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Summary
Serological evidence of infection with HIV may be obtained by testing for presence of HIV antigens or antibodies in
serum of individuals suspected for HIV infection. Antigen can generally be detected during both acute phase and
the symptomatic phase of AIDS only. The antibodies to HIV-1 and/or HIV-2 can be detected throughout virtually the
whole infection period, starting at or shortly after the acute phase and lasting till the end stage of AIDS. Therefore,
the use of highly sensitive antibody assays is the primary approach in serodiagnosis of HIV infection. Apart from
sexual transmission, the principal route of infection with HIV is blood transfusion. HIV can present both in cellular
and cell-free fractions of human blood. Therefore, all donations of blood or plasma should be tested because due
to the risk of HIV transmission through contaminated blood. This can be effectively achieved by testing for the
antibodies to HIV-1 and HIV-2 by using a highly sensitive ELISA tests.
Principle
bioelisa HIV-1+2 3.0 is a two step incubation antigen “sandwich” enzyme immunoassay kit, in which the wells of a
microplate are coated with recombinant HIV antigens expressed in E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and
recombinant HIV-2 gp-36). Serum or plasma samples are added to these wells. If specific HIV1/2 antibodies are
present in the sample, they will form stable complexes with the HIV recombinant antigens. The microwells are then
washed to remove unbound serum proteins. A second set of recombinant antigens conjugated with peroxidase and
expressing the same epitopes are added to the wells. During the second incubation step, these antigens will bind
to the specific captured antibodies. After a second wash to remove unbound conjugate a Chromogen solutions are
added to the wells. In wells containing the antigen-antibody-antigen “sandwich” immunocomplex, the colorless
Chromogens are hydrolyzed by the bound conjugate to a blue colored product. The blue color changes to yellow
after blocking the reaction with sulfuric acid. The intensity of colour can be measured and is proportional to the
anti-HIV 1/2 antibodies concentration in the sample. Wells containing negative samples remain colourless.
Components
1. MCPL MICROPLATE:
12 x 8 wells coated with recombinant HIV 1/2 antigens (recombinant HIV-1 gp41, gp120, and recombinant
HIV-2 gp36). The microwell strips are for SINGLE USE only. Do not use if the vacuum sealing has been
damaged when first time taken of out the box.
5. CONJ CONJUGATE:
HIV-1 and HIV-2 recombinant antigens conjugated with peroxidase. Contains 0.1% ProClinTM 300 as
preservative and red dye. Ready to use.
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bioelisa
Precautions
bioelisa HIV-1+2 3.0 is intended for IN VITRO diagnostic use. IVD
For professional used only.
WARNING: Materials from human origin may have been used in the preparation of the negative control of the kit.
These materials have been tested with tests kits with accepted performance and found negative for antibodies to
HIV 1/2, HCV, TP and HBsAg. However, there is no analytical method that can assure that infectious agents in the
specimens or reagents are completely absent. Therefore, handle reagents and specimens with extreme caution as
if capable of transmitting infectious diseases. Bovine derived sera have been used for stabilizing of the positive and
negative controls. Bovine serum albumin (BSA) and fetal calf sera (FCS) are derived from animals from BSE/TSE
free-geographical areas.
The Negative Control, HIV-1 Positive Control, HIV-2 Positive Control and Conjugate contains 0.1% ProClinTM
as preservative. The following are the appropriate risk (R) and safety (S) phrases:
The ELISA assays are time and temperature sensitive. To avoid incorrect result, strictly follow the test
procedure steps and do not modify them.
1. Do not exchange reagents from different lots or use reagents from other commercially available kits. The
components of the kit are precisely matched for optimal performance of the tests.
2. Make sure that all reagents are within the validity indicated on the kit box and of the same lot. Never use
reagents beyond their expiry date stated on labels or boxes.
3. CAUTION - CRITICAL STEP: Allow the reagents and specimens to reach room temperature (18-30°C) before
use. Shake reagent gently before use. Return at 2-8°C immediately after use.
4. Use only sufficient volume of sample as indicated in the procedure steps. Failure to do so, may cause in low
sensitivity of the assay.
5. Do not touch the bottom exterior of the wells; fingerprints or scratches may interfere with the reading. When
reading the results, ensure that the plate bottom is dry and there are no air bubbles inside the wells.
6. Never allow the microplate wells to dry after the washing step. Immediately proceed to the next step. Avoid the
formation of air bubbles when adding the reagents.
7. Avoid assay steps long time interruptions. Assure same working conditions for all wells.
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8. Calibrate the pipette frequently to assure the accuracy of samples/reagents dispensing. Use different disposal
pipette tips for each specimen and reagents in order to avoid cross-contaminations.
10. When adding specimens, do not touch the well’s bottom with the pipette tip.
11. When measuring with a plate reader, determine the absorbance at 450 nm or at 450/620-630 nm.
12. The enzymatic activity of the conjugate might be affected from dust and reactive chemical and substances like
sodium hypochlorite, acids, alkalis etc. Do not perform the assay in the presence of these substances.
13. If using fully automated equipment, during incubation, do not cover the plates with the plate cover. The tapping
out of the remainders inside the plate after washing, can also be omitted.
14. All specimens from human origin should be considered as potentially infectious. Strict adherence to GLP
(Good Laboratory Practice) regulations can ensure the personal safety.
15. Never eat, drink, smoke, or apply cosmetics in the assay laboratory. Never pipette solutions by mouth.
16. Chemical should be handled and disposed of only in accordance with the current GLP (Good Laboratory
Practices) and the local or national regulations.
17. The pipette tips, vials, strips and specimen containers should be collected and autoclaved for not less than
2 hours at 121°C or treated with 10% sodium hypochlorite for 30 minutes to decontaminate before any further
steps of disposal. Solutions containing sodium hypochlorite should NEVER be autoclaved. Materials Safety
Data Sheet (MSDS) available upon request.
18. Some reagents may cause toxicity, irritation, burns or have carcinogenic effect as raw materials. Contact with
the skin and the mucosa should be avoided but not limited to the following reagents: Stopping solution, the
Chromogens, and the washing solution.
Available packaging
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Automatic processing
Automated or semi-automated assay may be used with different instruments. It is very important to validate any
automated system to demonstrate that results obtained for samples are equivalent to the ones obtained using
manual assay. It is recommended that the user validate periodically the instrument. If there is any difficulty in the
programming and setting of Biokit automatic processors, please contact your distributor.
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Step 1 Preparation: Mark three wells as negative control (e.g. B1, C1, D1), two wells as positive control
(e.g. E1 for HIV-1 and F1 for HIV-2) and one Blank (e.g. A1, neither samples or conjugate should be
added into the Blank well). If the results will be determined by using dual wavelength plate reader, the
requirement for use of Blank well could be omitted. Use only number of strips required for the test.
Step 2 Adding Sample: Add 100 μl of samples, and 100 μl of positive and negative controls into their
respective wells.
NOTE: Use a separate disposable pipette tip for each specimen, negative and positive control as to
avoid cross-contamination.
Step 3 Incubating Sample: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes. It
is recommended to use thermostat-controlled water tank to assure the temperature stability and
humidity during incubation. If dry incubator is used, do not open the door frequently.
Step 4 Washing(1): After the end of the incubation, remove and discard the plate cover. Wash each well
5 (five) times with diluted Washing buffer. Each time allow the microwells to soak for 30-60 seconds.
After the final washing cycle, turn down the plate onto blotting paper or clean towel and tap it to
remove any remainders.
Step 5 Adding Conjugate: Add 100 μl of conjugate reagent into each well except the Blank.
Step 6 Incubating Conjugate: Cover the plate with the plate cover and incubate at 37°C for 30 ± 1 minutes.
Step 8 Coloring: Add 50 μl of chromogen A and 50 μl of chromogen B solutions into each well including the
Blank. Incubate the plate at 37°C for 15 minutes avoiding light. The enzymatic reaction between
the chromogen solutions and the conjugate produces blue color in positive control and HIV 1/2
positive sample wells.
Step 9 Stopping Reaction: Using a multichannel pipette or manually, add 50 µl of stopping solution into each
well and mix gently. Intensive yellow color develops in positive control and HIV 1/2 positive sample wells.
Step 10 Measuring the Absorbance: Calibrate the plate reader with the Blank well and read the absorbance at
450 nm. If a dual filter instrument is used, set the reference wavelength at 620 nm or 630 nm.
Calculate the cut-off value and evaluate the results. (NOTE: read the absorbance within 10 minutes
after stopping the reaction).
Quality control
It is recommended that each laboratory must establish appropriate quality control system with quality control
material similar to or identical with the patient sample being analyzed.
- The Absorbance value of the Blank well, which contains only chromogen and stopping solution, must be less
than 0.080 at 450 nm.
- The Absorbance value of the positive control must be ≥ 0.800 at 450/620-630 nm or at 450 nm after
subtracting the blank.
- Each individual absorbance value of the negative control must be less than 0.100 at 450/620-630 nm or at
450 nm after subtracting the blank.
If one of the negative control values does not meet the Quality Control criteria, it should be discarded and the mean
value calculated again using the remaining two values. If more than one negative control Absorbance values do not
meet the Quality Control Range specifications, the test is invalid and must be repeated.
Results
Each microplate should be considered separately when calculating and interpreting the results of the assay,
regardless of the number of plates concurrently processed. The results are calculated by relating each specimen
absorbance (S) value to the cut-off value (CO) of the plate. If the cut-off reading is based on single filter plate
reader, the results should be calculated by subtracting the Blank well A value from the print report values of
specimens and controls. In case the reading is based on dual filter plate reader, do not subtract the Blank well A
value from the print report values of specimens and controls.
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Calculate the cut-off value by adding 0.120 to the mean absorbance of the negative control.
Example:
Blank well Absorbance value: A1= 0.025 at 450 nm (NOTE: blanking is required only when reading with single filter
at 450 nm).
Well No.: B1 C1 D1
Neg Ctrl: 0.012 0.010 0.011
Well No.: E1 F1
Pos Ctrl: 2.363 2.436
All controls values are within the stated quality control range.
Interpretation of results
Divide the sample absorbance by the cut-off value. (S/CO)
Negative Results (S/CO < 1): Specimens giving absorbance less than the cut-off value are negative for this assay,
which indicates that no anti-HIV 1/2 antibodies have been detected with bioelisa HIV-1+2 3.0 kit. A negative result
does not exclude the possibility of exposure or infection with HIV.
Positive Results (S/CO ≥ 1): Specimens giving an absorbance equal to or greater than the cut-off value are
considered initially reactive, which indicates that anti-HIV 1/2 antibodies have probably been detected using
bioelisa HIV-1+2 3.0. All initially reactive specimens should be retested in duplicates using bioelisa HIV-1+2 3.0
before the final assay results interpretation. Repeatedly reactive specimens can be considered positive for
antibodies to HIV 1/2 with bioelisa HIV-1+2 3.0.
Borderline (S/CO = 0.9-1.1): Specimens with absorbance to cut-off ratio between 0.9 and 1.1 are considered
borderline and retesting of these specimens in duplicates is required to confirm the initial results.
Follow-up, confirmation and supplementary testing of any positive specimen with other analytical system
(e.g. WB, PCR) is required. Clinical diagnosis should not be established based on a single test result. It should
integrate clinical and other laboratory data and findings.
INITIAL RESULTS INTERPRETATION AND FOLLOW-UP ALL INITIALY REACTIVE OR BORDERLINE SAMPLES
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Performance characteristics
Evaluation study carried in Alkmaar, the Netherlands, between April and November 2005, demonstrated the
following performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0.
The diagnostic specificity of the kit was 99.85% as determined on all negative samples (5471) that were
investigated. When examined on the unselected donors only (random and first time donors), the specificity was
99.92% (95% CI 99.84-100%).
All panels of HIV-1, HIV-1 subtype O and HIV-2 confirmed antibody positive samples that were used in this study
were also tested reactive with bioelisa HIV-1+2 3.0 which resulted in diagnostic sensitivity of 100%.
A total of 32 seroconversion panels, which represent 210 samples tested. 13 samples not classified from PRB918
and PRB917 because there are not data of Antigen or RNA determination required for the classification. 41
samples classified as negative. RNA and or Antigen negative. 61 samples classified as early-seroconversion. 95
samples classified as seroconversion.
The testing results also show that bioelisa HIV-1+2 3.0 is a state-of-the-art compare to most of the currently
available on the market CE-marked tests.
The analytical sensitivity was evaluated on PeliCheck anti-HIV panels. The analytical sensitivity of
bioelisa HIV-1+2 3.0 on the PeliCheck anti-HIV standard dilutions was comparable to other anti-HIV assays.
Analytical specificity:
bioelisa HIV-1+2 3.0 test results on samples from hospitalised patients and samples containing potentially
cross-reacting blood-specimens:
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- Possible high dose hook effect is eliminated due to the implementation of two-step procedure.
- Frozen positive/negative specimens have been tested to check for interferences due to collection and storage.
The performance characteristics of bioelisa HIV-1+2 3.0 were not affected for at least 3 freeze/thaw cycles.
- Samples from patients infected with hepatitis A,B,C and E viruses as well as samples from patients infected
with Treponema pallidum were tested with no cross-reactive reactions observed.
- 25 positive fresh serum samples tested in INSTITUTE FOR TROPICAL MEDICINE, BELGIUM have been
tested with bioelisa HIV-1+2 3.0. All 25 positive fresh serum samples have been positive with
bioelisa HIV-1+2 3.0.
Accuracy:
The below tables represent the results of analytical sensitivity and reproducibility of bioelisa HIV-1+2 3.0 as
controlled with PeliSpyMulti-Marker run control and with Internal QC sample tested in every plate, the 1:2048 dilution
of the anti-HIV standard in this PeliSpy sample was consistently detected in all plates. Internal QC sample was always
detected in all plates.
PeliSpyMulti-Marker results:
Percentiles Measured
Dilution n Average th
5 95th Min Max
1:2048 80 3.08 1.76 4.39 1.70 4.96
Percentiles Measured
n Average
5th 95th Min Max
160 7.71 5.32 10.10 4.37 10.89
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LEER CAMBIOS SOMBREADOS
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) tipo 1
(grupos M-O) o tipo 2 en muestras de suero o plasma humano para ser utilizado en laboratorios clínicos y
como análisis de cribado de primera línea en bancos de sangre.
Sumario
La demostración serológica de infección por HIV puede obtenerse comprobando la presencia de antígenos o
anticuerpos HIV en el suero de personas con sospecha de infección por HIV. En general, el antígeno sólo se
puede detectar en la fase aguda y en la fase sintomática del SIDA. Los anticuerpos frente a HIV-1 o HIV-2 pueden
detectarse casi durante todo el periodo de infección, comenzando en la fase aguda o poco después de esta y
manteniéndose hasta la fase terminal del SIDA. Por lo tanto, la utilización de análisis de anticuerpos altamente
sensibles es el primer abordaje en el serodiagnóstico de la infección por HIV. Aparte de la transmisión sexual, la
principal vía de infección por HIV es la transfusión de sangre. El HIV puede aparecer tanto en las fracciones
globulares como en las no globulares de la sangre humana. Por ello deberían analizarse todas las donaciones de
sangre o plasma debido al riesgo de transmisión de HIV a través de sangre contaminada. Esto se puede conseguir
eficazmente mediante la detección de anticuerpos frente al HIV-1 y HIV-2 en pruebas ELISA de alta sensibilidad.
