Prenatal HDAC inhibition causes autism-like behaviours 101

100 S. Kataoka et al.

(a) (b) (c)

AcH3 AcH4 AcH3/4
Total H3 Total H4 Total H3/4

800 2500 150

VPA
2000
600 VPA

100
% control

% control

% control
1500
400
1000
50
200
500

0 0 0

2 6 12 24 2 6 12 24 H3 H4
Time (h) Time (h)

Fig. 7. Prenatal exposure to valproic acid (VPA) at embryonic day 12.5 (E12.5) rapidly increases acetylated levels of histones H3
and H4 in the mouse embryonic brain. Embryos obtained from mothers treated with VPA (500 mg/kg i.p.) (a, b), valpromide
(VPD) (150 mg/kg s.c.) (c), saline (i.p.) (a, b) or vehicle (s.c) (c) at E12.5 were subjected to biochemical analysis at the indicated
times (a, b) or 6 h (c) after drug treatment. Whole brains from embryos exposed to the indicated drugs were lysed and subjected
to SDS–PAGE. Each panel consists of typical immunoblot images detected by antibodies against acetylated (upper) and total

Downloaded from http://ijnp.oxfordjournals.org/ by guest on August 30, 2016

histones (middle), and quantification of acetylated levels of histones H3 and H4, which were normalized by total levels of the
respective histones and expressed as % of saline- or vehicle-treated control. (a) Change in acetylated levels of histone H3 after
VPA exposure. (b) Change in acetylated levels of histone H4 after VPA exposure. (c) Change in acetylated levels of histones H3
and H4 after VPD exposure. Values represent means¡S.E.M. (n=4). *** p<0.001 vs. saline (unpaired t test).

Gbr. 7. Paparan asam valproat dalam kehamilan pada embrio hari ke 12 dengan cepat meningkatkan jumlah H3 dan H4 di otak
embrio tikus. Embrio ditemukan dari ibu yang di beri perlakuan dengan VPA (500mg/kp i.p.) (a, b), valpromide (VPD) (150
mg/kg s.c.) (c), saline (i.p.) (a, b) atau vehicle (s.c) (c), pada E12,5 yang diperlakukan untuk analisa biokima pada waktu
perlakukan (a, b) atau 6 jam (c) setelah pemberian obat. Seluruh bagian otak dari embrio ditunjukkan terhadap obat yang
setingkat dan subjek untuk SDS-PAGE. Beberapa panel terdiri dari gambar immublot tipikal yang ditemukan oleh antibody
terhadap asetil (atas) dan histon total (tengah), dan kuantifikasi tingkat asetil pada histon H3 dan H4, yang dinormalkan oleh
tingkat keseluruhan dari kepekaan histon dan diungkapkan sebagai salin (%) atau control perlakuan vehicle. (a) Perubahan
dalam tingkat asetil dari histon H3 setelah ditemukan VPA. (b) Perubahan dalam tingkat asetil dari H4 setelah ditemukan H4.
(c) Perubahan dalam tingkat asetil dari histon H3 dan H4 setelah ditemukan VPD. Hasilnya menunjukkan artian S.E.M (n=4). ***
p<0.001 vs. salin (Uji T tidak berpasangan).
Gambar 7. Paparan prenatal VPA (Asam Valproat) pada hari embrio 12.5 (E12.5) dengan cepat meningkatkan level asetilasi dari
Histon H3 dan H4 pada otak embrio tikus. Embrio yang diperoleh dari ibu yang diobati dengan VPA (500 mg / kg i.p.) (a, b),
Valpromide (VPD) (150 mg/kg s.c.) (c), salin (i.p.) (a, b) atau vehicle (s.c) (c) di E12.5 menjadi sasaran analisis biokimia pada waktu
indikasi (a, b) atau 6 jam (c) setelah pengobatan. Seluruh otak dari embrio yang terpapar obat indikasi segaris dan dikenakan
pada SDS-PAGE. Setiap panel terdiri atas gambar immunoblot khas yang dideteksi oleh antibodi terhadap asetilasi (atas) dan
jumlah histon (tengah) dan kuantifikasi dari tingkat asetilasi dari histon H3 dan H4, yang dinormalkan oleh jumlah tingkat dari
masing-masing histon dan dinyatakan sebagai % dari kontrol yang diobati dengan salin atau vehicle. (a) perubahan pada tingkat
asetilasi dari histon H3 setelah paparan VPA. (b) Perubahan pada tingkat asetilasi histon H4 setelah paparan VPA. (c) perubahan
pada tingkat asetilasi dari histon H3 dan H4 setelah paparan VPD. Nilainya menggambarkan means¡S.E.M. (n=4). *** p<0.001
vs. salin (Uji T tidak berpasangan).

