas de cultivo. Esto parece

Tabla 4. Efecto de la relacin C/N del medio de cultivo, sobre el

ndice de esporulacin (Ie) de Trichoderma harzianum,
cultivada en matraces a 2 9 v .

Indice de esporulacin
Relacin 1e x 109
C/N
7 das de cultivo 20 das de cultivo

7.1 7.71 10.27

14.2 7.38 24.40
20.9 14.80 20.90
27.4 7.18 20.00
32.53 0.16 11.80
LO s. HousSOS e t a l .

e s t ; l r r e l a c i o n a d o c ~ nIs d i s p o n i b i l ~ . d a d d e n i t r l ' j g e n s e n el. medio d e

c u l t 1 .'i 1.-2 q u i 6 s t e s e r a u t i l i z a d o en s u t s t a l s d a d p a c a la
p r o d u c z i i n de hiomssa.

L;l c s n G c i c a d e e s p o r u 1 a c i S n d e A. terreus, sobre diferentes

f l u e n t s s d e ~csrl3jono, m u e s t r a v a l o r e s d e I o d i f e r e n t e s p a r a c a d
s u b s t r a t a ( F i g . 2 ) - E l BTtimo d e e s p o r u l a c i n , s e o b t u , , o i e s p u s d e
1 5 d a s d e i n c u b a c i i n p a r a l o s s u b s t r a t o s e s t i l d i a d o s . Los mayores
,ralores dz:L I e , s e o b t u v z e r o n con m e l a z a , l u c a y c e l u l o s a ; m i e n t r a s
quz l o s n e n o c e s fuero^ s o b r e g l u c o s a y s a c a r , c o n f i r m i n d o s e l o s
resultados a n t e s p r e s e n t a d o s ( T a b l a 2).

1. : i n S . t i c a s rie e s p o c u l a c i d n d e A s p e r g i l l u s t e r r e u s sobre
d i f e r e n t e s f u s n t e s d e c a r b o n o ( c u l t i v o s en m a t c a c e s a ? O ' C ) .
 Inculo de hongos filamentosos 11

3'

2'
w

3 4 5 6 7
I
8
Tiempo (das)
9

Fig. 3. Produccin de conidiosporas de Trichoderma harzianum en

relacin con el tiempo de incubacin, obtenidas en cultivo sobre
harina de yuca en un fermentador de discos a 2 9 O C .

Produccin de esporas en fermentador de discos

La cintica de esporulacin de r. harzianum obtenida sobre medio
optimizado en fermentador de discosr se muestra en la fiaura 3. La
produccin de conidiosporas se inicia a partir del cuarto da,
incrementn8ose hasta el sptimo dar cuando se obtuvo el mejor le
( 3 . 3 1 ~ 1 0 ' conidiosporas/g).
~ Despus de este tiempo, se observ una
notable disminucin del Ie. Por otro lador en 3. terreus la conidio-
gnesis se inicia a partir del segundo da, incrementndose de
manera regular hasta el sptimo da. Aunque no se determin el Ie
mximor se observ una produccin de conidiosporas importante
(Fig. 4).
Produccin de esporas sobre soporte
El estudio comparativo entre- la produccin de conidiosporas sobre
soporte en matraces y columnas empacadas para A. niger y E.
harzianum] demostr que los valores de Ie mximos se obtuvieron
despus de 7 dZas de incubacin en columnas y de 14 das en matra-
 12 S. Roussos e t a l .

20

L
O
C l
a,

ir
O
O,

a,
a

2 3 Tiempo4 (das) 5 6 7

Fig. 4. Cin6tica de esporulacitin de A s p e r g i l l u s t e r r e u s e n c u l t i v o

sobre m e l a z a , en u n f e r m t n t a d o r d e d i s c o s a 3 0 ' C .
 Lnculo de hongos filamentosos 13

Tabla 5. Viabilidad de las conidiosporas de Aspergillus niger, A.

terreus y Trichoderma harzianum producidas en un
fermentador de discos y conservadas en suspencin a 4OC
durante 2 meses.

Viabilidad* ( $ )
Conservacin
(das)
-A. niger -
A. terreus -
T. harzianum

1 98.5 94.6 92.3

26 96.4 76.6 83.2
53 95.8 90.0 84.4

* Suspensin i n i c i a l de esporas de 2 . 3 ~lo'.

ces, para ambas cepas (Roussos y Olmosr 1987). Para 2. harzianumr la

produccin de esporas fu mejor en columnasl comparada con la obte-
nida en matraces, a humedades menores de 76 % (Fig. 5). En A. niger
fu al contrario, ya que l o s resultados obtenidos fueron mejores
para los cultivos en matraces, a las mismas humedades iniciales de
los medios de cultivo (Fig. 5). Los valores de los Ie obtenidos en
columna fueron elevados para ambas cepas, del orden de
1.4~10' ~
conidiosporas/g de substrat0 (E. harzianum) y de
4.5~10' conidiosporas/g de susbtrato (A. niger). Estos valores del
Ie fueron tres veces menores a los obtenidos en el fermentador de
discos.

Conservacin y viabilidad de esporas

Los resultados de conservacin de esporas en congelacin a -4OC de
A. -niger y E. harzianum, mostraron prdida importante de su viabi-
-
lidad, como puede observarse en la figura 6. En el caso de conser-
vacin de esporas en suspencin, por refrigeracin a 40CI se observ
que se mantuvo una viabiliadad importante (85-95 % ) de las esporas
hasta por dos meses en las cepas estudiadas (Tabla 5).
Con respecto al mtodo de conservacin de esporas por secado en
rotavapor, se observ que en el secado de esporas sin soporter la
temperatura tiene un efecto negativo mas importante sobre la
viabilidad, que el observado en el secado con soporte (Tabla 6).

CONCLUSIONES

La optimizacin de los medios de cultivo para la produccin masiva

de conidiosporasl demostr que cada cepa experimentada ( h . niger, A.
terreus, E. harzianum) tiene caractersticas fisiolgicas de espo-
rulacin propias. Los mejores lndices de esporulacin se obtuvieron
sobre medios de cultivo ptimos, en los cultivos en fermentador de
discos, para las tres cepas. Aunque los rendimientos de esporula-
 ID
rt
W
P

80
Humedad ( % ) Eumedad ( S )

Fig. 5. Influencia de la humedad sobre el ndice de esporulacidn de Trichoderma

harzianum y Aspergillus niger, a los 9 y 7 das de produccin sobre soporte,
respectivamente.
 I H
3
O\
o
C
+
O

o 1.0 2.0 3 . a 4 . 0 5.0

Tiempo (das) Tiempo (dias)

Fig. 6. Cintica de conservacin de esporas de Aspergillus niger y Trichoderma

harzianum, en congelacin a -4 C .
16 S. Roussos et al.

Tabla 6 . Viabilidad de las conidiosporas de Trichoderma harzianum,

conservadas por secado en un rotavapor a diferentes
temperaturas con o sin soporte.

Viabilidad* ( % )
Temperatyra de
secado ( - C l
sin soporte con soporte

40 9.35 38.75
50 0.81 20.00
60 0.56 5.75

5uspensijn inicial d e 5 . 7 5 ~lo9 conidiosporas/ml.

cien abtenidos con los cultivos sobre soporte, fueron tambin altos.
De las tcnicas de conservacin experimentadas (secado, congelacin
y refrigeracin), se seleccion la de refrigeracin para mantener
las conidiosporas por un tiempo de dos meses, con un porcentaje de
:-labilidad importante del 85-95 %i.

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