Principio
bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método inmunoenzimático directo, tipo “sándwich”, de dos pasos de incubación, en
donde los pocillos de un microplaca están recubiertos con antígenos recombinantes de HIV expresados en E. coli
(recombinantes de HIV-1 gp41 y gp120 y recombinante de HIV-2 gp-36). A estos pocillos se les añade muestras
de suero o plasma a analizar. Si en la muestra existen anticuerpos HIV-1/2 específicos, formarán complejos
estables con los antígenos recombinantes del HIV. A continuación, se lavan los micropocillos para eliminar las
proteínas séricas no ligadas. Se añade a los pocillos un segundo juego de antígenos recombinantes conjugados
con la peroxidasa y que expresan los mismos epítopos. Durante la segunda fase de incubación, estos antígenos
se unirán a los anticuerpos específicos capturados. Tras un segundo lavado para eliminar el conjugado no unido
se añaden a los pocillos las soluciones de cromógeno. En los pocillos que contienen el inmunocomplejo
"sándwich" antígeno-anticuerpo-antígeno, los cromógenos incoloros son hidrolizados por el conjugado ligado
formando un producto de color azul. El color azul vira a amarillo tras bloquear la reacción con ácido sulfúrico. La
intensidad del color es mensurable y proporcional a la concentración de anticuerpos anti-HIV 1/2 en la muestra.
Los pocillos que contienen muestras negativas permanecen incoloros.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocillos recubiertos con antígenos HIV 1/2 recombinantes (HIV-1 recombinante gp41, gp120 y
HIV-2 recombinante gp36). Las tiras de micropocillos son para UN SOLO USO. No utilizarla si el sellado al
vacio ha sido dañado cuando se extrae por primera vez de la caja.
5. CONJ CONJUGADO:
Antígenos recombinantes HIV-1 y HIV-2 conjugados con peroxidasa. Contiene 0,1% de ProClinTM 300 como
conservante y colorante rojo. Listo para usar.
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Precauciones
bioelisa HIV-1+2 3.0 es para el diagnóstico IN VITRO. IVD
Para uso exclusivo por profesionales.
ADVERTENCIA: En la preparación del control negativo del kit se han podido utilizar materiales de origen humano.
Estos materiales se han analizado con kits analíticos de eficacia comprobada y su resultado ha dado negativo a
anticuerpos frente a HIV 1/2, HCV, TP y HBsAg. No obstante, no existe ningún método analítico que garantice la
total ausencia de agentes infecciosos en muestras o reactivos. Por tanto, los reactivos y las muestras deben
manejarse con extrema precaución, como si pudieran transmitir enfermedades. Para la estabilización de los
controles positivos y negativos se han utilizado sueros de origen bovino. La albúmina de suero bovino (ASB) y el
suero fetal bovino (SFB) provienen de animales de áreas geográficas libres de EEB/EET.
El Control Negativo, el Control Positivo HIV-1, el Control Positivo HIV-2 y el Conjugado contienen 0,1% de
TM
ProClin como conservante. A continuación se presentan las frases de riesgo (R) y de seguridad (S) aplicables:
Los análisis ELISA son sensibles al tiempo y la temperatura. Para evitar un resultado incorrecto, seguir
estrictamente los pasos del procedimiento de prueba y no modificarlos.
1. No intercambiar reactivos de diferentes lotes ni usar reactivos de otros kits comerciales. Los componentes del
kit están ajustados con precisión para ofrecer un rendimiento óptimo de los tests.
2. Comprobar que todos los reactivos se encuentran dentro del periodo de validez indicado en la caja del kit y
que pertenecen al mismo lote. No usar nunca reactivos después de la fecha de caducidad declarada en las
etiquetas o las cajas.
3. PRECAUCIÓN - PASO CRÍTICO: Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (18-30°C) antes
de su uso. Agitar suavemente el reactivo antes de usarlo. Llevar de nuevo a 2-8°C inmediatamente después
del uso.
4. Usar sólo el volumen suficiente de muestra según lo indicado en los pasos del procedimiento. En caso
contrario, el análisis puede perder sensibilidad.
5. No tocar la base exterior de los pocillos; las huellas de dedos o los arañazos pueden interferir en la lectura. Al
efectuar la lectura de los resultados, asegurarse de que la base de la placa está seca y de que no existen
burbujas de aire dentro de los pocillos.
6. No dejar secar nunca los pocillos de la microplaca después del paso de lavado. Pasar inmediatamente al
siguiente paso. Evitar la formación de burbujas de aire al añadir los reactivos.
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7. Evitar interrupciones muy prolongadas durante los pasos del análisis. Asegurar las mismas condiciones de
trabajo en todos los pocillos.
8. Calibrar la pipeta con frecuencia para garantizar la exactitud de la dispensación de muestras/reactivos. Usar
diferentes puntas de pipetas desechables con cada muestra y reactivo para evitar contaminaciones cruzadas.
10. Al añadir las muestras, no tocar la base del pocillo con la punta de la pipeta.
11. En la medición con un lector de placas, determinar la absorbancia a 450 nm o a 450/620-630 nm.
12. La actividad enzimática del conjugado podría resultar afectada por el polvo y reactivos y sustancias químicas
como hipoclorito sódico, ácidos, álcalis, etc. No realizar el análisis en presencia de estas sustancias.
13. Si se utiliza un equipo totalmente automático durante la incubación, no cubrir las placas con la lámina
adhesiva. También puede omitirse la acción de golpear la placa después del lavado para eliminar los restos
que quedan dentro de ella.
14. Todas las muestras de origen humano deben considerarse potencialmente infecciosas. El cumplimiento
estricto de las normas BPL (Buena Práctica de Laboratorio) puede garantizar la seguridad del personal.
15. No comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio de análisis. No pipetear las soluciones con la boca.
16. Los productos químicos deben manipularse y eliminarse sólo conforme a las normas BPL (Buena Práctica de
Laboratorio) vigentes y a las regulaciones locales o nacionales.
17. Las puntas de pipetas, viales, tiras y envases de muestras deben recogerse y esterilizarse en autoclave
durante no menos de 2 horas a 121°C o tratarse con hipoclorito sódico al 10% durante 30 minutos para
descontaminar antes de desecharlas. Las soluciones que contienen hipoclorito sódico NUNCA deben
esterilizarse en autoclave. Se dispondrá de una ficha de datos de seguridad (FDS).
18. Las materias primas de algunos reactivos pueden causar toxicidad, irritación, quemaduras o ser
carcinógenos. Debe evitarse el contacto con la piel y las mucosas, entre otros, con los siguientes reactivos:
solución de parada, cromógenos y solución de lavado.
SIGNOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DEL REACTIVO: Los valores de los controles positivo o negativo
que se encuentren fuera de los límites de control de calidad indicados son indicadores de un posible deterioro de
los reactivos o errores del operario o del instrumento. En tal caso los resultados deben considerarse no válidos y
las muestras deben ser reanalizadas. En el caso de resultados erróneos constantes y deterioro o inestabilidad
demostrados de los reactivos, sustituir inmediatamente estos por unos nuevos o ponerse en contacto con su
distribuidor local o servicio técnico de Biokit para más información.
Conservación y estabilidad
Los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta y en el envase, si se
almacenan entre 2-8°C y no se congelan. Para garantizar el máximo rendimiento del kit bioelisa HIV-1+2 3.0,
durante el almacenamiento proteger los reactivos de la contaminación con microorganismos o productos químicos.
Se pueden romper las tiras de micropocillos para usarlas por separado. Para el almacenamiento colocar los pocillos
o tiras no utilizados en la bolsa de plástico sellable junto con el desecante y llevarlos de nuevo a 2-8°C. Una vez
abierta, la microplaca es estable 1 mes a 2-8°C. Una vez abiertos, el control negativo, el control positivo HIV-1, el
control positivo HIV-2, el conjugado, la solución de cromógeno A, la solución de cromógeno B y la solución de
parada son estables 1 mes a 2-8°C. La solución de lavado, una vez diluida, es estable durante 1 semana a
temperatura ambiente o durante 2 semanas a 2-8°C.
Presentaciones disponibles
- Kit de 1 placa (96 tests), REF 3000-1168.
Contiene: 1 placa, 1 x 1 ml control negativo, 1 x 1 ml control positivo HIV-1, 1 x 1 ml control positivo HIV-2,
1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solución de lavado, 1 x 8 ml solución cromógeno A, 1 x 8 ml solución cromógeno B,
1 x 8 ml solución de parada, 1 bolsa de plástico y láminas adhesivas (6 unidades).
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Procesamiento automático
Puede utilizarse un análisis automático o semiautomático con diferentes instrumentos. Es muy importante validar
cualquier sistema automático para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son equivalentes a
las obtenidas con el análisis manual. Se recomienda al usuario la validación periódica del instrumento. Si tiene
dificultades para programar y ajustar los procesadores automáticos Biokit, póngase en contacto con su
distribuidor.
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Paso 1 Preparación: Marcar 3 pocillos como control negativo (p. ej., B1, C1, D1), 2 pocillos como control
positivo (p. ej., E1 para HIV-1 y F1 para HIV-2) y un blanco (p. ej., A1; no deben añadirse muestras o
conjugado en el pocillo del blanco). Si los resultados se determinarán utilizando el lector de placas de
longitud de onda doble, puede suprimirse el uso del pocillo del blanco. Utilizar sólo el número de tiras
necesarias para el test.
Paso 2 Adición de la muestra: Añadir 100 μl de las muestras y 100 μl de los controles positivo y negativo
en sus respectivos pocillos.
NOTA: utilizar una punta de pipeta desechable nueva para cada muestra, control negativo y positivo
para evitar la contaminación cruzada.
Paso 3 Incubación de la muestra: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante
30 ± 1 minutos. Se recomienda usar un recipiente con agua controlado con termostato para
garantizar la estabilidad de la temperatura y la humedad durante la incubación. Si se utiliza un
incubador seco, intentar abrir la puerta lo menos posible.
Paso 4 Lavado (1): Después del final de la incubación, retirar y eliminar la lámina adhesiva de la placa.
Lavar cada pocillo 5 (cinco) veces con solución de lavado diluida. Remojar cada vez los
micropocillos durante 30-60 segundos. Después del ciclo de lavado final, volcar la placa sobre
papel secante o un paño limpio y golpear para desprender los restos.
Paso 5 Adición del conjugado: Añadir 100 μl del reactivo conjugado en cada pocillo excepto el del blanco.
Paso 6 Incubación del conjugado: Cubrir la placa con la lámina adhesiva e incubar a 37°C durante
30 ± 1 minutos.
Paso 9 Parada de la reacción: Con una pipeta multicanal o manualmente, añadir 50 µl de solución de
parada en cada pocillo y mezclar suavemente. Se desarrolla un color amarillo intenso en los pocillos
del control positivo y de la muestra positiva a HIV-1/2.
Paso 10 Medición de la absorbancia: Calibrar el lector de placas con el pocillo del blanco y efectuar la lectura
de la absorbancia a 450 nm. Si se usa un instrumento de filtro doble, ajustar la longitud de onda de
referencia a 620 nm o 630 nm. Calcular el valor umbral y evaluar los resultados. (NOTA: Efectuar la
lectura de la absorbancia en el plazo máximo de 10 minutos después de parar la reacción).
Control de calidad
Se recomienda a los laboratorios establecer un sistema de control de calidad adecuado con material de control de
calidad similar o idéntico a la muestra del paciente a analizar.
- El valor de la absorbancia del pocillo del blanco, que contiene sólo solución de cromógeno y solución de
parada, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm.
- El valor de la absorbancia del control positivo debe ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm después de
restar el blanco.
- Cada valor de la absorbancia individual del control negativo debe ser menor que 0,100 a 450/620-630 nm o a
450 nm después de restar el blanco.
Si uno de los valores del control negativo no cumple los criterios del control de calidad, debe desecharse y calcular
de nuevo el valor medio de los dos valores restantes. Si más de un valor de absorbancia del control negativo no
cumple las especificaciones de los límites del control de calidad, el test no es válido y debe repetirse.
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Resultados
Cada microplaca debe considerarse por separado para calcular e interpretar los resultados del análisis,
independientemente del número de placas procesadas al mismo tiempo. Los resultados se calculan relacionando
el valor de la absorbancia (S) de cada muestra con el valor umbral (CO) de la placa. Si la lectura del valor umbral
se hace con el lector de placas de un solo filtro, los resultados se calcularán restando el valor del pocillo A del
blanco de los valores de muestras y controles del informe impreso. En caso de que la lectura se efectúe con un
lector de placas de filtro doble, no restar el valor del pocillo A del blanco de los valores de muestras y controles del
informe impreso.
Calcular el valor umbral añadiendo 0,120 a la absorbancia media del control negativo.
Ejemplo:
Valor de la absorbancia del pocillo del blanco: A1 = 0,025 a 450 nm (NOTA: el blanco sólo es necesario si se
efectúa la lectura con un filtro simple a 450 nm).
Pocillo n.º: B1 C1 D1
Control negativo: 0,012 0,010 0,011
Pocillo n.º: E1 F1
Control positivo: 2,363 2,436
Todos los valores de los controles se encuentran dentro del intervalo del control de calidad declarado.
Resultados negativos (S/CO < 1): Las muestras que den una absorbancia inferior al valor umbral son negativas
para este análisis, lo cual indica que no se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2 con el kit bioelisa HIV-1+2 3.0.
Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposición a HIV o infección por este virus.
Resultados positivos (S/CO ≥ 1): Las muestras que den una absorbancia igual o superior al valor umbral se
consideran inicialmente reactivas, lo que indica que probablemente se han detectado anticuerpos anti-HIV-1/2
con bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas las muestras inicialmente reactivas deben reanalizarse por duplicado usando
bioelisa HIV-1+2 3.0 antes de la interpretación final de los resultados analíticos. Las muestras repetidamente
reactivas pueden considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0.
Dudosos (S/CO = 0,9-1,1): Las muestras con una relación absorbancia/valor umbral entre 0,9 y 1,1 se consideran
dudosas y es necesario reanalizarlas por duplicado para confirmar los resultados iniciales.
Es necesario seguir, confirmar y realizar análisis complementarios de cualquier muestra positiva con otro sistema
analítico (p. ej., WB, PCR). El diagnóstico clínico no debe establecerse basándose en el resultado de un solo test,
sino que debe integrar datos y resultados clínicos y analíticos.
IND = no interpretable
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- Si después de reanalizar las muestras inicialmente reactivas ambos pocillos arrojan resultados negativos
(M/VU < 0,9), estas muestras deben considerarse como positivas no repetibles (o positivos falsos) y registrarse
como negativas. Al igual que con muchos análisis ELISA muy sensibles, pueden aparecer resultados falsos
positivos por diversos motivos, la mayoría de ellos relacionados, entre otros, con un paso de lavado inadecuado.
Para más información sobre la solución de problemas de bioelisa, consulte la Guía de Problemas.
- Si después de reanalizar los duplicados uno o ambos pocillos dan resultados positivos, el resultado final de
este análisis ELISA se anotará como repetidamente reactivo. Las muestras repetidamente reactivas pueden
considerarse positivas para anticuerpos frente a HIV-1/2 y, por tanto, el paciente está probablemente
infectado con HIV-1/2 y deberá desecharse la unidad de sangre.
- Después de reanalizar los duplicados, las muestras con valores cercanos al valor umbral deben interpretarse
con precaución y considerarse como muestra en zona "dudosa" no interpretable en el momento de la prueba.
