Pregledni lanak / Review
Spregnute tehnike tekuinski kromatograf
spektrometar masa: osnove metodologije i
primjene
Hyphenated techniques liquid chromatography-mass spectrometry:
basic methodology and applications
Mario Cindri1*, Ana Markovi2, Anita Horvati1
1
Institut Ruer Bokovi,
Zavod za molekularnu medicinu,
Laboratorij za sistemsku biomedicinu,
Zagreb
2
Zavod za biokemiju, Kemijski odsjek,
Prirodoslovno-matematiki fakultet,
Sveuilite u Zagrebu
Primljeno: 20. 1. 2009.
Prihvaeno: 13. 2. 2009.
Adresa za dopisivanje:
*
Dr. sc. Mario Cindri,
Institut Ruer Bokovi, cade.
Zavod za molekularnu medicinu,
Laboratorij za sistemsku biomedicinu,
Planinska 1, 10 000 Zagreb
e-mail: mcindric@irb.hr
http://hrcak.srce.hr/medicina
218
SAETAK. Tekuinska kromatografija (LC) osnovna je vienamjenska separacijska tehnika koja
se primjenjuje u modernim biolokim znanostima i srodnim podrujima molekularne biologije
kao to su analitika ili preparativna kemija. Za razliku od mnogih drugih separacijskih tehnika
koje nisu pogodne za razdvajanje termiki nestabilnih molekula (npr. plinska kromatografija,
GC) ili onih koje se ne mogu direktno spregnuti (npr. izoelektrino fokusiranje, IEF), tekuinska
kromatografija moe uspjeno posluiti za razdvajanje irokog raspona molekula kao to su to
polimeri, male molekule farmaceutika ili njihovih metabolita, kao i peptida i proteina. Oda-
birom takve metode tekuinske kromatografije koja ne teti analizi spektrometrijom masa
(hlapljivi puferi, stabilan i nizak protok, upotreba polarnih organskih otapala), tekuinski kro-
matograf moe se jednostavno spregnuti sa spektrometrom masa. Izvor iona, analizator (ili
kombinacija vie analizatora u istom instrumentu, tzv. tandemska spektrometrija masa) i de-
tektor iona odabiru se u ovisnosti o vrstama analiza, a koje pak mogu biti jednostavne analize
odreenog iona ili kvalitativno substrukturalne i kvantitativne analize kompleksnih smjesa. Da
bi se olakalo odreivanje strukture ili kvantitativna analiza, u proteklom desetljeu su razvi-
jene razliite programske aplikacije i pretraivai baza podataka.
Kljune rijei: analizator masa, baze podataka, ionizacija, tandemska spektrometrija masa,
tekuinska kromatografija
ABSTRACT. Liquid chromatography (LC) is a basic versatile separation technique widely used
in modern life sciences especially in the fields closely related to molecular biology, namely
in the analytical or preparative chemistry. Unlike many other separation techniques, which
are unsuitable for thermally degradable molecules (e.g. gas chromatography, GC), or which
are not feasible for on-line coupling (e.g. isoelectric focusing, IEF), liquid chromatography
can eciently separate a very wide range of large molecules like polymers, peptides and
proteins as well as small molecules like drug or drug metabolites. Choosing the proper LC
method that utilize mass spectrometry (MS) friendly conditions (volatile buers, stable
and low flow rate, polar organic solvents etc.), liquid chromatography system can be eas-
ily hyphenated to mass spectrometer. Ionization source, analyzer (or combination of
more analyzers in one instrument, the so called tandem mass spectrometry) and ion de-
tector are selected according to the analysis requirements that might range from simple
one ion qualitative analysis to substructural qualitative, and quantitative analysis of
complex mixtures. To facilitate elucidation of structure or quantitative analysis dierent
software applications and data bases search engines were developed during the last de-
Key words: analyzer, data base, ionization, liquid chromatography, tandem mass spectrometry
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

UVOD ljine ili multidiodni (DAD, PDA itd.), fluorescentni,

indeksa loma, rasprenja svjetla, elektrokemijski,
Tekuinska kromatografija i spektrometrija masa amperometrijski, spektrometar masa itd.
do prije dvadesetak godina bile su dvije potpuno
odvojene tehnike. Sedamdesetih i osamdesetih
OSNOVE TEKUINSKE KROMATOGRAFIJE
godina, meutim, dolo je do povezivanja LC i MS
na podrujima mehanizama desorpcije, otparava- Tekuinska kromatografija je analitika tehnika
nja i ionizacije analita u tekuoj fazi, ionizacije pri koja se koristi za separaciju otopljenih tvari6,7. Tvari
atmosferskom tlaku i povezivanja ionizatora i ana- iz otopina u razliitoj mjeri stupaju u interakciju s
lizatora, to je predstavljalo ogroman iskorak k ru- nepokretnom i tekuom pokretnom fazom radi ra-
tinskoj upotrebi tzv. vezanog sustava LC-MS1-5. zlika u adsorpciji, ionskoj izmjeni, razdiobi meu
Svrha je ovog rada odgovoriti na vana pitanja o fazama ili veliini tvari koje se razdvajaju, te imaju
tome to je tekuinska kromatografija i koja je razliita vremena zadravanja na kromatografskoj
njezina primjena, zatim prikazati osnove tekuin- koloni.
ske kromatografije, te prikazati osnove spektro-
Kromatogrami
metrije masa, koje se tehnike koriste u spektro-
metriji masa, a komplementarne su tekuinskoj Kromatogram je ispis bilo koje funkcije koncen-
kromatografiji. tracije analizirane tvari u ovisnosti o vremenu ili
volumenu eluiranja (slika 1a i 1b). Poloaj kroma-
TEKUINSKI KROMATOGRAF tografskog pika na vremenskoj osi moe sluiti za
Tekuinski kromatograf sustav je u kojem se vri identifikaciju sastojka, a iz povrine ispod pika
analiza veinom polarnih analita razdvajanjem ci- mogue je izraunati koliinu svakog pojedinog
ljanog analita na kromatografskoj koloni i detek- sastojka.
cijom istog uz pomo pogodne tehnike detekcije.
Tekuinski kromatograf sastoji se od sustava za
dobavu pokretne faze, injekcionog sustava, kui-
ta za kolonu te detektora.
Sustav za dobavu pokretne faze i crpni sustav sa-
stoje se od spremnika pokretne faze (1-4 kanala),
proporcionalnog ventila, odzraivaa i sustava
dobave helija, crpke (samostojee, binarne ili
kvarterne), regulacionog ventila na ulazu i izlazu
iz crpke, sustava za ujednaavanje pulseva, venti-
la za ispiranje sustava, regulatora tlaka u sustavu,
te dinamike ili statike mijealice.
Injekcioni sustav slui za unos uzorka, a sastoji se
od injekcionog ventila (runi ili automatski), auto-
matskog uzorkivaa (engl. autosampler) koji moe
biti termostatiran (Peltier 4 40 C), zatim od
injekcione igle i graduirane injekcije ili crpke, te
kapilare odreenog volumena.
Kuite u kojem se nalazi kolona moe biti termo-
statirano (Peltier ili grija od 10 C ispod sobne
temperature do 80 C) ili netermostatirano s mo-
gunou detekcije proputanja tekuine. Kolone
nose oznake po vrsti nepokretne faze (C18, C8, C4, Slika 1. Kromatogrami granulocitnog faktora rasta (a) i triptikih produkata
NH2, Ph-NH2, CN, grafitna, SiO2, gel-propusna itd.). eritropoetina (b) dobiveni uz pomo detekcije UV/VIS (DAD)
Detektori koji se koriste u tekuinskoj kromatogra- Figure 1. Chromatograms of granulocyte colony stimulating factor (a) and
erythropoietin tryptic peptides (b) obtained by UV/VIS (DAD) detector
fiji mogu biti UV/VIS od jedne do etiri valne du-

medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232 http://hrcak.srce.hr/medicina 219