2006). The present study revealed that VPA exposure
remarkably induced apoptotic-like cell death in the
embryonic neocortex at the peak level within 24 h after
drug administration to pregnant mice. In addition to
the VPA-mediated apoptotic phenomenon, we ob-
served that VPA exposure also immediately reduced
cell proliferation in the ganglionic eminence of the
embryonic brain. In contrast, VPA exposure at E14.5
had no effect on cell death and proliferation. Since
neurons generated in the neocortex and ganglionic
eminence finally differentiate into excitatory and in-
hibitory neurons, respectively, and migrate to cortical
cell layers (Lee et al. 2011 ; Marin & Rubenstein, 2001), it is likely that the
VPA-induced neuronal loss in the lower layers of the somatosensory cortex
is due to both apoptosis and reduced proliferation of newly gener- ating
neuronal cells during early embryonic brain development, especially around
E12.5. A variety of processes are known to be involved in apoptosis and
cell proliferation. Therefore, further studies are required to address how
VPA administration can ac- tivate apoptotic cell death pathways or inhibit
pro- liferation signals.
Hrebackova et al. (2010) have suggested that VPA- induced histone
hyperacetylation may be a possible mechanism for tumour cell death. In
addition, several studies have proposed that the HDAC inhibitory action of
VPA is closely related to teratogenesis (Downing et al. 2010 ; Tung & Winn,
2010). However, Prenatal HDAC
to date, inhibition
there is no causes
study autism-like
about the behaviours
involvement101 of
HDAC inhibition in VPA-induced ASD. The present
study indicates that the transient hyperacetylation of
histones H3 and H4, which is considered as a conse-
quence of HDAC inhibition, occurred in the embry-
onic brain immediately after VPA exposure. To better
clarify the role of HDAC inhibition in VPA-induced
autistic-like behaviours in mice, we examined the ef-
fect of prenatal exposure to VPD (150 mg/kg s.c.),
which exerts an equivalent pharmacological effect to
VPA without affecting HDAC activity (Eikel et al. 2006
; Nishikawa & Scatton, 1985), on behavioural
performance of offspring. We found that prenatal ex-
posure to VPD at E12.5 failed to exert such hyper-
acetylation of histones. We also found that prenatal
VPD exposure did not cause any change, such as be-
havioural alterations and embryonic brain develop-
mental impairment, observed in mice prenatally
exposed to VPA. These observations suggest that the
transient HDAC inhibition during the critical period of
embryonic brain development plays a fundamental
role in the pathogenesis of ASD in offspring exposed
to VPA. On the other hand, Lagger et al. (2002) found
that the homologous class I HDACs (HDAC1, HDAC2,
HDAC3) are highly expressed from mid to late
gestation, at the peak around E12.5. The finding may
give us a reasonable mechanistic explanation of why
the expression of autistic-like behaviours is lim- ited in
mice prenatally exposed to VPA at E12.5, and it
 102 S. Kataoka et al.