Características funcionales
El estudio de evaluación, realizado en Alkmaar, Países Bajos, entre abril y noviembre de 2005, demostró las
siguientes características funcionales del bioelisa HIV-1+2 3.0.
La especificidad diagnóstica del kit fue del 99,85%, determinado en todas las muestras negativas (5471) que
fueron investigadas. Examinada sólo en donantes no seleccionados (donantes al azar y donantes por primera vez),
la especificidad fue del 99,92% (IC 95%: 99,84-100%).
Todos las muestras positivas confirmadas para anticuerpos HIV-1, HIV-1 subtipo O y HIV-2 utilizadas en este estudio
también fueron reactivas con bioelisa HIV-1+2 3.0 cuyo resultado fue una sensibilidad diagnóstica del 100%.
Un total de 32 paneles de seroconversión, que representan 210 muestras analizadas. Hay 13 muestras no clasificadas
de PRB918 y PRB917 porque no hay datos de antígeno o determinación de ARN necesarios para la clasificación. 41
muestras clasificadas como negativas. ARN y/o antígeno negativas. 61 muestras clasificadas como seroconversión
temprana. 95 muestras clasificadas como seroconversión.
Los resultados de las pruebas también muestran que bioelisa HIV-1+2 3.0 es un método de última generación
comparable a la mayoría de los ensayos con marca CE disponibles en la actualidad en el mercado.
Se evaluó la sensibilidad analítica en muestras anti-HIV PeliCheck. La sensibilidad analítica de bioelisa HIV-1+2 3.0
en las diluciones estándar anti-HIV PeliCheck fue comparable a la de otros análisis anti-HIV.
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Especificidad analítica:
Resultados del análisis bioelisa HIV-1+2 3.0 en muestras de pacientes hospitalizados y muestras potenciales de
contaminación cruzada:
- Con la implementación del procedimiento de dos pasos se elimina el posible efecto gancho de dosis elevada.
- Se han examinado muestras positivas/negativas congeladas para comprobar las interferencias derivadas de
la recogida y el almacenamiento. Las características funcionales de bioelisa HIV-1+2 3.0 no resultaron
afectadas durante al menos 3 ciclos de congelación/descongelación.
- Se examinaron muestras de pacientes infectados con virus de la hepatitis A, B, C y E y muestras de pacientes
infectados con Treponema pallidum sin que se observasen reacciones cruzadas.
- 25 muestras de suero frescos positivos probadas en el INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA
fueron examinadas con el bioelisa HIV-1+2 3.0. Las 25 muestras de sueros frescos positivos han sido
positivas con el bioelisa HIV-1+2 3.0.
Precisión:
Las tablas siguientes representan los resultados de la sensibilidad analítica y la reproducibilidad de
bioelisa HIV-1+2 3.0 controlado con el control de serie PeliSpyMulti-Marker y con una muestra de CC (control de
calidad) interno examinada en cada placa; la dilución 1:2048 del patrón anti-HIV en esta muestra PeliSpy se
detectó sistemáticamente en todas las placas. La muestra de CC interno se detectó siempre en todas las placas.
Resultados de PeliSpyMulti-Marker:
Percentiles Medidos
Dilución n Media
5% 95% Mín. Máx.
1:2048 80 3,08 1,76 4,39 1,70 4,96
Percentiles Medidos
n Media
5% 95% Mín. Máx.
160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89
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HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen Humane Immundefizienz-Viren (HIV) Typ 1
(Gruppe M-O) oder Typ 2 in humanen Serum- oder Plasmaproben zur Verwendung in klinischen Laboren
und als Erstlinienassay in Blutbanken.
Zusammenfassung
Serologischer Beweis von Infektionen mit HIV kann durch Testen auf Vorhandensein von HIV-Antigenen oder
-Antikörpern im Serum von Personen, bei denen eine HIV-Infektion vermutet wird, erfolgen. Antigene können
normalerweise nur während der akuten Phase und der symptomatischen Phase von AIDS nachgewiesen werden.
Die Antikörper gegen HIV-1 und/oder HIV-2 können praktisch während des gesamten Infektionszeitraums,
beginnend kurz nach der akuten Phase, anhaltend bis zum Endstadium von AIDS, nachgewiesen werden. Deshalb
ist der Gebrauch von hochempfindlichen Antikörper-Assays der Hauptansatz bei der Serodiagnose einer
HIV-Infektion. Abgesehen von der sexuellen Übertragung ist der Hauptinfektionsweg mit HIV die Bluttransfusion.
HIV kann sowohl in der zellulären als auch der zellfreien Fraktion von menschlichem Blut vorhanden sein. Deshalb
sollten alle Blut- oder Plasmaspenden wegen des Risikos der HIV-Übertragung über infiziertes Blut getestet
werden. Dies kann in wirksamer Weise durch Testen auf die Antiköper gegen HIV-1 und HIV-2 mittels
hochempfindlicher ELISA-Tests erfolgen.
Prinzip
bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ein „Sandwich“-Enzym-Immunassay-Kit mit zwei Inkubationsphasen, bei welchem die
Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit rekombinanten, in E. coli exprimierten HIV-Antigenen (rekombinantes HIV-1
gp41, gp120 und rekombinantes HIV-2 gp-36) beschichtet sind. Zu analysierende Serum- oder Plasmaproben
werden in diese Vertiefungen hinzugefügt. Falls in der Probe spezifische HIV-1/2-Antikörper vorhanden sind,
werden sie stabile Komplexe mit den rekombinanten HIV-Antigenen bilden. Die Vertiefungen werden dann
gewaschen, um ungebundene Serumproteine zu entfernen. Ein zweites Set von rekombinanten Antigenen,
konjugiert mit Peroxidase, welche dieselben Epitope exprimieren, werden in die Vertiefungen hinzugefügt.
Während des zweiten Inkubationsschrittes werden diese Antigene an spezifische Capture-Antikörper binden. Nach
dem zweiten Waschen zur Entfernung von ungebundenem Konjugat werden Chromogenlösungen in die
Vertiefungen hinzugefügt. In Vertiefungen, welche den Antigen-Antiköper-Antigen-„Sandwich“-Immunkomplex
enthalten, werden die farblosen Chromogene vom gebundenem Konjugat hydrolysiert und es entsteht ein blau
gefärbtes Produkt. Nach Blockieren der Reaktion mit Schwefelsäure wechselt die blaue Färbung zu gelb. Die
Intensität der Färbung kann gemessen werden und ist proportional zur Konzentration der HIV-1/2-Antikörper in der
Probe. Vertiefungen, die negative Proben enthalten, bleiben farblos.
Bestandteile
1. MCPL MIKROTITERPLATTE:
12 x 8 Vertiefungen beschichtet mit rekombinanten HIV 1/2-Antigenen (rekombinantes HIV-1 gp41, gp120 und
rekombinantes HIV-2 gp36). Die Mikrotiterstreifen sind nur zum EINMALGEBRAUCH bestimmt. Nicht
verwenden, wenn bei erstmaliger Entnahme aus der Box die Vakuumversiegelung beschädigt ist.
2. CONTROL + 1 HIV-1-POSITIVKONTROLLE:
HIV-1-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel
und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
3. CONTROL + 2 HIV-2-POSITIVKONTROLLE:
HIV-2-Antikörper gelöst in proteinstabilisierendem Puffer Enthält 0,1% ProClinTM 300 als Konservierungsmittel
und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
5. CONJ KONJUGAT:
HIV-1 und HIV-2 rekombinante Antigene konjugiert mit Peroxidase. Enthält 0,1% ProClinTM 300 als
Konservierungsmittel und roten Farbstoff. Gebrauchsfertig.
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7. CHROM A CHROMOGENLÖSUNG A:
Harnstoffperoxidlösung. Gebrauchsfertig.
8. CHROM B CHROMOGENLÖSUNG B:
TMB-Lösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Zitronensäure).
Vorsichtsmaßnahmen
bioelisa HIV-1+2 3.0 ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. IVD
Für den ausschließlichen Gebrauch durch Fachpersonal.
WARNHINWEIS: Humane Materialien können für die Zubereitung der negativen Kontrollen des Kits verwendet
worden sein. Diese Materialien wurden mit Testkits mit einer akzeptierten Leistungsfähigkeit getestet und für
negativ auf Antikörper gegen HIV 1/2, HCV, TP und HBsAg befundet worden. Es gibt jedoch keine analytische
Methode, die versichern kann, dass infektiöse Agenzien in den Proben oder Reagenzien komplett fehlen. Deshalb
sind Reagenzien und Proben mit extremer Vorsicht, als wären sie imstande, infektiöse Krankheiten zu übertragen,
zu behandeln. Rinderseren wurden angewendet, um positive und negative Kontrollen zu stabilisieren.
Rinderalbumin (BSA) und fetales Kälberserum (FKS) stammen von Tieren aus BSE/TSE-freien Gebieten.
Negative Kontrolle, HIV-1-Positivkontrolle, HIV-2-Positivkontrolle und Konjugat enthalten 0,1% ProClinTM als
Konservierungsmittel. Die zutreffenden Risiko- (R) und Sicherheitssätze (S) sind nachfolgend aufgeführt:
Die ELISA-Assays sind zeit- und temperaturempfindlich. Folgen Sie genau den Arbeitsschritten des Tests und
verändern Sie diese nicht, um falsche Ergebnisse zu vermeiden.
1. Tauschen Sie keine Reagenzien von verschiedenen Chargen oder verwenden Sie keine Reagenzien von
anderen im Handel erhältlichen Kits. Die Bestandteile des Kits sind für optimale Ergebnisse der Tests genau
aufeinander abgestimmt.
2. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien innerhalb der auf der Schachtel des Kits angegebenen Gültigkeit
liegen und zur gleichen Charge gehören. Verwenden Sie niemals Reagenzien nach Ablauf des auf den
Aufklebern oder Schachteln angegebenen Haltbarkeitsdatums.
3. ACHTUNG - ENTSCHEIDENDER SCHRITT: Warten Sie vor Gebrauch ab, bis Reagenzien und Proben
Raumtemperatur (18-30°C) erreicht haben. Vor Anwendung vorsichtig schütteln. Sofort nach Gebrauch wieder
bei 2-8°C aufbewahren.
4. Benutzen Sie nur ausreichende Volumina von Proben, wie in den Arbeitsschritten beschrieben. Wenn dies
nicht erfolgt, kann das eine niedrige Sensitivität des Assays zur Folge haben.
5. Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen von außen, da sich Fingerabdrücke und Kratzer störend auf
das Lesen auswirken können. Stellen Sie beim Lesen der Ergebnisse sicher, dass der Boden der Platte
trocken ist und sich keine Luftblasen in den Vertiefungen befinden.
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6. Lassen Sie niemals zu, dass die Vertiefungen der Mikrotiterplatte nach dem Waschschritt komplett
austrocknen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Vermeiden Sie beim Hinzufügen der
Reagenzien, dass sich Luftblasen bilden.
7. Vermeiden Sie lange Unterbrechungen zwischen den Arbeitsschritten. Stellen Sie die gleichen
Arbeitsbedingungen für alle Vertiefungen sicher.
8. Kalibrieren Sie die Pipette regelmäßig, um die Genauigkeit bei der Verteilung der Proben/Reagenzien
sicherzustellen. Verwenden Sie unterschiedliche Einmal-Pipettenspitzen für jede Probe und jedes Reagens,
um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
10. Berühren Sie beim Hinzufügen der Proben den Boden der Vertiefungen nicht mit der Pipettenspitze.
11. Bestimmen Sie die Absorption bei 450 nm oder bei 450/620-630 nm, wenn Sie mit einem Plattenlesegerät
messen.
12. Die enzymatische Aktivität des Konjugats kann durch Staub und reaktionsfähige Chemikalien und Substanzen
wie Natriumhypochlorit, Säuren, Basen etc. beeinflusst werden. Führen Sie den Assay nicht in Gegenwart
dieser Substanzen durch.
13. Bedecken Sie während der Inkubation die Platten nicht mit der Haftfolie, falls Sie automatisierte Ausrüstung
benutzen. Das Abklopfen der Rückstände innerhalb der Platte nach dem Waschen kann ebenfalls
weggelassen werden.
14. Alle Proben humanen Ursprungs sollten als potentiell infektiös betrachtet werden. Genaues Einhalten von
GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) kann die persönliche Sicherheit gewährleisten.
15. Essen, trinken, rauchen Sie niemals und tragen Sie niemals Kosmetika im Assaylabor auf. Pipettieren Sie
keine Lösungen mit dem Mund.
16. Chemikalien sollten nur in Übereinstimmung mit den derzeitigen GLP-Richtlinien (Gute Laborpraxis) sowie den
lokalen und nationalen Gesetzgebungen angewendet und entsorgt werden.
17. Die Pipettenspitzen, Reagenzgläser, Streifen und Probenbehälter sollten gesammelt und zur Dekontamination
vor der Entsorgung für mindestens 2 Stunden bei 121°C autoklaviert bzw. 30 Minuten mit 10%
Natriumhypochlorit behandelt werden. Lösungen die Natriumhypochlorit sollten NIEMALS autoklaviert werden.
Das Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) ist auf Anfrage erhältlich.
18. Einige Reagenzien können Toxizität, Irritation, Verätzungen verursachen oder haben als Ausgangsstoffe
krebserregende Wirkung. Kontakt mit der Haut und der Schleimhaut sollte vermieden werden, aber ist nicht
beschränkt auf die folgenden Reagenzien: Stopplösung, Chromogene und Waschpuffer.
INDIKATOREN FÜR INSTABILITÄTSSCHÄDIGUNG DER REAGENZIEN: Werte der positiven oder negativen
Kontrolle, die außerhalb des angegebenen Qualitätskontrollbereichs liegen, sind Indikatoren für eine mögliche
Schädigung der Reagenzien und/oder Anwender und/oder Gerätefehler. In diesem Fall sollten die Ergebnisse als
ungültig betrachtet werden und die Proben müssen nochmals getestet werden. Im Fall von konstant fehlerhaften
Ergebnissen und nachgewiesener Schädigung oder Instabilität der Reagenzien ersetzen Sie die Reagenzien
umgehend durch neue oder nehmen Sie für weitere Hilfe Kontakt zu Ihrem lokalen Händler oder dem Technischen
Support von biokit auf.
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bioelisa
Packungsinhalt
- Kit mit 1 Mikrotiterplatte (96 Tests), REF 3000-1168.
Enthält: 1 Mikrotiterplatte, 1 x 1 ml negative Kontrolle, 1 x 1 ml HIV-1-Positivkontrolle, 1 x 1 ml HIV-2-Positivkontrolle,
1 x 12 ml Konjugat, 1 x 50 ml Waschlösung, 1 x 8 ml Chromogenlösung A, 1 x 8 ml Chromogenlösung B,
1 x 8 ml Stopplösung, 1 Folienbeutel und Haftfolien (6 Einheiten).
Automatisierte Verarbeitung
Dieser Test kann in seiner automatischen oder halbautomatischen Modalität in unterschiedlichen Instrumenten
eingesetzt werden. Beim Einsatz automatischer Systeme muss jedoch unbedingt geprüft werden, ob die
erhaltenen Probenergebnisse mit den Ergebnissen des manuellen Tests übereinstimmen. Der Anwender sollte das
Instrument in regelmäßigen Abständen validieren. Falls Sie Probleme bei der Programmierung und Einstellung der
automatischen Prozessoren von Biokit feststellen sollten, setzen Sie sich bitte mit Ihrem Händler in Verbindung.