 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
Faktor zadravanja k
Faktor zadravanja pokazatelj je duljine zadrava-
nja spoja na koloni u odnosu na pretpostavku da
nema interakcije s nepokretnom fazom. Definiran
je kao k= (tR-tM)/tM, pri emu je tR vrijeme zadra-
vanja analita, a tM zadrano vrijeme pokretne
faze. Odnos spomenutih vremena zadravanja
prikazan je na slici 2.
Slika 2. Odnos vremena zadravanja analita, tR, i
vremena zadravanja pokretne faze, tM
Figure 2. Correlation between retention times of
analyte, tR, and mobile phase, tM
Faktor razdvajanja (separacijski faktor)
Separacijski faktor je mjera selektivnosti kroma-
tografskog sustava za dva razliita analita, a ovisi
o interakciji spoja sa stacionarnom fazom. Mogu-
e ga je definirati izrazom A/B = k2/k1 = tR2/tR1, pri
emu je tR2 = prilagoeno vrijeme zadravanja
analita 2, a tR1 = prilagoeno vrijeme zadravanja
analita 1.
Broj teorijskih tavana N
Broj teorijskih tavana predstavlja broj pseudorav-
notea ili faznih prijelaza postignut na odreenoj
2
koloni, a zadan je izrazom N= 16(tR/wb) , pri emu
je w irina pika u osnovici (slika 3). Djelotvornost
b
kromatografske kolone poveava se poveanjem
broja teorijskih tavana.
Slika 3. Nain raunanja broja teorijskih tavana N
Figure 3. Calculation of the number of theoretical
plates N
220 http://hrcak.srce.hr/medicina
Razluivanje
Razluivanje (slika 4) je mjera za efikasnost odje-
ljivanja dvaju spojeva, a ovisi o faktoru zadrava-
nja, faktoru razdvajanja i broju teorijskih tavana.
Definirano je izrazima Rs= 2 (tR2-tR1)/(wb1+ wb2) ili
1/2
R= 0.25 (N) [(-1)/ ] [(k2/k2+1)].
Slika 4. Primjeri razliito razluenih pikova i osnovnih
veliina koje se koriste u izraunu N, R, i k
Figure 4. Examples of badly and well resolved peaks and
basic terms used for calculation of N, R, and k
OSNOVE SPEKTROMETRIJE MASA8
Razluivanje
Razluivanje je mjera za djelotvornost odvajanja
iona priblino istih masa, a definira se kao
R= m/m, pri emu je R razluivanje, m prosjena
molekulska masa na vrhu masenog pika, a m ras-
pon masa na polovici visine masenog pika. Razlika
izmeu m i m masenog pika prikazana je na slici 5.
Slika 5. Prikaz m i m na primjeru masenog pika
Figure 5. Correlation between m and m of mass peak
Tonost mjerenja masa
Sposobnost spektrometra masa da odredi mole-
kulsku masu im blie tonoj masi (izotopna
masa), obino mjerena u ppm-ima, naziva se to-
no mjerenje masa. U izrazu
ppm = 10 mtona/mmjerena
6
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

mtona predstavlja razliku izmeu izraunate i iz-

mjerene molekulske mase. Razlike u tono i ne-
tono izmjerenim masama prikazane su na slici 6.

Slika 7. Odnos odziva detektora i standardne devijacije napona

Slika 6. Primjeri a) i b) netono izmjerenih masa kod
analizatora niskog i visokog razluivanja i c) i d) tono
izmjerenih masa kod analizatora niskog i visokog
razluivanja
Figure 6. Examples of a), b) incorrectly and
c), d) correctly measured masses obtained by low and
high resolution analyzers
Podruje mjerenja masa
Podruje mjerenja masa definirano je kao raspon
izmeu gornje i donje granice m/z koji se moe
odrediti spektrometrom masa
mpodruja = mgornja granica- mdonja granica
osnovne linije
Figure 7. Correlation between detector response and standard
deviation of baseline
Brzina snimanja spektara (engl. scan speed)
Za optimalan izgled spektra poeljno je snimiti
barem deset toaka unutar jednog masenog vr-
ka. Brzina snimanja je mjera brzine snimanja za-
danog raspona masa zadana u masenim jedinica-
ma po sekundi snimanja = (dm/dt), gdje je dm
zadano podruje masa, a dt vrijeme potrebno za
snimanje zadanog podruja masa. Struja iona je
mjerena i pohranjena na maksimumu svakog sni-
manja masenog vrka (slika 8).

pri emu je mgornja granica najvea mogua izmjerena

masa, a mdonja granica najmanja mogua izmjerena
masa.
Osjetljivost
Mjera odziva detektora koja se dobiva analizom
odreene koliine analita naziva se osjetljivost.
Definirana je izrazom Sm/z = Amasa-struja /(G muzorka),
gdje je Amasa-struja povrina ispod masenog pika
mjerena u vremenu i izraena u kulonima, G visi-
na odziva detektora iona, a muzorka masa analizira-
nog uzorka u g.
Slika 8. Struja iona mjerena i pohranjena na maksimumu svakog
Granica detekcije snimanja masenog pika
Granica detekcije je najmanja mogua koliina Figure 8. Ion current measured and stored at the maximum of each
uzorka koju je mogue kvalitativno odrediti. Iz- scan of mass peak

mjereni napon signala za odreeni analit, V mjereni,

izraava se kao Vmjereni > Vosnovne linije + 3osnovne linije, pri
emu je Vosnovne linije uprosjeeni napon u nekom za-
danom vremenu, a osnovne linije standardna devija-
cija napona osnovne linije u zadanom vremenu.
Odnos odziva detektora i standardne devijacije
napona osnovne linije prikazan je na slici 7.
Kromatogrami i spektri
Ako usporeujemo naine snimanja spektara
masa, razlikujemo dva naina snimanja: kontinui-
rani i centroidni spektar. Kontinuirani spektar masa
(slika 9a) prikazuje stvarnu spektrometrijsku irinu
masenog vrka. Taj nain snimanja spektara masa

medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232 http://hrcak.srce.hr/medicina 221