supports our idea that HDAC inhibition during the
critical period of embryonic brain development plays
a key role in the aetiology of ASD.
In conclusion, this study demonstrates that in mice,
prenatal VPA exposure at E12.5 causes social interac-
tion deficits, anxiety-like behaviour, learning deficits
and decreases in neocortical neuron density, similar to
those observed in humans with autism. Furthermore,
it is likely that these changes may be mediated by
inhibition of class I and/or IIb HDACs in a specific
embryonic period. This suggestion is supported by the
comparative study with VPA and VPD. However, the
effect of HDAC activity was transient, while the
behavioural phenotypes and some of the histological
finding were postnatal. Although further studies are
required to clarify how HDAC inhibition causes ana-
tomical and behavioural changes, the present study
implies that dysfunction of HDAC during pregnancy
(tengah) dan kuantifikasi dari tingkat asetilasi
dari histon H3 dan H4, yang dinormalkan oleh
jumlah tingkat dari masing-masing histon dan
dinyatakan sebagai % dari kontrol yang diobati
dengan salin atau vehicle. (a) perubahan pada
tingkat asetilasi dari histon H3 setelah paparan
VPA. (b) Perubahan pada tingkat asetilasi histon
H4 setelah paparan VPA. (c) perubahan pada
tingkat asetilasi dari histon H#
Penelitian ini mengungkapkan bahwa paparan
VPA menginduksi kematian sel seperti apoptosis
di neokorteks embrio pada tingkat puncak dalam
waktu 24 jam setelah pemberian obat ke tikus
yang hamil. Selain fenomena apoptosis yang

Downloaded from http://ijnp.oxfordjournals.org/ by guest on August 30, 2016

may be responsible for a higher risk of ASD in off-
spring. dimediasi VPA, kami mengamati bahwa paparan
Kesimpulannya, penelitian ini diujikan pada tikus, VPA juga mengurangi ploriferasi sel di ganglion
paparan VPA pada kehamilan terjadi pada saat embrio eminensia dari otak embrio. Sebaliknya, paparan
berusia 12 hari yang disebabkan penurunan interaksi
VPA pada E14.5 tidak memiliki efek pada
social, perilaku kecemasan, penurunan pembelajaran
dan pengurangan kepadatan neuron pada kematian ataupun proloferasi sel. Sejak neuron
neokortikal, sama dengan yang diamati pada orang yang dihasilkan di neurokorteks dan ganglion
autis. Selanjutnya, kemungkinan disana terjadi eminens akhirnya berdiferensiasi menjadi neuron
perubahan yang dikarenakan hambatan oleh HDACs
eksitatori dan inhibitori, masing-masing
tipe I dan atau IIb pada periode embrionik yang
spesifik. Pendapat ini didukung oleh penelitian lain berpindah ke lapisan sel kortikal (lee et al. 2011:
dengan VPA dan VPD. Bagaimanapun, efek dari Marin & Rubenstein, 2001), sepertinya VPA yang
aktivitas HDAC bersifat sementara, sedangkan menginduksi hilangnya neuron di lapisan bawah
beberapa fenotip dan histologi ditemukan setelah
dari korteks somatosensorik disebabkan oleh
kelahiran. Walaupun penelitian dibutuhkan untuk
membuktikan bagaimana hambatan HDAC apoptosis dan pengurangan ploriferasi dari sel
menyebabkan perubahan anatomi dan perilaku, neuron baru selama perkembangan awal otak
penelitian saat ini menyimpulkan bahwa kegagalan embrio, terutama disekitar E12.5. Berbagai proses
HDAC selama kehamilan mungkin bertanggung
telah diketahui terlibat dalam apoptosis dan
jawab untuk peningkatan resiko ASD pada keturunan
selanjutnya. ploriferasi sel. Oleh karena itu, penelitian lebih
lanjut diperlukan untuk mengetahui bagaimana
pemberian VPA dapat mengaktivasi jalur
Gambar 7. Paparan prenatal VPA (Asam
kematian sel apoptosis atau menghambat sinyal
Valproat) pada hari embrio 12.5 (E12.5)
proriferasi
dengan cepat meningkatkan level asetilasi
Hrebackova et al. (2010) telah menyarankan
dari Histon H3 dan H4 pada otak embrio
bahwa VPA-induksi hiperasetilasi histon,
tikus. Embrio yang diperoleh dari ibu yang
merupakan mekanisme yang memungkinkan
diobati dengan VPA (500 mg / kg ip) (a, b),
untuk kematian sel tumor. Selain itu, beberapa
Valpromide (VPD) (150 mg/kg sc) (c), salin
penelitian telah mengusulkan bahwa aksi hambat
(ip) (a, b) atau vehicle (sc) ( c) di E12.5 menjadi
HDAC VPA berkaitan erat dengan teratogenesis
sasaran analisis biokimia pada waktu indikasi
(Downing et al 2010;. Tung & Winn, 2010).
(a, b) atau 6 jam (c) setelah pengobatan.
Namun, sampai saat ini, tidak ada studi tentang
Seluruh otak dari embrio yang terpapar obat
keterlibatan penghambatan HDAC pada ASD
indikasi segaris dan dikenakan pada SDS-
diinduksi VPA. Penelitian ini menunjukkan
PAGE. Setiap panel terdiri atass gambar
bahwa hiperasetilasi transien histon H3 dan H4,
imunoblot khas yang dideteksi oleh antibody
yang dianggap sebagai konsekuensi dari
ymelawan asetilasi (atas) dan jumlah histon
penghambatan HDAC, terjadi di otak embrioPrenatal HDACperilaku
fenotipe inhibition dan
causesbeberapa
autism-liketemuan
behaviourshistologis
103