Waschschritt-Anleitung
Eine gutes Waschverfahren ist unverzichtbar, um korrekte und genaue analytische Daten zu erhalten. Daher wird
empfohlen, ein ELISA-Mikrotiterplattenwaschgerät von guter Qualität zu benutzen, das auf dem besten Level von
Waschleistung arbeitet. Im Allgemeinen sind nicht weniger als 5 automatisierte Waschzyklen 350-400 µl/Vertiefung
ausreichend, um falsch-positive Reaktionen und laute Hintergrundgeräusche zu vermeiden.
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Verwerfen Sie den Inhalt der Vertiefungen nicht nach der Inkubation, sondern lassen Sie ihn automatisch vom
Waschgerät aspirieren, um Kreuzkontaminationen der Platte mit Probe oder Konjugat zu verhindern. Stellen Sie sicher,
dass die Flüssigkeitsverteilkanäle des Mikrotiterplattenwaschgeräts nicht verstopft oder verunreinigt sind und dass jedes
Mal ausreichend Volumen von Waschpuffer in die Vertiefungen dosiert wird.
Im Falle von manuellem Waschen empfehlen wir 5 Waschzyklen durchzuführen und 350-400 µl/Vertiefung zu dosieren
und die Flüssigkeit fünfmal zu aspirieren. Erhöhen Sie die Waschzyklen sowie die Durchtränkungszeit pro Vertiefung,
falls schlechte Ergebnisse (hoher Hintergrund) beobachtet werden.
Auf jeden Fall sollte die aus den Streifen aspirierte Flüssigkeit mit Natriumhypochlorit in einer Konzentration von
2,5% für 24 Stunden behandelt werden, bevor sie in geeigneter Weise entsorgt wird.
Das Waschpufferkonzentrat sollte vor Verwendung 1:20 verdünnt werden. Bereiten Sie das proportionale Volumen
der Lösung vor, falls weniger als die gesamte Platte benutzt wird.
Schritt 1 Vorbereitung: Markieren Sie drei Vertiefungen als negative Kontrolle (z. B. B1, C1, D1), zwei
Vertiefungen als positive Kontrolle (z. B. E1 für HIV-1 und F1 für HIV-2) und eine Blindprobe (z. B. A1,
weder Proben noch Konjugat sollten in die Vertiefung der Blindprobe hinzugefügt werden). Wenn die
Ergebnisse mit einem dualen Wellenlängenplattenlesegerät bestimmt werden, kann die Forderung für
den Gebrauch einer Blindprobe weggelassen werden. Benutzen Sie nur die Anzahl der Vertiefungen,
die Sie für den Test benötigen.
Schritt 2 Hinzufügen der Probe: Füllen Sie 100 μl der Probe sowie 100 μl der positiven und negativen
Kontrolle in die entsprechenden Vertiefungen.
ANMERKUNG: Benutzen Sie eine Einmal-Pipettenspitze für jede Probe, negative und positive
Kontrolle, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Schritt 3 Inkubation der Probe: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie sie bei 37°C für
30 ± 1 Minuten. Es wird empfohlen, einen thermostatkontrollierten Wasserbehälter zu verwenden,
um die Temperaturstabilität und Luftfeuchte während der Inkubation zu gewährleisten. Öffnen Sie die
Tür nicht oft, falls ein Trockeninkubator benutzt wird.
Schritt 4 Waschen (1): Entfernen Sie nach Ende der Inkubation die Haftfolie und verwerfen Sie sie. Waschen
Sie jede Vertiefung 5 (fünf) Mal mit verdünntem Waschpuffer. Erlauben Sie jeweils 30-60 Sekunden
Durchtränken der Vertiefungen. Drehen Sie nach dem letzten Waschgang die Platte auf Saugpapier
oder ein sauberes Handtuch um und entfernen Sie jegliche Reste.
Schritt 5 Konjugat hinzufügen: Fügen Sie 100 μl des Konjugats in jede Vertiefung außer der Blindprobe
hinzu.
Schritt 6 Inkubation des Konjugats: Bedecken Sie die Platte mit der Haftfolie und inkubieren Sie bei 37°C
für 30 ± 1 Minuten.
Schritt 8 Färben: Fügen Sie 50 μl Chromogen A- und 50 μl Chromogen B-Lösung in jede Vertiefung
einschließlich der Blindprobe hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37°C für 15 Minuten im Dunkeln.
Die Enzymreaktion zwischen den Chromogenlösungen und dem Konjugat produziert eine
Blaufärbung in der positiven Kontrolle und den Vertiefungen der HIV 1/2-positiven Proben.
Schritt 9 Stoppreaktion: Füllen Sie die 50 µl Stopplösung unter Verwendung einer Multikanalpipette oder
manuell in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig. Die positive Kontrolle und HIV 1/2-positive
Proben entwickeln eine intensive Gelbfärbung.
Schritt 10 Messen der Absorption: Kalibrieren Sie das Plattenlesegerät mit der Blindprobe und lesen Sie die
Absorption bei 450 nm. Stellen Sie die Referenzwellenlänge auf 620 nm oder 630 nm, falls ein
Instrument mit dualem Filter benutzt wird. Berechnen Sie den Grenzwert und bewerten Sie die
Ergebnisse. (ANMERKUNG: messen Sie die Extinktion innerhalb von max. 10 Minuten nach
Beenden der Reaktion).
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen, dass jedes Labor ein geeignetes System zur Qualitätskontrolle etabliert, mit Materialien zur
Qualitätskontrolle, die ähnlich oder identisch zu den analysierten Patientenproben sind.
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- Der Extinktionswert der Blindprobe, welche nur Chromogen und Stopplösung enthält, muss weniger als
0,080 bei 450 nm betragen.
- Der Extinktionswert der positiven Kontrolle muss ≥ 0,800 bei 450/620-630 nm oder bei 450 nm nach
Subtrahieren der Blindprobe sein.
- Jeder individuelle Extinktionswert der negativen Kontrolle muss weniger als 0,100 bei 450/620-630 nm oder
bei 450 nm nach Subtrahieren der Blindprobe sein.
Falls ein Wert der negativen Kontrollen die Kriterien der Qualitätskontrolle nicht erfüllt, sollte er verworfen werden
und der Mittelwert wieder aus den beiden verbleibenden Werten berechnet werden. Falls mehr als ein
Extinktionswert der negativen Kontrollen die Kriterien des Qualitätskontrollbereichs nicht erfüllen, ist der Test
ungültig und muss wiederholt werden.
Ergebnisse
Jede Mikrotiterplatte muss für die Berechnung und Interpretation der Ergebnisse des Assays separat betrachtet
werden, ungeachtet dessen, wie viele Platten gleichzeitig verarbeitet wurden. Die Ergebnisse werden berechnet,
indem der Extinktionswert (S) jeder Probe mit dem Grenzwert (CO) der Platte ins Verhältnis gesetzt wird. Falls der
Grenzwert auf einem Einfilterplattenlesegerät beruht, sollten die Ergebnisse berechnet werden, indem der A-Wert
der Blindprobe von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen subtrahiert wird. Subtrahieren Sie den
A-Wert der Blindprobe nicht von den Werten des Druckberichts für Proben und Kontrollen, für den Fall, dass die
Messungen auf einem Dualfilterplattenlesegerät basieren.
Berechnen Sie den Grenzwert, indem Sie zur durchschnittlichen Extinktion der negativen Kontrolle 0,120 addieren.
Beispiel:
Extinktionswert der Blindprobe: A1= 0,025 bei 450 nm (Anmerkung: Blindprobe ist nur bei Messung mit Einzelfilter
bei 450 nm erforderlich).
Vertiefung-Nr.: B1 C1 D1
Neg Kontrolle: 0,012 0,010 0,011
Vertiefung-Nr.: E1 F1
Pos Kontrolle: 2,363 2,436
Negative Ergebnisse (S/CO < 1): Proben, die eine geringere Extinktion als den Grenzwert ergeben, sind in diesem
Assay negativ, was anzeigt, dass keine Anti-HIV1/2-Antikörper mit dem bioelisa HIV-1+2 3.0 Kit nachgewiesen
wurden. Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit der Exponierung oder Infektion mit HIV nicht aus.
Positive Ergebnisse (S/CO ≥ 1): Proben, die eine Extinktion ergeben, die genauso groß oder größer als der Grenzwert
ist, werden als zunächst als reaktiv betrachtet, was anzeigt, dass Anti-HIV1/2-Antikörper möglicherweise mit bioelisa
HIV-1+2 3.0 nachgewiesen wurden. Alle zunächst reaktiven Proben sollten vor der abschließenden Interpretation der
Assayergebnisse in Doppelwerten wiederholt mittels bioelisa HIV-1+2 3.0 getestet werden. Wiederholt reaktive Proben
können als positiv für Antikörper gegen HIV-1/2 mit bioelisa HIV-1+2 3.0 betrachtet werden.
Zweifelhafte Ergebnisse (S/CO = 0,9-1,1): Proben mit dem Verhältnis von Extinktion zu -Grenzwert zwischen
0,9 und 1,1 werden als zweifelhaft betrachtet. Wiederholtes Testen dieser Proben in Doppelwerten ist erforderlich,
um das erste Ergebnis zu bestätigen.
Follow-up, Bestätigung und zusätzliches Testen jeder positiven Probe mit einem anderen Testsystem (z. B. WB, PCR)
ist erforderlich. Die klinische Diagnose sollte nicht auf einem einzelnen Testergebnis beruhen. Sie sollte klinische und
andere Laborwerte und Befunde einbeziehen.
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Die diagnostische Spezifität des Kits lag bei 99,85%, wie an allen negativen Proben (5471) bestimmt wurde, die
untersucht wurden. Als nur bei nicht-ausgewählten Spendern untersucht (zufällig und Erstspender) betrug die
Spezifität 99,92% (95% CI 99,84-100%).
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Alle Proben mit bestätigt positivem Antikörper für HIV-1, HIV-1 Subtyp O und HIV-2, die in dieser Studie benutzt
wurden, waren auch mit bioelisa HIV-1+2 3.0 reaktiv, was eine diagnostische Sensitivität von 100% ergab.
Insgesamt 32 Serokonversionspanels, die 210 getestete Proben darstellen. 13 Proben nicht aus PRB918 und
PRB917 klassifiziert, da keine zur Klassifizierung erforderlichen Daten zur Antigen- oder RNA-Bestimmung
vorliegen. 41 Proben als negativ klassifiziert. RNA- und/oder Antigen-negativ. 61 Proben als frühe Serokonversion
klassifiziert. 95 Proben als Serokonversion klassifiziert.
Die Testergebnisse zeigen auch, dass bioelisa HIV-1+2 3.0 im Vergleich zu den meisten derzeit im Handel
erhältlichen und CE-geprüften Tests dem neuesten Stand der Technik entspricht.
Die analytische Sensitivität wurde anhand von PeliCheck Anti-HIV-Panels bewertet. Die analytische Sensitivität
von bioelisa HIV-1+2 3.0 anhand der PeliCheck Anti-HIV-Standardverdünnungen war vergleichbar mit anderen
Anti-HIV-Assays.
Analytische Spezifität:
bioelisa HIV-1+2 3.0 Testergebnisse von Proben von Krankenhauspatienten und Proben, die potenziell kreuzreaktive
Blutproben enthalten:
In einer separaten Studie wurden die folgenden Ergebnisse für Spezifität erhalten:
Präzision:
Die unten stehenden Tabellen zeigen die Ergebnisse der analytischen Sensitivität und Reproduzierbarkeit von
bioelisa HIV-1+2 3.0, die mit PeliSpyMulti-Marker-Kontrolle und mit interner QC-Probe bei jeder Platte getestet
wurde, die 1:2048 Verdünnung des Anti-HIV-Standards in dieser PeliSpy-Probe wurde gleichbleibend bei allen
Platten nachgewiesen. Die interne QC-Probe wurde immer bei allen Platten analysiert.
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Perzentile Gemessen
n Durchschnitt th
5 95th Min Max
160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89
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LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
Test ELISA pour la détection d’anticorps contre le virus de l'immunodéficience humaine (HIV) de type 1
(groupe M-O) ou de type 2 dans le sérum humain ou les échantillons de plasma pour être utilisé dans les
laboratoires cliniques et comme un dépistage de premier choix dans les centres de transfusion sanguine.
Sommaire
Une preuve sérologique d’infection par le HIV peut être obtenue par des tests pour dépister les antigènes ou les
anticorps HIV présents dans le sérum de sujets susceptibles de présenter une infection par le HIV. L’antigène peut
généralement être détecté aussi bien pendant la phase aiguë que la phase symptomatique du SIDA uniquement.
Les anticorps du virus HIV-1 ou HIV-2 peuvent être détectés pratiquement pendant toute la période d’infection, à
partir de, ou peu de temps après, la phase aiguë, et ce, jusqu’à la phase finale du SIDA. Par conséquent,
l’utilisation de tests d’anticorps extrêmement sensibles constitue la première approche dans le sérodiagnostic de
l’infection par le HIV. Mise à part la transmission sexuelle, la principale voie d’infection du HIV est la transfusion
sanguine. Le HIV peut présenter à la fois des fractions cellulaires et acellulaires du sang humain. Par conséquent,
tous les dons de sang ou de plasma doivent être testés en raison du risque de transmission du HIV par du sang
contaminé. Cela peut être réalisé de manière efficace avec un test ELISA extrêmement sensible pour dépister les
anticorps du HIV-1 et du HIV-2.
Principe
bioelisa HIV-1+2 3.0 est un kit est une méthode immuno-enzymatique directe, de type «sandwich», impliquant
une incubation en deux étapes. Dans ce kit d’essai, les puits de la microplaque sont recouverts d’antigènes du HIV
recombinants exprimés en E. coli (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant HIV-2, gp-36). Les échantillons
de plasma ou de sérum à analyser sont versés dans ces puits. Si des anticorps HIV1/2 sont présents dans
l’échantillon, ils formeront des complexes stables avec les antigènes recombinants du HIV. Les micropuits sont
ensuite lavés afin d’enlever les protéines libres de sérum. Un second lot d’antigènes recombinants conjugués à la
peroxydase et exprimant les mêmes épitopes sont placés dans les puits. Pendant la seconde étape d’incubation,
ces antigènes vont se lier aux anticorps spécifiques capturés. Après un deuxième lavage pour enlever le conjugué
libre, des solutions chromogènes sont versées dans les puits. Dans les puits contenant le complexe en sandwich
antigène-anticorps-antigène, les chromogènes incolores sont hydrolysés par le conjugué pour donner un produit de
couleur bleue. La couleur bleue vire au jaune après l’arrêt de la réaction avec de l’acide sulfurique. L’intensité de la
couleur peut être mesurée : elle est proportionnelle à la concentration d’anticorps anti-HIV 1/2 présents dans
l’échantillon. Les puits contenant les échantillons négatifs restent incolores.
Composants
1. MCPL MICROPLAQUE:
12 x 8 puits recouverts d’antigènes recombinants HIV 1/2 (recombinant HIV-1 gp41, gp120, et recombinant
HIV-2 gp36). Les bandelettes de micropuits sont destinées à une UTILISATION UNIQUE. Ne pas utiliser si
l'emballage sous vide a été endommagé lorsque le produit a été retiré pour la première fois de la boîte.