 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
je po koliini dobivenih podataka bogatiji, ali znat-
no vie optereuje memoriju raunala. Centroidni
spektar masa (slika 9b) prosjene mase masenih
vraka prikazuje kao stupce, bez stvarne irine i
pogodan je za rutinske analize.
Slika 9. Kontinuirani (a) i centroidni (b) spektar masa
Figure 9. Continuum (a) and centroid (b) mass spectrum
NAINI IONIZACIJE U VEZANOM SUSTAVU
LC MS
Tekuinski kromatograf i spektrometar masa po-
vezani su meuspojem (engl. Interface) koji ima
viestruku ulogu: otparavanje tekuine, ionizacije
neutralnih molekula i uvoenje analita u analiza-
Slika 10. Procesi prijenosa naboja u tehnici ESI
Figure 10. Charge transfer processes during the ESI process
222 http://hrcak.srce.hr/medicina
tor8. Meufazni prijelazi koji se dogaaju u me-
uspoju su otparavanje i desorpcija.
ESI (engl. Electrospray Ionization)
ESI je jedan od najzastupljenijih naina ionizacije u
vezanom sustavu LC-MS koji je kompatibilan sa
svim analizatorima. Radni protok mu je od 5 l do
1000 l u minuti, a kompatibilan je sa svim anali-
zatorima (optimalan protok ovisi o konstrukciji in-
strumenta, ali ugrubo moemo rei da iznosi oko
50 l). Ionizacija moe biti pozitivna i negativna (u
ovisnosti o naponu na kapilari i kolektorskoj elek-
trodi), a ionizacija i nebulizacija se dogaaju pri
atmosferskom tlaku. Optimalna temperatura ioni-
zacije je iznad 100 C i dogaa se u struji duika.
Ionizacija (slika 10) se odvija tako da pokretna faza
i analit ulaze u ionizator kroz kapilaru (iglu), koja
ujedno predstavlja elektrodu pod visokim napo-
nom (2-5 kV). Na vrku igle se formira maglica sa-
stavljena od niza kapljica otapala i neto uparenog
otapala. Kolektorska elektroda privlai tako nabije-
ne kapljice i daje im dodatno ubrzanje. Kako ota-
palo otparava pod utjecajem struje duika, tempe-
rature i elektrinog potencijala (ioni unutar otapala
pokuavaju doi na povrinu), tako se kapljice sma-
njuju. Nakon to se dovoljno smanje da se svi mo-
gui ioni nalaze na povrini kapljica, sile kulonskog
odbijanja postaju vee od sila napetosti povrine i
kapljice se otparavaju ili se razbiju na manje kaplji-
ce. Analit kristalizira ili prelazi u plinsku fazu. Ioni
analita u trenutku naputanja povrine nisu u pot-
punosti bez otapala, oko njih se, naime, stvara sfe-
ra uparenog otapala. Nakon otparavanja kapljica,
otvor iza kojeg je visoki vakuum i analizator privlai
tako formirane kvazimolekulske ione8,9.
Kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku APCI
(engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
APCI je vrlo zastupljena tehnika ionizacije, koja je
kompatibilna sa svim analizatorima. Radni protok
je od 0,5 ml do 2 ml u minuti. Moe ionizirati i
polarne i nepolarne molekule. Ionizacija se doga-
a pri atmosferskom tlaku i moe biti pozitivna i
negativna. Optimalna temperatura ionizacije je
oko 400 C i dogaa se u struji duika. Kao i kod
ESI ionizacije, ionizacija APCI tehnikom dogaa se
pod atmosferskim tlakom u struji duika. Ionizaci-
ja se, za razliku od ESI ionizacije, dogaa u plin-
skoj fazi, a uzrokuje ju prijenos naboja meu ioni-
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

ma, gdje je inicijator ionizacije izbijajua igla

(2 5 kV) na samom ulazu pokretne faze i analita
u ionizator. Kaskadnim prijenosom naboja od N2+,
O2+ i NO+ stvara se hidratni proton H30+(H2O)n koji
kao vrlo reaktivni ion vri prijenos protona i na-
boja na molekulu analita. Kod negativne ionizaci-
je izbijajua igla emitira elektrone koji u sudaru s
neutralnim esticama mogu formirati ione O2- ili
O-. Najvei izvor negativnih iona u APCI ionizaciji
su superoksidni anion O2- i odgovarajui hidrati i
klusteri O2- [H2O]n i O2- [O2]n. Nakon formiranja
primarnih iona molekule analita mogu se ionizi-
rati prijenosom naboja ili protona8,10,11. Slika 11. Udar akceleriranog atoma ili iona u molekule eluensa i trenutna
povrinska ionizacija istih
PB (engl. Particle Beam) Figure 11. Fast atom or ion bombardment of efluent molecules and their
PB je nain ionizacije koji uklanja pokretnu fazu current surface ionization
prije ionizacije. Ionizator se sastoji od generatora
aerosola, desolvatacijske komore i momentum ANALIZATORI MASA U VEZANOM SUSTAVU
separatora. LC MS
Generator aerosola raspruje mobilnu fazu i analit Analizator je dio spektrometra masa koji razdvaja
u sitne kapljice, a desolvatacijska komora pomae ione razliitog omjera mase i naboja. Razliiti
naglo otparavanje potpomognuto visokom tempe- analizatori zahtijevaju razliite ionizacijske izvore i
raturom. Momentum separator kroz niz sitnih
razliite detektore iona (tablica 1).
otvora uvodi analit iz atmosferskog tlaka u vakuum
analizatora. Naini ionizacije mogu biti EI, CI ili FAB. Tablica 1. Podjela analizatora masa po vrstama, ionskom izvoru i nainu
Ovaj je nain izuzetno pogodan za analizu moleku- razdvajanja iona
la manjih od 1.000 amu. Radni protok mu je od 0,1 Table 1. Classification of mass analyzers according to type, ion source and
ml do 1,5 ml u minuti, a radi samo sa kvadrupol- ion separation
nim i sektorskim analizatorima. Plin nosilac je helij, Analizator masa Ionski izvor Nain razdvajanja iona
upravo stoga to taj plin ima veu toplinsku vodlji-
Kvadrupol Kontinuirani Elektrino polje i propusni
vost. U sluaju PB isti izvor ionizacije, analizator i filtar
detektor, mogu se koristiti za analize LC i GC8. Stupica iona Pulsni Napon i rf polje

CFFAB Vremena leta Pulsni Vrijeme leta

(engl. Continuos Flow Fast Atom Bombardment)
CFFAB je tehnika ionizacije koja otapalo s kolone
uvodi direktno u podruje visokog vakuuma, a
radi iskljuivo sa sektorskim analizatorima koji
imaju radni protok od 0,5 ml do 10 ml u minuti.
Sredstvo ionizacije su pri tome atomi Xe, Ar ili Cs
dodatno usmjereni i akcelerirani (8 keV) prema
molekulama analita koji se pak nalazi u matrici
(nitrobenzilni alkohol, glicerol ili tioglicerol). Po-
kretna faza, analit i matrica, na ulazu u ionizator
razmazuju se u tanki sloj, pokretna faza otparava,
a matrica i analit su izloeni udaru akceleriranih
atoma (slika 11). Mehanizam ionizacije je desorp-
cija, a ionizacija moe biti pozitivna i negativna.
Ova je ionizacija poznata kao LSIMS (engl. Liquid
Secondary Ionization Mass Spectrometry)9.
Sektor Kontinuirani Magnetsko polje
Fourier Transform Pulsni Frekvencija
Kvadrupol
Kvadrupol (slika 12) je jedan od najzastupljenijih
analizatora, a sastoji se od etiri elektrode koje su
dijagonalno elektriki povezane; jedan par pri
tome ima pozitivni, a drugi negativni polaritet.
Dodatno su ti parovi jo spojeni s radiofrekvent-
nim potencijalom izmjenine struje koji je za 180
stupnjeva izvan faze. Ioni koji ulaze u analizator
imaju razliite vrijednosti m/z i u ovisnosti o pri-
mijenjenoj struji i polju, a mogu zadrati stabilnu
putanju i proi analizator ili dotaknuti elektrode i
postati neutralne molekule.

medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232 http://hrcak.srce.hr/medicina 223

 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
Slika 12. Presjek kvadrupola
Figure 12. Quadrupol
Kvadrupolni analizator moe maksimalno razdvojiti
ione ija razlika u masi nije vea od 0,5 amu. Ako
se kvadrupol koristi kao jedini analizator, gornja
granica podruja mjerenja masa je oko 4000 amu.
XZ-filtar lakih iona
Kako bi bilo jasnije kako kvadrupol radi, potrebno
je obratiti panju na pozitivni par elektroda i pret-
postaviti kako se u analizatoru nalazi pozitivni ion.
U odsutnosti istosmjernog potencijala ioni tee k
sredini procjepa izmeu elektroda za vrijeme pozi-
tivne polovice izmjeninog ciklusa i k elektrodama
za vrijeme negativnog izmjeninog ciklusa. Ako za
vrijeme negativnog izmjeninog ciklusa ion udari u
elektrodu, bit e neutraliziran (slika 13).
Slika 13. Gibanje iona u kvadrupolu pod utjecajem rf polja, te xz i yz filtar
iona
Figure 13. Ion trajectories in quadrupol rf field, and xz and yz ion filter
S obzirom na to da gibanja iona jednakih Ek ovise
proporcionalno drugom korijenu njihovih masa,
ako je ion dovoljno teak, frekvencija izmjeninog
potencijala moe biti velika, a ion nee znaajnije
osjetiti izmjenini potencijal i bit e pod utjeca-
224 http://hrcak.srce.hr/medicina
jem istosmjernog potencijala. Ako je ion laki, a
izmjenini potencijal premalen, ion e se sudariti
s elektrodom za vrijeme negativnog izmjeninog
ciklusa. Negativni par elektroda bez izmjeninog
potencijala privui e sve pozitivne ione i neutra-
lizirati ih. Za lake ione taj uinak moe se izbjei
povoljnom primjenom izmjeninog potencijala
koji moe utjecati na njihovu putanju.
YZ-filtar teih iona
Negativni par elektroda je pod stalnim naponom
negativnog istosmjernog potencijala. U odsutno-
sti izmjeninog potencijala svi pozitivni ioni bit e
privueni negativnim elektrodama. Ako je ion do-
voljno lagan, na njega e djelovati izmjenini po-
tencijal koji e ga drati u stabilnoj putanji podalje
od elektroda8,9,12.
Fourier-transformirana spektrometrija masa
FTMS (engl. Fourier Tansform Ion Cyclotron
Resonance Mass Spectrometry FT ICR MS)
Osnovna naela ionsko-ciklotronske rezonancije
Ovom metodom moe se odrediti omjer m/q
(mase i naboja) pomou eksperimentalno mjerlji-
ve orbitalno ciklotronske frekvencije iona c.
Princip pobude i detekcije koji se danas veinom
primjenjuje kod svih instrumenata FT ICR poznat
je ve dugi niz godina i datira iz 1970. godine.
Osnova metoda rada kod ove metoda je pobuda
iona do ICR orbitalnog promjera koji je samo ne-
koliko milimetara manji od detekcijskih elektroda
iji je zadatak detekcija izmjeninog napona indu-
ciranog koherentnim gibanjem iona nakon isklju-
enja pobude. To u osnovi konstrukcije instru-
menta FT ICR znai da FTMS elija slui kao ionski
izvor, analizator masa i detektor. U ICR eliji na
ion mase m i naboja q koji se giba brzinom u
uniformnom magnetskom (B = B0 j) i elektrinom
(E) polju djeluje Lorentzova sila
2
d r dv
m =m = qE + qv x B (1)
dt 2 dt
gdje je r vektor poloaja iona u vremenu t, prema
konvenciji se smjer konstantnog magnetskog po-
lja B0, podudara s osi z koordinatnog sustava. U
odsutnosti elektrinog polja (E = 0) sila je neovi-
sna o poloaju iona. Ion koji se giba u ravnini oko-
mitoj na smjer magnetskog polja bit e zakrenut
u krunu putanju magnetskom silom koja je oko-
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
mita na smjer magnetskog polja i na vektor brzi-
ne, dok e gibanje du osi z ostati neogranieno,
budui da u tom smjeru ne djeluje nikakva sila.
Tako za ion frekvencije c jednadba (1) prelazi u
jednadbu koja opisuje kutnu orbitalno ciklotron-
sku frekvenciju iona,
v qB0
c = 2 Nc = = (2).
r m
Iz ove druge jednadbe moe se zakljuiti da
odreene m/q vrijednosti ne ovise o poetnoj br-
zini iona. Budui da statino magnetsko polje pre-
tvara m/q u frekvenciju, a kako ICR frekvencije
jednostruko nabijenih iona od 10 u do 10.000 u u
magnetskom polju jakosti 3T (vea jakost polja
pridonosi boljoj rezoluciji spektara) pokrivaju ra-
diofrekventno podruje od 5 MHz do 5 kHz, unu-
tar kojeg je mogue odrediti frekvenciju s velikom
tonou, ICR daje mogunost izuzetno tonog
mjerenja mase ( 1 ppb u idealnim uvjetima) pri
visokom razluivanju (106 za m/q 900). Osim
odnosa c m/q, moe se izraunati iznos orbi-
talnog polumjera
mv xy
r=
qB 0
ili
m v 2
xy 1 Fourierova transformacija pretvara sloeni oblik
kT = r= 2mkT
2 qB 0
za ion kojem je prosjena x-y translacijska energi-
ja u ravnotei s okolinom na temperaturi T. Ova
jednadba ima posebnu primjenu u raunanju
energija vezanja nekovalentnih kompleksa kod
proteina, gdje se iz ove jednadbe primjenom
elektromagnetskog polja koje uzrokuje disocijaciju
nekovalentnog kompleksa moe izraunati ukup-
na energija vezanja u nekovalentnom kompleksu.
Brzina i translacijska energija iona pobuenog na
vei orbitalni polumjer ICR dane su izrazima:
qB0 r
v xy =
m Figure 14. Spectrum (-domain) obtained by Fourier transform of t-domain
2
mv xy q 2 B 02 r 2
Ek = = (4b)
2 2m
Tako jednostavnim raunom moemo dobiti ICR
polumjer jednostruko nabijenog iona na sobnoj
temperaturi m = 100 u u magnetskom polju in-
dukcije 3T od 0,08 mm, a nakon pobude na
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
r = 1 cm imat e brzinu od 2,89104 ms-1, odnosno
translacijsku energiju od 434 eV. Orbitalno gi-
banje ICR samo po sebi ne moe proizvesti mjer-
ljivi elektrini signal zato to krune putanje iona
nisu u fazi, pa se na elektrodama ponitavaju.
Ovaj problem rijeen je pomicanjem paketa
iona s osi z u prostorno koherentne putanje. Pro-
storna koherentnost postie se primjenom oscili-
rajueg (rezonantnog fazno-koherentnog elektri-
nog polja = 0), stoga kao krajnji rezultat
dobivamo gibanje iona u Arhimedovoj spirali. Za
ione koji rotiraju u putanjama ICR ubrzavanjem
dolazi do linearnog porasta radijusa putanja, te
ion apsorbira energiju u vremenu dt. Za dobiva-
nje jasnijeg prikaza apsorpcije energije iona u
magnetskom polju jakosti 3T pri djelovanju kon-
stantnog rf polja amplitude 1 V cm-1 kroz 1 ms,
njegov konani polumjer ICR iznosit e 1,67 cm
(5). Kako orbitalni polumjer pobuenog iona ne
ovisi o m/q vrijednosti, svi ioni u odreenom po-
druju m/q mogu se pobuditi na isti polumjer ICR
primjenom konstantnog rf polja kroz jednako
dugo vrijeme (Texc). Konani polumjer ICR iona
podvrgnutog nerezonantnoj pobudi ( 0) nee
(3a)
se poveavati, ve e prisilno titrati.
Fourierova transformacija
(3b)
signala u valnoj formi (t-domena) u frekvencijski
oblik (-domena) koji je razumljiviji korisniku in-
strumenta (slika 14).
Slika 14. Spektar (-domena) dobiven Fourierovom tranformacijom
signala t-domene sadri niskofrekventni sinusoidni val skriven u umu
(4a)
signal consists of low-frequent sinusoidal wave hidden in noise
Izvrimo li nad funkcijom f() neku eksplicitnu ope-
raciju T, dobit emo funkciju T{ f() } F(), stoga
kaemo kako je F() transformacija funkcije f(), a
kontinuirana Fourierova transformacija je inte-
gralni operator s eksponencijalnom jezgrom:
http://hrcak.srce.hr/medicina 225
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
F ( s ) = f ( x ) exp( i2P sx) dx (5)
gdje je s transformirana varijabla. Zamijenimo li
kompleksnu funkciju f(x) nekom koja ovisi o kon-
tinuiranoj realnoj varijabli x, s n funkcijskih vrijed-
nosti (openito kompleksnih, ali najee realnih)