segera setelah terpapar VPA. Untuk lebih ditemukan postnatal. Sehingga, diperlukan studi
memperjelas peran penghambatan HDAC lebih lanjut untuk menjelaskan bagaimana
pada VPA yang menginduksi perilaku penghambatan HDAC menyebabkan perubahan
autistik seperti pada tikus, kami meneliti efek anatomis dan perilaku, penelitian ini
dari paparan prenatal dari VPD (150 mg/kg menunjukkan bahwa disfungsi dari HDAC
s.c), diberikann setara dengan efek selama kehamilan mungkin berperan untuk risiko
farmakologi untuk VPA tanpa menganggu tinggi ASD pada keturunannya.
aktivitas HDAC (Eikel et al 2006;. Nishikawa
& Scatton, 1985), pada kinerja perilaku dari
keturunan. Kami juga menemukan bahwa
paparan prenatal pada VPD di E12.5 gagal
menghiperasetilasi histon. Kami juga
menemukan bahwa paparan VPD pranatal
tidak menyebabkan beberapa perubahan,
seperti perubahan perilaku dan gangguan
perkembangan otak embrio, yang diamati
pada tikus terpajan VPA pranatal.
Pengamatan ini menunjukkan bahwa
penghambatan HDAC sementara selama
periode kritis perkembangan otak embrio
memainkan peranan penting dalam
patogenesis ASD pada keturunan yang
terpapar VPA. Di sisi lain, Lagger et al. (2002)
menemukan bahwa kelas I homolog
(HDAC1, HDAC2, HDAC3) sangat tinggi
diekspresikan dari pertengahan sampai akhir
kehamilan, pada puncak sekitar E12.5.
Penemuan ini dapat menjelaskan kita sebuah
penjelasan mengapa ekspresi prilaku seperti
autistic terbatas pada tikus yang terpapar
VPA di E12.5 secara prenatal, dan
mendukung ide kita bahwa penghambatan
HDAC selama periode kritis dari
perkembangan otak embrio memainkan
peran kunci dalam etiologi ASD.
Sebagai kesimpulan, penelitian ini
menunjukkan bahwa pada tikus paparan
VPA di E12.5 pranatal menyebabkan defisit
interaksi sosial, perilaku seperti kecemasan,
defisit belajar dan penurunan kepadatan
neuron neokorteks, serupa dengan yang
diamati pada manusia dengan autisme. Lebih
jauh lagi,, ada kemungkinan bahwa
perubahan ini dapat dimediasi oleh
penghambatan kelas I dan / atau IIb HDAC
dalam periode embrio yangspesifik. Hal ini
didukung oleh studi perbandingan dengan
VPA dan VPD. Namun, efek dari aktivitas
HDAC bersifat sementara, sedangkan