5. CONJ CONJUGUÉ:
Antigènes recombinants HIV-1 et HIV-2 conjugués avec la peroxydase. Contient 0,1% de ProClinTM 300 comme
conservateur et colorant rouge. Prêt à l’emploi.
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bioelisa
Précautions
bioelisa HIV-1+2 3.0 est destiné à un usage diagnostique IN VITRO. IVD
Utisation réservée aux professionnels.
AVERTISSEMENT: des matières d’origine humaine ont été utilisées dans la préparation du témoin négatif du kit.
Ces matières ont été testées avec des kits de tests ayant des performances acceptées et ont donné des résultats
négatifs aux anticorps HIV1/2, HCV, TP et HBsAg. Cependant, il n’existe pas de méthode analytique pouvant
garantir que les échantillons ou les réactifs sont totalement exempts d’agents infectieux. C’est pourquoi il convient
de manipuler les réactifs et les échantillons avec une extrême prudence, car ils peuvent transmettre des maladies
infectieuses. Les sérums dérivés de bovins ont été utilisés pour la stabilisation des contrôles positifs et négatifs. La
séralbumine bovine (BSA) et le sérum de veau fœtal (SVF) sont des dérivés d’animaux des zones géographiques
exemptes d’ESB et d’EST.
TM
Le contrôle négatif, contrôle positif HIV-1, contrôle positif HIV-2 et le conjugué contiennent 0,1% de ProClin
comme conservateur. Les phrases de risque (R) et de sécurité (S) appropriés sont énumérées ci-dessous:
Les tests ELISA sont limités dans le temps et sensibles à la température. Afin d’éviter tout résultat erroné, veuillez
suivre strictement les étapes de procédure du test ci-dessous et ne pas les modifier.
1. N’échangez pas les réactifs entre différents lots et n’utilisez pas de réactifs provenant d’autres kits
commercialisés. Les composants du kit sont précisément adaptés pour un résultat optimal des tests.
2. Assurez-vous que tous les réactifs ne sont pas périmés en vous référant à la date de péremption indiquée sur
la boîte du kit et vérifiez qu’ils appartiennent tous au même lot. N’utilisez jamais de réactifs au-delà de la date
de péremption mentionnée sur les étiquettes ou les boîtes.
3. ATTENTION - ÉTAPE IMPORTANTE: attendez que les réactifs et les échantillons prennent une température
ambiante (18 à 30°C) avant utilisation. Secouez légèrement le réactif avant utilisation. Replacez les réactifs et
les échantillons à une température située entre 2 et 8°C immédiatement après utilisation.
4. Utilisez uniquement la quantité suffisante d’échantillon comme indiqué dans la procédure. Dans le cas
contraire, le test pourrait perdre en sensibilité.
5. Ne touchez pas l’extérieur du fond des puits; les traces de doigts et les rayures pourraient biaiser les résultats
du test. En lisant les résultats, assurez-vous que le dessous de la plaque est sec et qu’il n’y a pas de bulles
d’air à l’intérieur des puits.
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6. Ne laissez jamais les puits de la microplaque sécher après le lavage. Passez immédiatement à la prochaine
étape. Évitez la formation de bulles d’air en ajoutant les réactifs.
7. Évitez les interruptions longues des étapes du test. Assurez-vous de travailler dans les mêmes conditions pour
tous les puits.
10. Lorsque vous ajoutez les échantillons, ne touchez pas le fond des puits avec l’embout de la pipette.
11. Lorsque vous étalonnez le lecteur de la plaque, positionnez le niveau d’absorbance à 450 nm ou à
450/620-630 nm.
12. L’activité enzymatique du conjugué pourrait être affectée par la poussière, les agents chimiques et les
substances des réactifs, comme l’hypochlorite de sodium, les acides, les alcalis, etc. Ne procédez pas au test
en présence de ces substances.
13. Si vous utilisez un équipement entièrement automatisé, pendant l’incubation, ne recouvrez pas les plaques
avec la lamelle adhésive. Il n’est pas également nécessaire de recouvrir le produit restant à l’intérieur de la
plaque après le lavage.
14. Tous les échantillons d’origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Respectez
rigoureusement les règles de BPL (bonnes pratiques de laboratoire) afin d’assurer la sécurité du personnel.
15. Ne jamais manger, boire, fumer ou appliquer de cosmétiques dans le laboratoire où le test est réalisé. Ne
jamais pipetter les solutions avec la bouche.
16. Les agents chimiques doivent être manipulés et rejetés uniquement conformément aux BPL (bonnes pratiques
de laboratoire) et aux réglementations locales ou nationales en vigueur.
17. Avant d’être utilisés lors des étapes successives ou d’être jetés, les cônes de pipette, les flacons, les
bandelettes et les conteneurs d’échantillon doivent être collectés et autoclavés pendant 2 heures minimum à
121°C ou traités avec 10% d’hypochlorite de sodium pendant 30 minutes pour décontamination. Les solutions
contenant de l’hypochlorite de sodium ne doivent JAMAIS être autoclavées. La fiche de données de sécurité
(FDS) est disponible sur demande.
18. Certains réactifs peuvent être toxiques et peuvent causer des irritations, des brûlures ou avoir des effets
cancérigènes lorsqu’ils sont utilisés comme matière première. Le contact avec la peau et les muqueuses doit
être évité mais pas limité aux réactifs suivants: solution d’arrêt, chromogènes et tampon de lavage.
Conservation et stabilité
Les composants du kit resteront stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette et le
conditionnement à condition qu’ils soient stockés à une température comprise entre 2 et 8°C. Ne congelez pas.
Afin de garantir des performances optimales du kit bioelisa HIV-1+2 3.0, protégez les réactifs d’une
contamination par un micro-organisme ou par des agents chimiques. Les bandelettes du micropuits peuvent se
détacher afin de les utiliser séparément. Placez les puits ou les bandelettes non utilisés dans le sachet en
plastique refermable avec le déshydratant et stockez à température comprise entre 2 et 8°C. Une fois ouverte, la
microplaque est stable pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. Le contrôle négatif, le contrôle
positif HIV-1, le contrôle positif HIV-2, le conjugué, la solution chromogène A, la solution chromogène B et la
solution d’arrêt, une fois ouverts, sont stables pendant un mois à température comprise entre 2 et 8°C. La solution
de lavage, une fois diluée, est stable pendant une semaine à température ambiante ou pendant deux semaines à
une température comprise entre 2 et 8°C.
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bioelisa
Présentations disponibles
- Coffret de 1 plaque (96 tests), REF 3000-1168.
Contient: 1 plaque, 1 x 1 ml de contrôle négatif, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-1, 1 x 1 ml de contrôle positif HIV-2,
1 x 12 ml de conjugué, 1 x 50 ml de solution de lavage, 1 x 8 ml de solution chromogène A, 1 x 8 ml de solution
chromogène B, 1 x 8 ml de solution d’arrêt, 1 sachet plastique et des lamelles adhésives (6 unités).
Traitement automatique
Ce test peut être utilisé de manière automatique ou semi-automatique avec divers instruments. Il est très important
de valider un système automatique pour démontrer que les résultats obtenus sur les échantillons sont équivalents
aux résultats d’un test manuel. Il est recommandé à l’utilisateur de valider l’instrument régulièrement. Si vous
rencontrez des difficultés dans la programmation et le réglage des processeurs automatiques de Biokit, veuillez
contacter votre distributeur.
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bioelisa
Étape 1 Préparation: marquez trois puits comme contrôle négatif (ex. B1, C1, D1), deux puits comme contrôle
positif (ex. E1 pour HIV-1 et F1 pour HIV-2) et un blanc (ex. A1, ni les échantillons ni le conjugué ne
doivent être versés dans le puits blanc). Si les résultats doivent être lus avec un lecteur de microplaque
à deux longueurs d’onde, l’utilisation du puits blanc peut être omise. Utilisez uniquement le nombre de
bandelettes nécessaire pour le test.
Étape 2 Ajout de l’échantillon: ajoutez 100 μl d’échantillons et 100 μl de contrôle positif et négatif dans leur
puits respectif.
REMARQUE: utilisez un embout de pipette jetable différent pour chaque échantillon et chaque
contrôle positif et négatif afin d’éviter une contamination croisée.
Étape 3 Incubation de l’échantillon: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C
pendant 30 ± 1 minutes. Il est recommandé d’utiliser un récipient avec de l’eau thermorégulé pour
assurer la stabilité de la température et le degré d’humidité pendant l’incubation. Si un incubateur à
sec est utilisé, évitez d’ouvrir la porte à plusieurs reprises.
Étape 4 Lavage (1): à la fin de l’incubation, retirez la lamelle adhésive et jetez-la. Lavez chaque puits 5 (cinq) fois
avec le tampon de lavage dilué. À chaque fois, laissez tremper les puits pendant 30 à 60 secondes.
À la fin du dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur du papier buvard ou une serviette propre et
tapotez pour enlever tout résidu.
Étape 5 Ajout du conjugué: ajoutez 100 μl de réactif conjugué dans chaque puits excepté le blanc.
Étape 6 Incubation du conjugué: recouvrez la plaque avec la lamelle adhésive et incubez à 37°C pendant
30 ± 1 minutes.
Étape 9 Réaction d’arrêt: en utilisant une pipette multicanal ou manuelle, ajoutez 50 µl de solution d’arrêt
dans chaque puits et mélangez doucement. Une vive couleur jaune apparaît dans les puits contenant
le contrôle positif et l’échantillon de contrôle positif au HIV 1/2.
Étape 10 Mesure du degré d’absorbance: étalonnez le lecteur de la plaque avec le puits blanc et lisez
l’absorbance à 450 nm. Si vous utilisez un instrument doté d’un double filtre, configurez la longueur
d’onde à 620 nm ou 630 nm. Calculez la valeur seuil et évaluer les résultats. (REMARQUE: lisez
l’absorbance dans un délai maximum de 10 minutes après l’arrêt de la réaction).
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Contrôle de qualité
Il est recommandé que chaque laboratoire établisse un système de contrôle de la qualité avec un matériau
similaire à l’échantillon du patient à analyser.
- La valeur d’absorbance du puits blanc, qui contient uniquement les solutions de chromogène et d’arrêt, doit
être inférieure à 0,080 à 450 nm.
- La valeur d’absorbance du contrôle positif doit être ≥ 0,800 à 450/620-630 nm ou à 450 nm après soustraction
du blanc.
- Chaque valeur d’absorbance individuelle du contrôle négatif doit être inférieure à 0,100 à 450/620-630 nm ou
à 450 nm après soustraction du blanc.
Si l’une des valeurs du contrôle négatif ne satisfait pas aux critères de contrôle de la qualité, elle doit être écartée
et la valeur moyenne recalculée en utilisant les deux valeurs restantes. Si plus d’une valeur d’absorbance du
contrôle négatif ne satisfait pas aux spécifications de l’intervalle de contrôle de la qualité, le test est invalide et doit
être renouvelé.
Résultats
Chaque microplaque doit être considérée séparément lorsque vous calculez et interprétez les résultats du test,
indépendamment du nombre de plaques traitées parallèlement. Les résultats sont calculés en confrontant chaque
valeur (S) d’absorbance d’échantillon et la valeur seuil (CO) de la plaque. Si la lecture de la valeur seuil est basée
sur un lecteur de plaque à un filtre, les résultats doivent être calculés en soustrayant la valeur A du puits blanc des
valeurs rapportées des échantillons et des contrôles. Si la lecture est basée sur un lecteur de plaque à deux filtres,
ne soustrayez pas la valeur A du puits blanc des valeurs rapportées des échantillons et des contrôles.
Exemple:
Valeur d’absorbance du puits blanc: A1= 0,025 à 450 nm (REMARQUE: le blanc est requis uniquement pour la
lecture avec un seul filtre à 450 nm)
o
Puits n : B1 C1 D1
Ctrl nég.: 0,012 0,010 0,011
Puits no: E1 F1
Ctrl pos.: 2,363 2,436
Toutes les valeurs des contrôles se trouvent dans l’intervalle du contrôle de la qualité susmentionné.
Résultats négatifs (S/CO < 1): les échantillons présentant une absorbance inférieure à la valeur seuil sont négatifs
pour le test, ce qui indique qu’aucun anticorps anti-HIV 1/2 n’a été détecté avec le kit bioelisa HIV-1+2 3.0.
Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’exposition ou d’infection par le HIV.
Résultats positifs (S/CO ≥ 1): les échantillons présentant une absorbance égale ou supérieure à la valeur seuil sont
considérés comme initialement réactifs, ce qui indique que des anticorps anti-HIV 1/2 ont probablement été détectés
grâce au test bioelisa HIV-1+2 3.0. Tous les échantillons initialement réactifs doivent être retestés deux fois en
utilisant bioelisa HIV-1+2 3.0 avant toute interprétation finale des résultats du test. Des échantillons réactifs à
plusieurs reprises peuvent être considérés comme positifs pour les anticorps du HIV 1/2 avec bioelisa HIV-1+2 3.0.
Douteux (S/CO = 0,9-1,1): les échantillons ayant un rapport d’absorbance-seuil situé entre 0,9 et 1,1 sont
considérés comme douteux; c’est pourquoi il convient de les retester deux fois pour confirmer les résultats initiaux.
Suivi, confirmation et test supplémentaire de tout échantillon positif avec un autre instrument d’analyse (ex. WB,
PCR). Un diagnostic clinique ne doit pas être établi sur la base d’un seul résultat de test. Il doit intégrer des
données cliniques et des données et conclusion d’autres laboratoires.
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bioelisa
Limites de la procédure
1. Les résultats positifs doivent être confirmés avec une autre méthode disponible et interprétés par rapport aux
informations cliniques du patient.
2. Les anticorps peuvent être indétectables pendant la phase initiale de la maladie et chez certains sujets
immunocompromis. Par conséquent, les résultats négatifs obtenus avec bioelisa HIV-1+2 3.0 indiquent
seulement que l’échantillon ne contient pas un taux détectable d’anticorps anti-HIV 1 ou 2 et qu’aucun résultat
ne doit être considéré comme une preuve concluante que le sujet n’est pas infecté par le HIV 1 ou 2.
3. Les erreurs de tests les plus fréquentes sont les suivantes : utilisation de kit dont la date de péremption est
expirée, mauvaises procédures de lavage, réactifs contaminés, étapes de la procédure du test incorrectes,
aspiration insuffisante pendant le lavage, échec dans l’ajout d’échantillons ou de réactifs, manipulation
incorrecte de l’équipement du laboratoire, erreurs de chronométrage, utilisation d’échantillons hautement
hémolysés ou des échantillons contenant de la fibrine, trempage incomplet des échantillons de sérum.
4. La prévalence du marqueur affectera les valeurs prédictives du test.
5. Ce test ne peut pas être utilisé pour le plasma mis en commun (mélangé). bioelisa HIV-1+2 3.0 a été évalué
uniquement avec du sérum individuel ou des échantillons de plasma.
6. bioelisa HIV-1+2 3.0 est un test qualitatif et les résultats ne peuvent donc pas être utilisés pour mesurer les
concentrations d’anticorps. Ce test ne peut pas différencier les infections par le HIV-1 des infections par le HIV-2.