indeksiranih cijelim brojevima () od 0 do n-1, do-
bit emo tzv. diskretnu FT.
1 n1
n
F ( v) = f (T ) exp( i 2PNT /n ) (6)
T =0
Eksperimentalni podaci su diskretne vrijednosti,
pa je i FT diskretan. Osnovna prednost spektro-
metrije FT u odnosu na ostale spektrometrije je
istovremena detekcija cijelog spektra. Takoer je
mogue primijeniti uklanjanje uma i filtriranje
spektra, te poveati rezoluciju smanjenjem irine
signala ili uzimanjem u izraun veeg broja toaka
po signalu. Loa strana ove spektrometrije je i-
njenica da je Fourierova analiza prikladna samo
za linearne sustave (odziv mora biti linearan po-
budi na svakoj frekvenciji), pa svaka nelinearnost
poveava mogunost pojave artefakata u spek-
tru.
Pobuda SWIFT i viestruka spektrometrija masa
MSn
U idealnom sluaju beskonanih pobudnih elek-
troda, amplituda signala ICR linearno je razmjer-
na amplitudi pobudne funkcije. Od 1980. nadalje
poznata je nova klasa pobudnih funkcija poznata
kao SWIFT (engl. Stored Wave Inverse Fourier
Transform). Pobuda SWIFT definira se specificira-
njem optimalnog diskretnog spektra u -domeni
koji se diskretnom IFT pretvara u pobudnu funkci-
ju t-domene. Pohranjeni podaci t-domene prola-
skom kroz digitalno/analogni-D/A pretvara daju
analognu valnu funkciju koja se potom koristi kao
pobuda. FTMS uz primijenjeni SWIFT gotovo je
idealna metoda za viestruki MS (MSn). Nakon iz-
dvajanja odreenog prekursor-iona (M+) i izbaci-
vanja svih ostalih iona iz elije, M+ se pobuuje
na vei ICR orbitalni polumjer, odnosno veu
translacijsku energiju. Potom se u eliju dovodi
inertni plin koji u sudaru sa M+ proizvodi produkt
ione koji se ponovno mogu selektirati i pobuditi
na ICR putanje, te ponovno fragmentirati.
226 http://hrcak.srce.hr/medicina
Praktina primjena spektrometrije masa
Fourier-transform u analizi proteina
S obzirom na to da se kod sustava FTMS najee
upotrebljava tehnika elektrorasprenja za ioniza-
ciju analita, kod proteinskih analiza mora se obra-
titi pozornost na nekoliko specifinosti vezanih uz
ovakvu vrstu analiza. Tipian proteinski spektar
masa dobiven elektrorasprenjem izgleda kao niz
pravilno poredanih vrkova koji simetrino rastu
do nekog maksimuma i tada ponovno padaju. Ra-
zlog takvog izgleda spektra prvenstveno lei u
tome to se protein tijekom ionizacije viestruko
ionizira (prima vie od jednog protona), ugrubo
jedan proton po kDa. Konani proteinski spektar
masa u sebi sadri cijeli niz viestruko nabijenih
iona proteina od kojih pak svaki ponovno sadri
simetrino poredani niz vrkova koji rastu do
maksimuma i ponovno padaju (slika 15).
Slika 15. Spektar masa FT ICR dobiven elektrorasprenjem (9,4 T)
mutanta veznog proteina (C22A) FK506. Gornji dio slike prikazuje
spektar masa prirodno zastupljene izotopske distribucije
(~99,63% 12C; ~98,89 14N). Donji dio slike prikazuje spektar masa
istog proteina koji je biotehnoloki proizveden uz upotrebu
hranjive podloge koja je sadravala 99,95% 12C i 99,99% 14N.
Figure 15. FT ICR MS spectrum obtained by electrospray (9.4 T)
of mutant binding protein (C22A) FK506. Upper part shows mass
spectrum of normal isotopic distribution (~99.63% 12C;
~98.89 14N). In lower part mass spectrum of protein produced
biotechnologically by using medium containing 99.95% 12C and
99.99% 14N is shown.
U ovom sluaju radi se o razlici u izotopskoj zastu-
pljenosti pojedinog viestruko nabijenog iona.
Ako je rezolucija dovoljno velika, tada e svaki
izotopski vrak biti razluen bolje od 1 u, te e vri-
jediti pravilo m/q = 1/q. Dakle, naboj viestruko
nabijenog iona, odnosno broj vezanih protona na
molekulu proteina moemo izraunati kao reci-
pronu vrijednost razlike susjednih vrkova u
spektru masa viestruko nabijenog iona. Ovo
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
svojstvo vrijedi jedino kod analiza FTMS, jer jedi-
no FTMS spektri masa imaju dovoljno veliku rezo-
luciju.
Drugi problem koji nastaje u ovakvim spektrima
masa izrazito visokog razluivanja jest da, iako
omjer m/q izmjerimo s pogrekom manjom od
1 ppm, i dalje pogreka u izraunu moe biti vea
od 1 Da (valja imati na umu da nisu svi ugljici 12C,
svi duici 14N, svi kisici 16O, svi sumpori 32S itd.).
Ipak, im je rezolucija i preciznost mjerenja mase
vea, time je i opis nekog proteinskog sustava re-
alniji, odnosno prirodniji, za razliku od, primjeri-
ce, spektara masa dobivenih ostalim tehnikama
MS, koje kod ovako velikih masa daju prikaz samo
jednog viestruko nabijenog iona prosjene mase.
Ako uspijemo izmjeriti masu proteina s pogre-
kom manjom od 1 Da, moemo takoer uoiti sve
mogue translacijske modifikacije kod proteina ili
sve degradacijske promjene koje mogu nastati
uvanjem ili izolacijom proteina (-S-S- veza je za
2 Da manja od 2 SH, deamidacija NH2 je za
1 Da manje mase od OH itd.).
Analizator vremena leta TOF
(engl. Time of flight)
Princip rada analizatora vremena leta temelji se
na pravilu da brzina iona ovisi o masi iona. Svi
ioni koji ulaze u analizator imaju razliitu brzinu
koja ovisi o njihovoj masi; manji ioni veu brzinu,
a vei ioni manju brzinu. Separacija iona vri se u
odnosu na brzinu iona koji dolaze na detektor u
razliitim vremenima. Ioni mogu ui aksijalno ili
ortogonalno u analizator, engl. pusher, on ih sa-
kuplja u odreenom vremenu, te zatim istovre-
meno otputa, a u trenutku otputanja ukljuuje
se mjerenje vremena leta do detektora. Vrijeme
leta iona od pushera do detektora je izmeu
5-100 s.
Analizatori TOF (slika 16) mogu imati ugraeno
ionsko ogledalo (engl. reflectron, ion mirror), koje
omoguava da ioni istih masa, a razliitih Ek,
dou do istovremeno detektora. Analizatori TOF
esto se hibridiziraju s kvadrupolnim analizatori-
ma, to im daje mogunost analiza MS/MS13.
Jednadbe kojima se moe opisati nain mjerenja
mase u TOF-u:
mv2 d m ( 2V e)
= qV q = ze t= = t2
2 v z d2
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
Slika 16. Presjek hibridnog analizatora MS/MS 8
Figure 16. Hybrid MS/MS8 analyzer
pri emu je m masa iona, v brzina iona, Ve napon,
q naboj iona, z ionski broj, e elementarni naboj, d
duljina cijevi i t vrijeme leta. Ako pretpostavimo
da su napon i duljina cijevi konstantni, m/z ovisi
jedino o vremenu leta iona. Da bi se moglo izmje-
riti vrijeme leta iona, mora se na samom poetku
analizatora primijeniti pulsno elektrino polje
koje ima ulogu sakupljanja i guranja iona u anali-
zator u kratkim pulsevima. Rezolucija TOF instru-
menata ne prelazi 20.000, na to najvei utjecaj
imaju vrijeme formiranja iona, prostorna raspo-
djela i raspodjela po Ek8,13.
Sektor
Postoje dvije vrste sektorskih analizatora, jedan s
magnetnim (B) i drugi s elektrinim (E) poljem, a
mogua je i njihova kombinacija. Za magnetno
polje vrijedi jednadba
mv = zeBr m
u kojoj je m masa iona, v brzina iona, ze naboj
iona, q naboj iona, a rm radijus analizatora. Za
elektrino polje vrijedi jednadba
mv2 zeV e
=
re d
pri emu je m masa iona, Ve potencijal primije-
njen na zakrivljenim ploama, ze naboj iona, d
udaljenost izmeu ploa i re radijus puta ulaska
iona u elektrino polje.
Kod dvostruko fokusirajuih sektora (slika 17) pri-
mjenjuje se i elektrino i magnetno polje, a ovi-
sno o izvedbi mogue su rezolucije od 10.000 do
100.000 i gornja granica masa od 100.000 amu12.
16951.4 amu = 11(1542.04 amu 1)
http://hrcak.srce.hr/medicina 227
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