Caractéristiques fonctionnelles
Une étude d’évaluation menée à Alkmaar, Pays-Bas, entre avril et novembre 2005, a démontré les caractéristiques
fonctionnelles du test bioelisa HIV-1+2 3.0 présentées ci-dessous :
La spécificité diagnostique du kit était de 99,85%, telle que déterminée sur tous les échantillons négatifs (5471)
analysés. Lorsqu’elle était testée uniquement sur les donneurs non choisis (donneurs choisis de façon aléatoire et
participant pour la première fois), la spécificité était de 99,92% (95% CI 99,84-100%).
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Résultats du test bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les donneurs non choisis:
Tous les panels de HIV-1, HIV-1HIV sous-type O et HIV-2 ont confirmé que les échantillons positifs aux anticorps
ayant été utilisés dans cette étude ont également été testés réactifs avec bioelisa HIV-1+2 3.0, ce qui a engendré
une sensibilité diagnostique de 100%.
Un total de 32 panels de séroconversion, qui représentent 210 échantillons testés. 13 échantillons n'ont pas été
classés du PRB918 et du PRB917 car il n'y a pas de données relatives aux antigènes ou de détermination de
l'ARN requises pour la classification. 41 échantillons classés négatifs. ARN et/ou antigènes négatifs. 61
échantillons classés séroconversion précoce. 95 échantillons classés séroconversion.
Les résultats des tests indiquent également que bioelisa HIV-1+2 3.0 est à la pointe de la technologie par rapport à
la plupart des tests marqués CE actuellement commercialisés.
La sensibilité analytique a été évaluée sur les panels PeliCheck anti-HIV. La sensibilité analytique de
bioelisa HIV-1+2 3.0 sur les dilutions étalons PeliCheck anti-HIV était comparable aux autres tests anti-HIV.
Spécificité analytique:
Résultat du test bioelisa HIV-1+2 3.0 portant sur des échantillons de patients hospitalisés et des échantillons
potentiels de contamination croisée:
Dans une étude séparée, les résultats de spécificité suivants ont été obtenus:
- La possibilité d’un effet crochet à haute concentration est écartée en raison de la mise en place d’une
procédure à deux étapes.
- Les échantillons positifs/négatifs congelés ont été testés pour vérifier les interférences dues aux prélèvements
et au stockage. Les caractéristiques de performance bioelisa HIV-1+2 3.0 n’étaient pas affectées pendant au
moins 3 cycles de gel/dégel.
- Les échantillons prélevés sur des patients infectés par les virus de l’hépatite A,B,C et E tout comme les
échantillons de patients infectés par Treponema pallidum n’ont pas présenté de réactions croisées.
- 25 échantillons de sérum frais positifs testés à l'INSTITUT DE MÉDECINE TROPICALE (BELGIQUE) ont été
testés avec bioelisa HIV-1+2 3.0. La totalité des 25 échantillons de sérum frais positifs ont été classés positifs
avec bioelisa HIV-1+2 3.0.
Précision:
Les tableaux ci-dessous affichent les résultats de la sensibilité analytique et de reproductibilité du test
bioelisa HIV-1+2 3.0 contrôlés avec PeliSpyMulti-Marker run control et avec un échantillon interne de CQ testé
dans chaque plaque; la dilution 1:2048 de l’étalon anti-HIV dans cet échantillon PeliSpy a été systématiquement
détecté dans chaque plaque. L’échantillon interne de CQ a toujours été détecté dans toutes les plaques.
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bioelisa
Centiles Mesuré
Dilution n Moyenne
5e 95e Min Max
1:2048 80 3,08 1,76 4,39 1,70 4,96
Centiles Mesuré
n Moyenne e e
5 95 Min Max
160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89
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40 1293
bioelisa
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41 1293
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VEDI CAMBI RISALTATI
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
Test ELISA per la determinazione degli anticorpi contro i virus dell’immunodeficienza umana (HIV) tipo 1
(gruppo M-O) o tipo 2 nei campioni di siero o plasma umani a uso dei laboratori clinici e come screening di
prima linea nelle banche del sangue.
Sommario
L’evidenza sierologica dell’infezione da HIV si può ottenere mediante analisi finalizzate alle ricerca della presenza
di antigeni o anticorpi HIV nel siero di soggetti in cui si sospetta un’infezione da HIV. In genere, l’antigene può
essere individuato solo durante la fase acuta o la fase sintomatica dell’AIDS. Gli anticorpi contro l’HIV-1 e/o l’HIV-2
possono essere determinati durante l’intero periodo dell’infezione, a partire dalla fase acuta, o appena dopo, e fino
alla fase terminale dell'AIDS. Quindi, l'impiego di test per anticorpi altamente sensibili è l'approccio principale nella
sierodiagnosi dell'infezione da HIV. Oltre alla trasmissione sessuale, la principale via di infezione è rappresentata
dalle trasfusioni di sangue. L'HIV può essere presente sia nelle frazioni cellulari sia in quelle acellulari del sangue
umano. Quindi, tutto il sangue o il plasma proveniente da donazioni deve essere analizzato a causa del rischio di
trasmissione dell’HIV attraverso sangue contaminato. Tale obiettivo può essere perseguito in modo efficace
ricercando gli anticorpi contro l’HIV-1 e l'HIV-2 con test ELISA altamente sensibili.
Principio
Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è un metodo immuno-enzimatico di tipo “sandwich”, in cui i pozzetti di una micropiastra
sono stati ricoperti con antigeni ricombinanti di HIV espressi in E. coli (ricombinanti di HIV-1 gp41 e gp120, e
ricombinante di HIV-2 gp-36). I campioni di siero o plasma da analizzare vengono aggiunti in questi pozzetti. Se nel
campione sono presenti anticorpi specifici anti-HIV1/2, essi formeranno complessi stabili con gli antigeni HIV
ricombinanti. I micropozzetti vengono quindi lavati per rimuovere le proteine sieriche non legate. Nei pozzetti viene
aggiunta una seconda serie di antigeni ricombinanti coniugati con perossidasi che esprimono gli stessi epitopi.
Durante la seconda fase di incubazione, questi antigeni si legheranno agli specifici anticorpi di cattura. Dopo un
secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, vengono aggiunte soluzioni di cromogeno nei pozzetti. Nei
pozzetti contenenti l’mmunocomplesso a “sandwich” antigene-anticorpo-antigene, i cromogeni incolori vengono
idrolizzati da parte del coniugato legato, dando origine ad un prodotto di colore blu. Il colore blu virerà al giallo dopo
l’arresto della reazione con acido solforico. L’intensità del colore può essere misurata e sarà proporzionale alla
concentrazione di anticorpi anti-HIV 1/2 presente nel campione. I pozzetti contenenti campioni negativi rimarranno
incolori.
Componenti
1. MCPL MICROPIASTRA:
12 x 8 pozzetti rivestiti con antigeni HIV 1/2 ricombinanti (HIV-1 gp41 e gp120 ricombinanti, e HIV-2 gp36
ricombinante). Le strisce di micropozzetti sono esclusivamente MONOUSO. Non utilizzare se la sigillatura
sottovuoto è stata danneggiata durante la prima estrazione dalla scatola.
5. CONJ CONIUGATO:
Antigeni HIV-1 e HIV-2 ricombinanti coniugati con perossidasi. Contiene 0,1% di ProClinTM 300 come
conservante e colorante rosso. Pronto all'uso.
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Precauzioni
Il bioelisa HIV-1+2 3.0 è per uso diagnostico IN VITRO. IVD
Solo per uso professionale.
ATTENZIONE: per la preparazione del controllo negativo di questo kit possono essere stati utilizzati materiali di
origine umana. Questi materiali sono stati testati utilizzando kit con prestazioni accettate e sono risultati negativi
per gli anticorpi contro HIV 1/2, HCV, TP e HBsAg. Tuttavia, poiché non esiste un metodo analitico che possa
garantire la totale assenza di agenti infettivi nei campioni o nei reagenti, occorre trattare reagenti e campioni con
estrema cautela, come se fossero in grado di trasmettere malattie infettive. Per stabilizzare i controlli positivi e
negativi sono stati utilizzati sieri di derivazione bovina. L’albumina sierica bovina (BSA) e il siero fetale di vitello
(FCS) derivano da animali provenienti da aree geografiche dove non è presente BSE/TSE.
Controllo negativo, controllo positivo HIV-1, controllo positivo HIV-2 e coniugato contengono lo 0,1% di
TM
ProClin come conservante. Di seguito sono riportate le indicazioni di rischio (R) e sicurezza (S) appropriate:
I test ELISA sono sensibili al trascorrere del tempo e alla temperatura. Per evitare risultati non corretti, seguire
rigorosamente le fasi della procedura senza apportare alcuna modifica.
1. Non scambiare i reagenti provenienti da lotti differenti o impiegare reagenti di altri kit in commercio. I
componenti del kit sono abbinati con precisione al fine di assicurare un’ottimale esecuzione dei test.
2. Assicurarsi che tutti i reagenti siano entro la data di validità riportata sulla scatola del kit e che appartengano
allo stesso lotto. Non usare mai reagenti oltre la data di scadenza indicata sulle etichette o sulle scatole.
3. ATTENZIONE! Prima dell’uso, attendere che i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente
(18-30°C). Agitare con delicatezza il reagente prima dell'uso. Riportare ad una temperatura di 2-8°C subito
dopo l’uso.
4. Usare solo la quantità di campione indicata nella procedura. La mancata osservanza di questa indicazione
può far diminuire la sensibilità del test.
5. Non toccare la parte inferiore esterna dei pozzetti: impronte o graffi possono interferire con la lettura dei
risultati. Quando si leggono i risultati, assicurarsi che il fondo della piastra sia asciutto e che non vi siano bolle
d'aria all'interno dei pozzetti.
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6. Evitare che i pozzetti della micropiastra si asciughino dopo il lavaggio. Passare immediatamente alla fase
successiva. Evitare la formazione di bolle d’aria quando si aggiungono i reagenti.
7. Evitare lunghi intervalli tra le varie fasi del test. Assicurare le stesse condizioni di lavoro per tutti i pozzetti.
8. Calibrare frequentemente le pipette per assicurare che la distribuzione di campioni/reagenti avvenga in modo
preciso. Usare un puntale per pipette monouso diverso per ciascun campione e reagente, onde evitare
contaminazioni crociate.
10. Quando si aggiungono i campioni, non toccare il fondo del pozzetto con il puntale della pipetta.
11. Quando si esegue una misurazione con un lettore di micropiastre, determinare l’assorbanza a 450 nm o a
450/620-630 nm.
12. L’attività enzimatica del coniugato potrebbe essere influenzata da polvere, reattivi chimici e sostanze come
ipoclorito di sodio, acidi, alcali, ecc. Non eseguire il test in presenza di queste sostanze.
13. Se si impiega un’attrezzatura completamente automatica, durante l’incubazione, non coprire le piastre con il
foglio adesivo. Dopo il lavaggio, si può anche evitare di estrarre i residui all’interno della piastra.
14. Tutti i campioni di origine umana devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Una stretta
osservanza delle norme di buona pratica di laboratorio può garantire la sicurezza delle persone.
15. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nel laboratorio di analisi. Non aspirare mai le soluzioni con la
bocca direttamente dalla pipetta.
16. Le sostanze chimiche devono essere maneggiate e smaltite in conformità con le norme di buona pratica di
laboratorio vigenti e con le normative locali o nazionali.
17. I puntali delle pipette, le fiale, le strisce ed i contenitori dei campioni, devono essere raccolti e sterilizzati in
autoclave per almeno 2 ore a 121°C o trattati con ipoclorito di sodio al 10% per 30 minuti per decontaminarle
prima di ogni ulteriore fase di smaltimento. Le soluzioni contenenti ipoclorito di sodio non devono MAI essere
sterilizzate in autoclave. Le Schede di Sicurezza dei Materiali (MSDS) sono disponibili su richiesta.
18. Alcuni reagenti allo stato grezzo possono causare tossicità, irritazione, ustioni o avere un effetto cancerogeno.
Evitare il contatto di cute e mucose con i seguenti reagenti (in via esemplificativa, ma non esaustiva):
soluzione bloccante, cromogeni e tampone di lavaggio.
INDIZI DI INSTABILITÀ E DETERIORAMENTO DEL REAGENTE: i valori dei controlli positivo o negativo al di fuori
del range del controllo di qualità indicato, sono indicatori di un possibile deterioramento dei reagenti e/o di errori
dell’operatore o dell’attrezzatura. In tal caso, i risultati devono essere considerati non validi e i campioni devono
essere nuovamente testati. In caso di risultati erronei costanti e di provato deterioramento o instabilità dei reagenti,
sostituire immediatamente il reagente con uno nuovo o contattare il distributore locale o il supporto tecnico Biokit
per ottenere assistenza.
Conservazione e stabilità
I componenti del kit si manterranno stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta e sulla confezione, se
conservati a 2-8°C. Non congelare. Per assicurare le massime prestazioni del kit bioelisa HIV-1+2 3.0, durante la
conservazione proteggere i reagenti dalla contaminazione da parte di microrganismi o agenti chimici. Le strisce di
micropozzetti si possono rompere ed essere utilizzate separatamente. Conservare i pozzetti o le strisce non
utilizzati nel sacchetto di plastica richiudibile ermeticamente insieme al deumidificante e riportare a 2-8°C. Una
volta aperta, la micropiastra è stabile per un mese a 2-8°C. Dopo l’apertura, il controllo negativo, il controllo
positivo HIV-1, il controllo positivo HIV-2, il coniugato, la soluzione di cromogeno A, la soluzione di cromogeno B e
la soluzione bloccante sono stabili per un mese a 2-8°C. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, è stabile per
una settimana a temperatura ambiente o per due settimane a 2-8°C.
Confezioni disponibili
- Kit da 1 piastra (96 test), REF 3000-1168.
Contiene: 1 piastra, 1 x 1 ml controllo negativo, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-2,
1 x 12 ml coniugato, 1 x 50 ml soluzione di lavaggio, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 8 ml soluzione di
cromogeno B, 1 x 8 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi (6 unità).
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Trattamento automatico
Questo test è utilizzabile con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per
dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile
validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori
automatici Biokit, contattare il proprio distributore.
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In ogni caso, prima che possa essere smaltito in modo adeguato, il liquido aspirato dalle strisce deve essere
trattato con una soluzione di ipoclorito sodico a una concentrazione finale di 2,5% per 24 ore.
Il tampone di lavaggio concentrato deve essere diluito a 1:20 prima dell’uso. Se non si usa tutta la piastra,
preparare un volume di soluzione proporzionale all’uso.
Fase 1 Preparazione: contrassegnare tre pozzetti come controllo negativo (ad es. B1, C1, D1), due pozzetti
come controllo positivo (ad es. E1 per HIV-1 e F1 per HIV-2) e uno come bianco (ad es. A1, nel
pozzetto del bianco non vanno aggiunti né campioni né coniugato). Se i risultati saranno determinati
mediante l’uso di un lettore di piastra a lunghezza d’onda doppia, si può evitare l'impiego del pozzetto
del bianco. Utilizzare solamente il numero di strisce necessario per il test.
Fase 2 Aggiunta del Campione: aggiungere 100 μl di campioni e 100 μl di controlli positivo e negativo nei
rispettivi pozzetti.
NOTA: usare un puntale monouso per pipetta diverso per ciascun campione, controllo negativo e
positivo per evitare contaminazioni crociate.
Fase 3 Incubazione del campione: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per
30 ± 1 minuti. È consigliabile utilizzare un recipiente con acqua controllata con termostato per
assicurare che temperatura e umidità rimangano stabili durante l’incubazione. Se viene utilizzato un
incubatore a secco, non aprire lo sportello frequentemente.
Fase 4 Lavaggio (1): al termine dell’incubazione, rimuovere ed eliminare il foglio adesivo. Lavare ciascun
pozzetto 5 (cinque) volte con tampone di lavaggio diluito. Lasciare ogni volta i micropozzetti in
ammollo per 30-60 secondi. Dopo l’ultimo ciclo di lavaggio, capovolgere la piastra su carta
assorbente o su un asciugamano pulito e asciugarla per rimuovere eventuali residui.
Fase 5 Aggiunta del coniugato: aggiungere 100 μl di reagente coniugato in ciascun pozzetto, tranne che
in quello del bianco.
Fase 6 Incubazione del coniugato: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37°C per
30 ± 1 minuti.
Fase 10 Misurazione dell’assorbanza: calibrare il lettore di piastra con il pozzetto del bianco e leggere
l’assorbanza a 450 nm. Se viene impiegato uno strumento a doppio filtro, regolare la lunghezza
d’onda di riferimento a 620 nm o 630 nm. Calcolare il valore di soglia e valutare i risultati.
(NOTA: leggere l’assorbanza entro un massimo di 10 minuti dall’arresto della reazione.)
Controllo di qualità
Ciascun laboratorio dovrebbe definire un adeguato sistema di controllo di qualità con materiali di controllo della
qualità simili o identici a quelli del campione dei pazienti analizzato.
- Il valore di assorbanza del pozzetto del bianco, che contiene solo soluzioni di cromogeno e bloccante, deve
essere inferiore a 0,080 a 450 nm.
- Il valore di assorbanza del controllo positivo deve essere ≥ 0,800 a 450/620-630 nm o a 450 nm dopo la
sottrazione del bianco.
- Ogni singolo valore di assorbanza del controllo negativo deve essere inferiore a 0,100 a 450/620-630 nm o
a 450 nm dopo aver sottratto il bianco.
Se uno dei valori del controllo negativo non rientra nei criteri del controllo di qualità, deve essere scartato e il valore
medio va ricalcolato utilizzando i due valori rimanenti. Se più di un valore di assorbanza del controllo negativo non
rientrano nell’intervallo del controllo di qualità, il test non è valido e deve essere ripetuto.
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Risultati
Ciascuna micropiastra deve essere considerata separatamente quando si calcolano e si interpretano i risultati
del test, indipendentemente dal numero di piastre processate contemporaneamente. I risultati vengono calcolati
mettendo in relazione il valore di assorbanza (S) di ciascun campione con il valore di soglia (CO) della piastra.
Se la lettura del valore di soglia si basa su un lettore di piastra a filtro singolo, i risultati vanno calcolati
sottraendo il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Nel caso di un
lettore di piastra a doppio filtro, non si deve sottrarre il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei
campioni e dei controlli.
Calcolare il valore di soglia aggiungendo 0,120 all’assorbanza media del controllo negativo.
Esempio:
Valore di assorbanza del pozzetto del bianco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: il pozzetto del bianco è necessario solo
per la lettura con filtro singolo a 450 nm).
Pozzetto n.: B1 C1 D1
Ctrl Neg: 0,012 0,010 0,011
Pozzetto n.: E1 F1
Ctrl Pos: 2,363 2,436
Tutti i valori dei controlli sono entro il range del controllo di qualità stabilito.
Risultati negativi (S/CO < 1): i campioni con un’assorbanza inferiore al valore di soglia sono negativi per questo
test: ciò significa che non sono stati determinati anticorpi anti-HIV 1/2 con il kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Un risultato
negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HIV.
Risultati positivi (S/CO ≥ 1): i campioni con un’assorbanza uguale o maggiore al valore di soglia sono considerati
inizialmente reattivi: ciò indica che, probabilmente, impiegando bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati rilevati anticorpi
anti-HIV 1/2. Prima dell’interpretazione finale dei risultati del test, tutti i campioni inizialmente reattivi devono essere
testati nuovamente in duplicato con bioelisa HIV-1+2 3.0. I campioni ripetutamente reattivi possono essere
considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 con bioelisa HIV-1+2 3.0.
Dubbi (S/CO = 0,9-1,1): i campioni con un rapporto assorbanza / valore di soglia compreso tra 0,9 e 1,1 sono
considerati dubbi ed è necessario un nuovo test in duplicato di questi campioni per confermare i risultati
iniziali.
Sono necessari follow-up, conferma e test supplementari dei campioni positivi con altri sistemi di analisi
(ad es. WB, PCR). La diagnosi clinica non deve essere stabilita basandosi sul risultato di un singolo test, ma deve
integrare i dati clinici con altri dati e reperti di laboratorio.
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- Se, dopo la ripetizione del test dei campioni inizialmente reattivi, entrambi i pozzetti danno risultati negativi
(S/CO < 0,9), questi campioni devono essere considerati positivi non ripetibili (o falsi positivi) e registrati come
negativi. Come per molti test ELISA molto sensibili, i falsi positivi possono verificarsi per svariate ragioni, la
maggior parte delle quali connesse, ma non limitate, ad un lavaggio inadeguato. Per maggiori informazioni
relative alla risoluzione dei problemi del test bioelisa, fare riferimento alla Guida per la soluzione dei problemi.
- Se dopo la ripetizione del test in duplicato, uno o entrambi i pozzetti danno risultati positivi, il risultato finale di
questo test ELISA deve essere registrato come ripetutamente reattivo. I campioni ripetutamente reattivi
possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-HIV 1/2 e quindi il paziente presenta probabilmente
infezione da HIV 1/2 e l’unità di sangue deve essere smaltita.
- Dopo la ripetizione del test in duplicato, campioni con valori prossimi al valore di soglia dovranno essere
interpretati con cautela e considerati come campioni in zona "dubbia" o non interpretabili al momento del test.
Caratteristiche di funzionalità
Lo studio di valutazione condotto ad Alkmaar, Paesi Bassi, tra aprile e novembre 2005, ha dimostrato le seguenti
caratteristiche di funzionalità di bioelisa HIV-1+2 3.0.
La specificità diagnostica del kit è stata del 99,85% come determinato su tutti i campioni negativi analizzati (5471).
Quando la specificità è stata studiata solo su donatori non selezionati (donatori casuali e alla prima donazione),
è risultata del 99,92% (IC 95%, 99,84-100%).
Tutti i pannelli di campioni positivi confermati per gli anticorpi anti-HIV-1, HIV-1 sottotipo O e HIV-2 utilizzati in
questo studio, sono anche risultati reattivi con il test bioelisa HIV-1+2 3.0, determinando una sensibilità
diagnostica del 100%.
Un totale di 32 pannelli di sieroconversione, che rappresentano 210 campioni testati. 13 campioni non classificati
da PRB918 e PRB917 a causa dell'assenza dei dati sulla determinazione dell'RNA o dell'antigene necessari per la
classificazione. 41 campioni classificati come negativi. Negativi per l'RNA e/o l'antigene. 61 campioni classificati
come sieroconversione precoce. 95 campioni classificati come sieroconversione.
I risultati del test mostrano anche che bioelisa HIV-1+2 3.0 è un test all'avanguardia rispetto alla maggior parte dei
test con marchio CE attualmente disponibili sul mercato.
La sensibilità analitica è stata valutata su pannelli anti-HIV PeliCheck. La sensibilità analitica di bioelisa HIV-1+2 3.0
sulle diluizioni standard anti-HIV PeliCheck è risultata comparabile a quella di altri test anti-HIV.
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Specificità analitica:
I risultati del test bioelisa HIV-1+2 3.0 su campioni prelevati da pazienti ospedalizzati e su campioni con possibile
reattività crociata:
Numero di
Positivi (S/CO ≥1) Negativi (S/CO <1)
Tipo di campione campioni
testati Numero % Numero %
Mononucleosi 296 4 1,35 292 98,65
Donna in gravidanza 101 0 0 101 100
RF+ 17 0 0 17 100
Anti-TPO 5 0 0 5 100
Anti- muscolo liscio 5 0 0 5 100
Livelli di IgG elevati 4 0 0 4 100
- Il possibile effetto gancio alle alti dosi viene eliminato a causa dell’esecuzione di una procedura a due fasi.
- Sono stati analizzati campioni positivi/negativi congelati per verificare le interferenze dovute al prelievo e alla
conservazione. Non sono stati osservati effetti sulle caratteristiche delle prestazioni di bioelisa HIV-1+2 3.0
per almeno 3 cicli di congelamento/scongelamento.
- Sono stati testati campioni prelevati da pazienti con virus dell’epatite A, B, C ed E, nonché campioni prelevati
da pazienti con infezione da Treponema pallidum, e non è stata osservata alcuna reattività crociata.
- Con il bioelisa HIV-1+2 3.0 sono stati testati 25 campioni di siero fresco positivi, analizzati presso l'ISTITUTO
DI MEDICINA TROPICALE, BELGIO. Tutti i 25 campioni di siero fresco positivi sono risultati positivi al bioelisa
HIV-1+2 3.0.
Precisione:
Le seguenti tabelle riportano i risultati della sensibilità analitica e della riproducibilità di bioelisa HIV-1+2 3.0 con
run control PeliSpy Multi-Marker e con campione QC interno testato in ciascuna piastra; la diluizione 1:2048 dello
standard anti-HIV in questo campione PeliSpy è stata rilevata in modo coerente in tutte le piastre. In tutte le piastre
è stato sempre determinato un campione QC interno.
Percentili Misurati
Diluizione n Media
5° 95° Min Max
1:2048 80 3,08 1,76 4,39 1,70 4,96
Percentili Misurati
n Media
5° 95° Min Max
160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89
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LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
Teste de ELISA para a detecção de anticorpos dos Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) tipo 1
(grupo M-O) ou tipo 2 em amostras de soro ou plasma humanos em laboratórios clínicos e como teste de
rastreamento de primeira linha nos centros hematológicos.
Sumário
As evidências serológicas de infecção por HIV podem ser obtidas testando a presença de antígenos ou anticorpos
no soro de indivíduos com suspeita de infecção por HIV. Normalmente, o antígeno só pode ser detectado na fase
aguda e na fase sintomática da AIDS. Os anticorpos de HIV-1 e/ou HIV-2 podem ser detectados em praticamente
todo o período de infecção, começando na, ou pouco depois da fase aguda, e durando até a fase final da AIDS.
Assim, o uso de testes de anticorpos altamente sensíveis é a abordagem primária nos serodiagnósticos da
infecção por HIV. Além da transmissão sexual, a principal via de transmissão do HIV é a transfusão sanguínea O
HIV pode estar presente nas frações celulares ou nas frações acelulares do sangue humano. Portanto, todas as
doações de sangue ou plasma devem ser testadas devido ao risco de transmissão de HIV através de sangue
contaminado. Isso pode ser realizado eficazmente testando a presença de anticorpos de HIV-1 e de HIV-2 usando
testes ELISA altamente sensíveis.
Princípio
O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método imunoenzimático direto, de tipo “sanduíche” de dois passos de incubação,
em que os pocinhos de uma microplaca são recobertos com antígenos recombinantes de HIV expressos em
E. coli (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2 recombinante gp-36). As amostras de soro ou plasma são
adicionadas a esses pocinhos para análise. Se estiverem presentes anticorpos específicos de HIV1/2 na amostra,
irão formar complexos estáveis com os antígenos de HIV recombinante. Os micropocinhos são depois lavados
para remover proteínas séricas não ligadas. Adiciona-se aos pocinhos um segundo conjunto de antígenos
recombinantes conjugados com peroxidase e expressando os mesmos epítopos. Durante o segundo passo de
incubação, esses antígenos vão ligar-se a anticorpos capturados específicos. Depois de uma segunda lavagem
para remover o conjugado não ligado, é adicionada uma solução Cromogênica aos pocinhos. Nos pocinhos que
contêm o imunocomplexo do tipo sanduíche antígeno-anticorpo-antígeno, os Cromogênios incolores são
hidrolisados pelo conjugado ligado, a um produto de cor azul. A cor azul muda para amarelo depois do bloqueio da
reação com ácido sulfúrico. A intensidade da cor pode ser medida e é proporcional à concentração de anticorpos
anti-HIV 1/2 da amostra. Os pocinhos que contêm amostras negativas permanecem incolores.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocinhos recobertos com antígenos recombinantes HIV 1/2 (HIV-1 recombinante gp41, gp120 e HIV-2
recombinante gp36). As tiras de micropocinhos são para USO ÚNICO. Não utilizar se a vedação a vácuo
estiver danificada ao retirá-las da caixa pela primeira vez.
5. CONJ CONJUGADO:
Antígenos recombinantes HIV-1 e HIV-2 conjugados com peroxidase. Contém 0,1% ProClinTM 300 como
conservante e corante vermelho. Pronto para usar.
BIOKIT, S.A. - Can Malé s/n - 08186 Lliçà d’Amunt - Barcelona - SPAIN 3000-1168 R03 08.2015 por
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Precauções
O bioelisa HIV-1+2 3.0 é para o diagnóstico IN VITRO. IVD
Para uso exclusivamente por profissionais.
AVISO: Podem ter sido usados materiais de origem humana na preparação do Controle Negativo do kit. Esses
materiais foram testados com kits de teste com desempenho aceite e considerados negativos a anticorpos de HIV
1/2, HCV, TP e HBsAg. No entanto, não existe qualquer método analítico que possa garantir a ausência total de
agentes infecciosos das amostras ou dos reagentes. Assim, os agentes e as amostras devem ser manuseados
com extrema precaução como se fossem material potencialmente infeccioso. Foram usados soros derivados de
bovinos para estabilizar os controles positivo e negativo. A albumina de soro bovino (BSA) e os soros fetais de
vitela (FCS) são derivados de animais de zonas geográficas isentas de EEB/EET.
O Controle negativo, o controle positivo HIV-1, o controle positivo HIV-2 e o Conjugado contêm 0,1% de
TM
ProClin como conservante. A seguir, indicam-se as frases de risco (R) e de segurança (S) adequadas:
Os testes ELISA são sensíveis ao tempo e à temperatura. Para evitar resultados incorretos, cumpra exatamente
os passos do procedimento do teste e não os modifique.
1. Não troque reagentes de lotes diferentes, nem use reagentes de outros kits à venda no mercado. Os
componentes desse kit correspondem exatamente a um desempenho ótimo dos testes.
2. Assegure-se que todos os reagentes se encontram no prazo de validade indicado na caixa do kit e são do
mesmo lote. Nunca use reagentes depois da data de validade indicada nas etiquetas ou nas caixas.
3. PRECAUÇÃO - PASSO CRÍTICO: Deixe que todos os reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente
(18-30ºC) antes de usar. Agite suavemente o reagente antes de usar. Volte a colocar a uma temperatura entre
2 e 8°C imediatamente depois de usar.
4. Use apenas o volume de amostra suficiente, como indicado nos passos do procedimento. Caso contrário,
pode provocar uma baixa sensibilidade do teste.
5. Não toque na parte exterior do fundo dos pocinhos; dedadas ou arranhões podem interferir na leitura. Ao ler os
resultados, assegure-se que a parte inferior da placa está seca e que não existem bolhas de ar nos pocinhos.
6. Nunca deixe os pocinhos da microplaca secarem depois do passo de lavagem. Passe imediatamente para o
passo seguinte. Evite a formação de bolhas de ar quando adicionar os reagentes.