Slika 17. Presjek dvostruko fokusirajueg sektorskog analizatora Slika 18. Maseni spektar mioglobina izoliranog iz konjskog srca
Figure 17. Double focusing sector analyzer Figure 18. Mass spectrum of horse heart myoglobin

PRIMJENA Izmjerene vrijednost m/z, kao i izraunate vrijed-

nosti naboja pojedinog iona te tone molekulske
ODREIVANJE MOLEKULSKE MASE PROTEINA mase mioglobina navedene su u tablici 2.
Postoji izravan pristup koji ukljuuje upotrebu in-
Tablica 2. Odreivanje broja naboja i molekulske mase
strumenata MALDI-TOF ili LC-FAB-MS (kao rezul- mioglobina
tat analize masa dobivaju se jednostruko, dvo- Table 2. Determination of myoglobin charge state and
struko ili trostruko nabijeni ioni) i neizravan its molecular weight
pristup koji ukljuuje upotrebu instrumenata Omjer mase i naboja Broj naboja Molekulska masa
ESI-MS (kao rezultat analize masa dobivaju se vi- m/z n RMM
estruko nabijeni ioni). 1524,04 11 16951,40
1413,59 12 16950,95
Izraun masa i naboja koritenjem
1304,93 13 16950,94
spektra masa8,9
1211,80 14 16951,11
Izraun tone molekulske mase analita pomou
1131,12 15 16951,62
viestruko nabijenih iona definiran je izrazom:
1060,46 16 16951,26
M = n(mn mH)
998,11 17 16950,67
pri emu je M molekulska masa, mH masa protona
942,75 18 16951,30
(1.00782 amu), n naboj viestruko nabijenog iona i
893,15 19 16951,71
mn izmjerena masa viestruko nabijenog iona.
848,47 20 16951,25
Naboj pojedinog iona odreen je jednadbom:
808,21 21 16951,14
mi +1 mH
i = 771,49 22 16950,72
mi mi +1
Srednja vrijednost 16951,09
pri emu je i naboj pojedinog iona, mi+1 izmjerena St. dev. 0,30
masa iona naboja veeg za 1 i mi izmjerena masa
iona kojem elimo odrediti naboj. Odreivanje molekulske mase proteina
Na primjeru mioglobina izoliranog iz konjskog tehnikom LC-ESI-MS
srca (slika 18) prikazan je primjer izrauna tone LC-ESI-MS je esto upotrebljavana tehnika u istra-
molekulske mase: ivanju nekovalentnih kompleksa. Dobivene spek-
16951.4 amu = 11(1542.04 amu 1) tre masa kompleksa potrebno je usporediti sa
Primjer izrauna naboja pojedinog iona (s jedana- spektrom masa samog proteina (slika 19). Zbog
est protona) mioglobina izoliranog iz konjskog srca: svoje blage ionizacije ESI je prikladan za proua-
vanje nekovalentnih veza protein-ligand (slika
1413.59 amu 1amu
10.99 = 20), protein-ligand-inhibitor (slika 21) ili protein-
1542.04 amu 1413.59 amu
-protein interakcija (slika 22)14.

228 http://hrcak.srce.hr/medicina medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232

 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

Slika 19. Spektar masa proteina apo-ras i

dekonvoluirani spektar masa
Figure 19. Mass spectrum of apo-ras protein and
deconvoluted mass spectrum

Slika 20. Spektar masa ras-GDP i dekonvoluirani

spektar masa
Figure 20. Mass spectrum of ras-GDP and
deconvoluted mass spectrum

Slika 21. Dekonvoluirani spektar masa

ras-GDP-SCH54341
Figure 21. Deconvoluted mass spectrum of
ras-GDP-SCH54341

Slika 22. Dekonvoluirani spektar masa -IFN dimera

s tri primijenjena napona od 50 V, 70 V i 100 V
Figure 22. Deconvoluted MS spectrum of -IFN
dimer obtained with voltage of 50 V, 70 V and 100 V

medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232 http://hrcak.srce.hr/medicina 229

 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
Utjecaj otapala na raspodjelu viestruko
nabijenih iona u ESI spektru masa
esto se postavlja pitanje kako utjecati na raspo-
djelu viestruko nabijenih iona proteina ako je
gornja granica odreivanja m/z niska (npr. 2.000
amu). Naime, najvei utjecaj na raspodjelu vie-
struko nabijenih iona proteina ima izbor otapala,
odnosno njegova fizikalno kemijska svojstva (pH,
toka vrelita, polarnost itd.). Ako se udio vode
kao otapala smanji, a povea udio metanola, ace-
Slika 23. ESI spektar masa citokroma c (10-5 mol/dm3
47%/50%/3%-voda/otapalo/octena kiselina s dodatkom (a) 0,01%,
(b) 0,03%, (c) 0,2% dietilamina kojem je GB = 920 kJ/mol
Figure 23. ESI MS spectrum of cytochrome c (10-5 mol/dm3 47%/50%/3%-
water/diluent/acetic acid with addition of (a) 0.01%, (b) 0.03%, (c) 0.2%
diethylamine; GB = 920 kJ/mol
tonitrila ili izopropanola, raspodjela viestruko
nabijenih iona se pomie k manje protoniranim
ionima. Ako se u otopinu proteina doda dietila-
min (<0.4%), takoer se raspodjela viestruko na-
bijenih iona pomie k manje protoniranim ioni-
ma, uslijed prijenosa protona s viestruko
nabijenih iona na dietilamin, ali je taj uinak puno
izraeniji nego kod promjene otapala (slika 23).
Instrumentalno se na raspodjelu viestruko nabi-
jenih iona moe utjecati smanjenjem ili povea-
njem broja sudara unutar ionizatora. Denaturira-
ni proteini imaju pomak raspodjela viestruko
nabijenih iona k vie protoniranim ionima, za ra-
zliku od onih gdje je tercijarna struktura uvelike
ouvana. Proton akceptori u proteinu su Arg, Lys,
His i N-terminus.
230 http://hrcak.srce.hr/medicina
Maksimalan broj protona u ionu proteina moe
se odrediti izraunom ukupne bazinosti svih ba-
zinih mjesta u proteinu u plinovitom stanju15:
n
q2
GB app GB unutarnja
i =1 ( 40 ) r ri, t
gdje je GBunutarnja bazinost plina u ESI-ju (otapalo i
plin nosilac), q naboj iona, e0 permitivnost vaku-
uma, er efektivna dielektrina polarizabilnost, a
ri,t = udaljenost bazinog mjesta u ionu od i-tog
susjednog naboja.
Tandemska spektrometrija masa (LC-MS/MS)
LC-MS/MS predstavlja dodatnu mogunost anali-
ze iona u vremenu ili prostoru, s ciljem da se una-
prijedi separacija ili izazove dodatna fragmentaci-
ja s pomou koje moemo kvalitetnije odrediti
strukturu analiziranog iona.
Spektrometre masa s analizatorom MS/MS mo-
emo podijeliti u tri skupine: spektrometri masa s
jednim analizatorom, kod kojih je teorijski mogu-
n
a analiza do MS (FTMS ili stupica iona), spektro-
metri masa s vie analizatora (trostruki kvadru-
pol, skraenica QQQ, engl. triple quadrupol, slika
2
24), analiza mogua do MS , spektrometri masa s
vie analizatora (trostruki kvadrupol, skraenica
QQQ, engl. triple quadrupol), mogunost analiza
2
do MS , te spektrometri masa s dva analizatora,
izmeu kojih se nalazi kolizijska elija (tzv. hibrid-
ni spektrometri masa npr. Q-TOF), kod kojih je
2
mogua analiza do MS 8.
Slika 24. Shematski prikaz trostrukog kvadrupola
Figure 24. Triple quadrupol
Hibridni spektrometar masa
U slijedu produkcije iona (engl. product ion mode)
po redoslijedu nastajanja razlikujemo ion prekur-
sor (engl. precursor ion) iz kojega mogu nastati
ioni produkti (engl. product ion) ili neutralne mo-
lekule zvane neutralnim gubitkom (engl. neutral
loss). Njihovi meusobni odnosi shematski su pri-
kazani na slici 25. U prvom koraku analize (MS)1
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...
Slika 25. Odnosi izmeu iona produkata, iona prekursora
i neutralnog gubitka
Figure 25. Correlation between product ion, precursor
ion and neutral loss
ioni odreene molekulske mase (ioni prekursori)
izoliraju se i uvode u kolizijsku eliju u kojoj se
fragmentacija postie sudarom s atomima argo-
na. Nakon sudara s molekulama plina nastaju fra-
gmenti iona prekursora odnosno ioni produkti
koji se analiziraju u drugom analizatoru (MS)2, te
na kraju detektiraju.
Spektralne baze podataka proteina i peptida
Spektralne baze podataka slue kao sredstvo
identifikacije odreenog proteina s danom vjero-
jatnou da je identificirani protein onaj pravi.
ESI-MS/MS baza podataka u kojoj su triptiki pro-
dukti identificirani (njihova masa i mase fragmen-
ta su odreene) moe uvelike olakati identifika-
ciju nepoznatog proteina. Proteini se mogu
razdvojiti iz smjese uz pomo 1-D ili 2-D gela (gel-
-elektroforeza) te se odsoliti, pa pocijepati tripsi-
nom, odnosno, ako je dovoljno ist moe se od-
mah pocijepati tripsinom, a produkti se mogu
razdvojiti uz pomo kromatografije obrnutih faza.
Na ovaj nain mogu se neposredno odreivati i
sastavi smjesa proteina. Za cijepanje aminokise-
linske sekvence proteina najee se koristi trip-
sin koji cijepa proteinski lanac na mjestima gdje
se nalaze lizin i arginin. Baza podataka sadri sve
mogue teorijski nastale peptide triptikim cije-
panjem ili molekulske ione peptida gdje su prote-
inski standardi visoke istoe pocijepani tripsi-
nom i potom analizirani16.
medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232
Odreivanje aminokiselinskog slijeda peptida
Odreivanje aminokiselinskog slijeda mogue je
kod peptida ija masa ne prelazi 2.500 amu, a u
tu se svrhu takoer koristi MS/MS nain analize17.
Baza podataka i algoritam za analizu iona oznaa-
va slovom b ione prepoznate gledano s N-termi-
nusa i slovom y gledano s C-terminusa (slika 2618).
Slika 26. Fragmenti proteinskih iona18
Figure 26. Protein ion fragmentation18
SwissProt (http://www.expasy.org) jedna je od
najveih baza podataka peptida i proteina koja se
moe koristiti kod identifikacije proteina ili odre-
ivanja aminokiselinskog slijeda proteina17.
ZAKLJUCI
Spektrometrija masa kao tehnika ima niz razliitih
primjena bez kojih su dananja istraivanja na po-
druju proteina nezamisliva. Proteomika se uveli-
ke zasniva ili na samoj spektrometriji masa ili na
vezanim sustavima tekuinskog kromatografa (u
posljednje dvije godine i kapilarna elektroforeza)
i spektrometra masa. Vezani sustavi se sve ee
primjenjuju u raznim analizama, a u okviru veza-
nih sustava, hibridni spektrometri masa daju
novu dimenziju kvalitativnim i kvantitativnim ana-
lizama. Spektralne baze podataka uvelike olaka-
vaju utvrivanje de novo strukture peptida i
mogu jednoznano identificirati protein preko
triptikih produkata i njihovih fragmenata u nai-
nu analize MS/MS. S obzirom na veliki broj
http://hrcak.srce.hr/medicina 231
 M. Cindri, A. Markovi, A. Horvati: Spregnute tehnike tekuinski kromatograf spektrometar masa...

proizvoaa spektrometara masa i tekuinskih 16. Bordoli R, Carruthers R, Cotrell J, Hoyers J, Hughes C,
Kapp E et al. Automated protein identification using ESI-
kromatografa, prilikom odabira opreme potrebno MS-MS, 47th ASMS, Dallas, Texas, USA, 1999.
je selektivno odabrati instrument namijenjen za 17. Siudzak G. Mass Spectrometry for Biotechnology. San
ciljanu skupinu analiza. Diego, California USA: Academic Press, 1997.
18. Gali N, Cindri M. Analiza protrina spektrometrijom
masa. Kem Ind 2008;57:231-43.
ZAHVALA
Ovaj rad nastao je uz financijsku potporu projekta
Ministarstva znanosti, obrazovanja i porta 098-
POPIS KRATICA
0982464-2393 i projekta Fonda za zapoljavanje i
APCI Kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku
razvoj RH 14V09809.
engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionization
CI Kemijska ionizacija
LITERATURA
engl. Chemical ionization
1. Baldwin MA, McLaerty FW. Liquid chromatography- CFFAB Udar ubrzanim ionima uz neprekinuti tok
mass spectrometry interface. I. The direct introduction engl. Continous Flow Fast Atom Bombardment
of liquid solutions into a chemical ionization mass spec-
DAD Detektor s nizom dioda
trometer. Org Mass Spectrom 1973;7:1111 and 1353.
engl. Diode array detector
2. Iribarne JV, Thomson BA. On the evaporation of small
EI Ionizacija elektronima
ions from charged droplets. J Chem Phys 1974;64:2287.
engl. Electron ionization
3. Whitehouse CM, Dreyer RN, Yamashita M, Fenn JB.
ESI Elektrorasprenje
Electrospray interface for liquid chromatographs and
engl. Electrospray
mass spectrometers Anal Chem 1985;57:675.
FAB Udar ubrzanim atomima
4. Scott RPW, Scott CG, Munroe M, Hess J. Interface for
engl. Fast atom bombardment
on-line liquid chromatography-mass spectroscopy
analysis. J Chrom 1974;99:395. FT ICR Analizator ionsko-ciklotronske rezonancije uz
Fourierovu transformaciju
5. Horning EC, Caroll DI, Dzidic I, Haegele KD, Horning MG,
engl. Fourier transform ion cyclotron resonance
Stillwell RN. New picogram detection system based on
a mass spectrometer with an external ionization source GC Plinska kromatografija
at atmospheric pressure. J Chrom Sci 1974;12:725. engl. Gas chromatography
6. Cerjan-Stefanovi , Drevenkar V, Jurii B, Medi-ari LC Tekuinska kromatografija
B, Petrovi M, Nikola egudovi N at al. Kromatografsko engl. Liquid chromatography
nazivlje. Zagreb: HINUS, Sekcija za kromatografiju HKDI, LSIMS Spektrometrija masa tekuinskom sekundarnom
1999. ionizacijom
7. Skoog DA, West DM, Holler FJ. Osnove analitike kemije. engl. Liquid Secondary Ionization Mass
1st edition. Zagreb: kolska knjiga, 1999:644-69. Spectrometry
8. Willoughby R, Sheehan E, Mitrovich S. A Global View of MALDI Matricom pomognuta ionizacija uz desorpciju
LC-MS. Pittsburg Pennsylvania, USA: Global View laserskim zraenjem
Publishing, 1997. engl. Matrix assisted laser desorption ionization
9. Micromass. Back to basics. v. 01. Manchester UK: Mi- MS Spektrometrija masa
cromass, 2001. engl. Mass spectrometry
10. Caroll DI, Dzidic I, Horning EC, Stillwell RN. Atmospheric MS/MS Tandemna spektrometrija masa
Pressure Ionization Mass Spectrometry. Appl Spectrosc engl. Tandem mass spectrometry
Rev 1981;17:337-406. PB Zraka estica
11. Johnston RAW, Rose ME. Mass spectrometry for chemi- engl. Particle Beam
sts and biochemists. Cambridge, UK: Cambridge Univer- PDA Fotodiodni detektor
sity Press, 1994. engl. Photodiode array
12. Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principles of instrumen- SWIFT Inverzna Fourierova transformacija s pohranom
tal analysis. Orlando, USA: Saunders College Publishing, vala
1998. engl. Stored Wave Inverse Fourier Transform
13. Pat S, Adams F, Innfante HG, Lemiere F. LC-GC 2001;12: Q-TOF Hibrid kvadrupola i analizatora koji mjeri vrijeme
24. leta
14. Pramanik BN, Bartner PL, Mirza UA, Liu YH, Ganguly AK. engl. Hybrid quadrupole-time of flight
Electrospray ionization mass spectrometry for the QQQ Trostruki kvadrupol
study of non-covalent complexes: an emerging techno- engl. Triple quadrupole
logy. J Am Soc Mass Spectrom 1998;33:911-20.
TOF Analizator koji mjeri vrijeme leta
15. Iavarone AT, Evan JC, Williams ER. Eects of solvent on
engl. Time-of-flight
the maximum charge state and charge state distributi-
on of protein ions produced by electrospray ionization. UV/VIS Ultraljubiasto/vidljivo
J Am Soc Mass Spectrom 2000;11:976-85. engl. Ultraviolet/visible

232 http://hrcak.srce.hr/medicina medicina 2009, Vol. 45, No. 3, p. 218-232