7. Evite interrupções demoradas entre os passos do teste. Assegure-se que as condições de trabalho são iguais
para todos os pocinhos.
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8. Calibre a pipeta frequentemente para garantir a exatidão da dispensa das amostras e dos reagentes. Use
ponteiras de pipeta diferentes para cada amostra e reagente para evitar contaminações cruzadas.
10. Quando adicionar as amostras, não toque na parte inferior do pocinho com a ponteira da pipeta.
11. Quando medir com um leitor de placas, determine a absorvância a 450 nm ou a 450/620-630 nm.
12. A atividade enzimática do Conjugado pode ser afetada por pó, produtos e substâncias químicas como o
hipoclorito de sódio, ácidos, bases, etc. Não efetue o teste na presença dessas substâncias.
13. Se usar equipamento totalmente automatizado, durante a incubação, não tape as placas com a folha adesiva.
A parte de bater na placa para retirar os resíduos depois da lavagem também pode se omitida.
14. Todas as amostras de origem humana devem ser consideradas como potencialmente infecciosas. A adesão
estrita aos regulamentos de Boas Práticas Laboratoriais (GLP) pode garantir a segurança pessoal.
15. Nunca coma, beba, fume ou aplique cosméticos no laboratório de testes. Nunca pipete as soluções com a boca.
16. Os produtos químicos devem ser manuseados e eliminados apenas de acordo com as Boas Práticas
Laboratoriais (GLP) atuais e com os regulamentos nacionais ou locais.
17. As ponteiras das pipetas, os frascos, as tiras e os recipientes das amostras devem ser recolhidos e colocados
em autoclave durante um período nunca inferior a 2 horas a 121°C ou tratados com hipoclorito de sódio a
10% durante 30 minutos para descontaminação, antes de qualquer outro passo de eliminação. As soluções
que contêm hipoclorito de sódio NUNCA devem ser colocadas em autoclave. Ficha de dados de segurança
do material (MSDS) disponível a pedido.
18. Alguns reagentes podem causar toxicidade, irritação, queimaduras ou ter efeitos carcinogênicos como
matérias-primas. O contacto com a pele e as mucosas deve ser evitado e não se limita aos seguintes
reagentes: Solução de bloqueio, os Cromogênios e o Tampão de lavagem.
Conservação e estabilidade
Os componentes do kit irão permanecer estáveis até a data de validade indicada na etiqueta e na embalagem quando
armazenados entre 2 e 8°C. Não congelar. Para garantir o máximo desempenho do kit bioelisa HIV-1+2 3.0,
durante o armazenamento, proteja os reagentes de contaminação com microrganismos ou produtos químicos. As
tiras do micropocinhos podem ser separadas para uso individual. Coloque os pocinhos ou as tiras não usados na
bolsa de plástico para armazenamento junto com o dessecante e volte a colocar entre 2 e 8°C. Depois de aberta,
a microplaca é estável durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. O Controle Negativo, o Controle
Positivo HIV-1, o Controle Positivo HIV-2, o Conjugado, a Solução Cromogênica A, a Solução Cromogênica B e a
Solução de Bloqueio, depois de abertos, são estáveis durante um mês a uma temperatura entre 2 e 8°C. A
Solução de Lavagem, depois de diluída, é estável durante uma semana à temperatura ambiente ou durante duas
semanas a uma temperatura entre 2 e 8°C.
Apresentações disponíveis
- Kit de 1 placa (96 testes), REF 3000-1168.
Contendo: 1 placa, 1 x 1 ml controle negativo, 1 x 1 ml controle positivo HIV-1, 1 x 1 ml controle positivo HIV-2,
1 x 12 ml conjugado, 1 x 50 ml solução de lavagem, 1 x 8 ml solução cromogênica A, 1 x 8 ml solução
cromogênica B, 1 x 8 ml solução de bloqueio, 1 bolsa de plástico e folhas adesivas (6 unidades).
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Processamento automático
Os testes automáticos ou semiautomáticos podem ser realizados com diferentes instrumentos. É muito importante
validar qualquer sistema automático para demonstrar que os resultados obtidos para as amostras são
equivalentes aos resultados obtidos usando testes manuais. Recomenda-se que o usuário valide periodicamente o
instrumento. Em caso de dificuldade na programação e configuração dos processadores automáticos Biokit,
contate seu distribuidor.
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Em qualquer caso, o líquido aspirado para fora das tiras deve ser tratado com uma solução de hipoclorito de sódio
em uma concentração final de 2,5% durante 24 horas, antes de serem eliminadas de forma adequada.
O Tampão de lavagem concentrado deve ser diluído a 1:20 antes de ser usado. Se usar menos de uma placa,
prepare um volume proporcional de solução.
Passo 1 Preparação: Marque três pocinhos como Controle Negativo (por ex., B1, C1, D1), dois pocinhos como
Controlo Positivo (por ex., E1 para HIV-1 e F1 para HIV-2) e um Branco (por ex., A1, não devem ser
adicionadas amostras, nem Conjugado no pocinho Branco). Se for usado um leitor de placas com
duplo comprimento de onda, o requisito de uso de Branco pode ser omitido. Use apenas o número de
tiras necessário para o teste.
Passo 2 Adicionar a amostra: Adicione 100 μl de amostras e 100 μl de controles Positivo e Negativo nos
respectivos pocinhos.
NOTA: Use uma ponteira de pipeta descartável separada para cada amostra, Controle Positivo e
Negativo para evitar contaminação cruzada.
Passo 3 Incubar a amostra: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante
30 ± 1 minutos. Recomenda-se a utilização de um recipiente com água controlado por termostato
para garantir a estabilidade da temperatura e da umidade durante a incubação. Se usar uma
incubadora a seco, não abra a porta frequentemente
Passo 4 Lavagem (1): Depois do final da incubação, retire e elimine a folha adesiva. Lave bem cada um dos
pocinhos 5 (cinco) vezes com Tampão de lavagem diluído. Deixe sempre os micropoços embebidos
durante 30 a 60 segundos. Depois do ciclo de lavagem final, volte a placa para baixo em papel
absorvente ou em uma toalha limpa e bata para remover todo o conteúdo.
Passo 5 Adicionar o Conjugado: Adicione 100 μl de Reagente conjugado em cada pocinho, exceto o Branco.
Passo 6 Incubar o Conjugado: Tape a placa com a folha adesiva e faça a incubação a 37°C durante
30 ± 1 minutos.
Passo 9 Reação de Bloqueio: Usando uma pipeta multicanal ou manualmente, adicione 50 µl de Solução de
bloqueio em cada pocinho e misture suavemente. Desenvolve-se uma cor amarela intensa nos
pocinhos do controlo Positivo e da amostra positiva para HIV 1/2.
Passo 10 Medição da Absorvância: Calibre o leitor de placas com o pocinho Branco e leia a absorvância a
450 nm. Se usar um instrumento de filtro duplo, defina o comprimento de onda de referência para
620 nm ou 630 nm. Calcule o valor do Cut-off e avalie os resultados. (NOTA: leia a absorvância no
prazo máximo de 10 minutos depois do bloqueio da reação).
Controle de qualidade
Recomenda-se que cada laboratório defina um sistema de controle de qualidade adequado com material de
controle de qualidade semelhante ou idêntico à amostra do doente que está a ser analisada.
- O valor da Absorvância do pocinho Branco, que contém apenas Cromagênio e a Solução de bloqueio, deve
ser inferior a 0,080 a 450 nm.
- O valor da Absorvância do controle Positivo deve ser ≥ 0,800 a 450/620-630 nm ou a 450 nm depois de ser
subtraído o branco.
- Cada valor da Absorvância individual do controle Negativo deve ser inferior a 0,100 a 450/620-630 nm ou a
450 nm depois de ser subtraído o branco.
Se um dos valores do controle Negativo não cumprir os critérios de Controle de Qualidade, deverá ser eliminado e
o valor médio deverá ser novamente calculado usado os dois valores restantes. Se as especificações do Intervalo
do Controle de Qualidade não forem cumpridas por mais de um valor de Absorvância do controlo Negativo, o teste
não será válido e deverá ser repetido.
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bioelisa
Resultados
Cada microplaca dever ser considerada separadamente quando os resultados do teste são calculados e
interpretados, independentemente do número de placas processadas em simultâneo. Os resultados são
calculados relacionando o valor da absorvância (S) de cada amostra com o valor do Cut-off (CO) da placa. Se a
leitura do Cut-off se basear em um leitor de placas de filtro simples, os resultados devem ser calculados
subtraindo o valor A do pocinho do Branco a partir dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles.
Se a leitura se basear em um leitor de placas de filtro duplo, não subtraia o valor A do pocinho do Branco a partir
dos valores do relatório impresso das amostras e dos controles.
Exemplo:
Valor da Absorvância do pocinho do Branco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: o Branco só é necessário quando a
leitura é efetuada com um filtro simples a 450 nm)
N.º do pocinho: B1 C1 D1
Ctrl. Neg.: 0,012 0,010 0,011
N.º do pocinho: E1 F1
Ctrl. Pos.: 2,363 2,436
Todos os valores dos controles estão dentro do intervalo do controle de qualidade indicado.
Resultados Negativos (S/CO < 1): As amostras com resultados de absorvância inferiores ao valor do Cut-off
são negativas para esse teste, o que indica que não foram detectados anticorpos anti-HIV 1/2 com o kit
bioelisa HIV-1+2 3.0. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de exposição ou infecção por HIV.
Resultados Positivos ( S/CO ≥ 1): As amostras com resultados de absorvância iguais ou superiores ao valor do
Cut-off são consideradas como inicialmente reativas, o que indica que, provavelmente, foram detectados anticorpos
anti-HIV 1/2 usando o kit bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as amostras inicialmente reativas devem ser testadas
novamente em duplicados usando o bioelisa HIV-1+2 3.0 antes da interpretação final dos resultados. As amostras
repetidamente reativas podem ser consideradas positivas a anticorpos HIV 1/2 com o bioelisa HIV-1+2 3.0.
Duvidoso (S/CO = 0,9-1,1): As amostras com uma relação de absorvância para Cut-off entre 0,9 e 1,1 são
consideradas duvidosas e é necessário voltar a testar essas amostras em duplicado para confirmar os resultados
iniciais.
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bioelisa
- Se, depois da repetição do teste das amostras inicialmente reativas, ambos os pocinhos tiverem resultados
negativos (S/CO < 0,9), essas amostras devem ser consideradas como positivas não repetíveis (ou falso
positivo) e registradas como negativas. Tal como em muitos testes ELISA de alta sensibilidade, podem ocorrer
resultados falsos positivos por diversas razões, estando a maioria delas relacionada, mas não se limitando a,
um passo de lavagem inadequado. Para mais informações sobre o bioelisa, consulte a Guia de problemas do
bioelisa.
- Se, depois da repetição do teste em duplicado, um ou ambos os pocinhos tiverem resultados positivos, o
resultado final desse teste ELISA deve ser registrado como repetidamente reativo. As amostras repetidamente
reativas podem ser consideradas positivas para anticorpos de HIV 1/2 e, assim, o doente está, provavelmente
infectado com HIV 1/2 e a unidade de sangue deve ser eliminada.
- Depois da repetição do teste em duplicado, as amostras com valores próximos do valor do Cut-off devem ser
interpretadas com precaução e consideradas como amostra na zona “duvidosa” ou como não sendo possível
interpretar durante o período do teste.
Limitações do procedimento
1. Os resultados positivos podem ser confirmados com outro método disponível e interpretados em conjunto
com a informação clínica do doente.
2. Os anticorpos podem não ser detectáveis durante as fases precoces da doença e em alguns indivíduos
imunodeprimidos. Assim, os resultados negativos obtidos com o bioelisa HIV-1+2 3.0 indicam apenas que a
amostra não contém um nível detectável de anticorpos anti-HIV 1 ou 2 e qualquer resultado negativo não
deve ser considerado como evidência conclusiva de que o indivíduo não está infectado por HIV 1 ou 2.
3. Os erros mais comuns nos testes são: usar os kits depois da data de validade, procedimentos de lavagem
incorretos, reagentes contaminados, passos incorretos do procedimento do teste, aspiração insuficiente
durante a lavagem, não adicionar amostras ou reagentes, utilização inadequada do equipamento laboratorial,
erros de temporização, utilização de amostras altamente hemolizadas ou amostras que contêm fibrina,
amostras de soro não totalmente coagulado.
4. A prevalência do marcador irá afetar os valores preditivos do teste.
5. Este teste não pode ser usado para testar plasma agrupado (misturado). O bioelisa HIV-1+2 3.0 foi avaliado
apenas com amostras de soro ou plasma individuais.
6. O bioelisa HIV-1+2 3.0 é um teste qualitativo e os resultados não podem ser usados para medir as
concentrações de anticorpos. Este teste não consegue fazer a distinção entre as infecções por HIV-1
e HIV-2.
Características funcionais
O estudo de avaliação efetuado em Alkmaar, nos Países Baixos, entre Abril e Novembro de 2005, demonstrou as
seguintes características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0.
A especificidade diagnóstica do kit foi de 99,85% conforme determinado em todas as amostras negativas (5471)
que foram investigadas. Examinamos apenas doadores não selecionados (doadores aleatórios e de primeira vez),
a especificidade foi de 99,92% (95% IC 99,84-100%).
Todos os painéis de HIV-1, HIV-1 subtipo O e HIV-2 confirmaram amostras positivas a anticorpos usadas nesse
estudo que também foram reativas com o bioelisa HIV-1+2 3.0, resultando em uma sensibilidade diagnóstica
de 100%.
Total de 32 painéis de soroconversão, representando 210 amostras testadas. 13 amostras de PRB918 e PRB917
não classificadas devido à ausência de dados de determinação de antígeno ou de RNA necessários para a
classificação. 41 amostras classificadas como negativas. Negativo para RNA e/ou antígeno. 61 amostras
classificadas como soroconversão precoce. 95 amostras classificadas como soroconversão.
Os resultados dos testes também indicam que o bioelisa HIV-1+2 3.0 é um método de última geração, comparável
à maioria dos testes disponíveis atualmente no mercado com a marca CE.
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- Possibilidade de efeito de gancho por dose elevada eliminado devido à implementação do procedimento de
dois passos.
- Foram testadas amostras positivas/negativas congeladas para verificar interferências na coleta e
armazenamento. As características técnicas do bioelisa HIV-1+2 3.0 não foram afetadas durante pelo menos
3 ciclos de congelamento/descongelamento.
- As amostras de doentes infectados pelos vírus da hepatite A, B, C e E, bem como amostras de doentes
infectados por Treponema pallidum foram testadas, sem que tenham sido observadas reações reativas
cruzadas.
- 25 amostras positivas de soro fresco foram testadas no INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL, BÉLGICA,
com bioelisa HIV-1+2 3.0. Todas as 25 amostras de soro fresco apresentaram resultado positivo com o
bioelisa HIV+1+2 3.0.
Precisão:
As tabelas abaixo representam os resultados da sensibilidade analítica e da reprodutibilidade do bioelisa HIV-1+2 3.0
tal como controlado pelo controle executado PeliSpyMulti-Marker e pela amostra de CQ Interno testada em cada placa;
a diluição a 1:2048 do padrão anti-HIV nesta amostra PeliSpy foi consistentemente detectada em todas as placas. A
amostra de CQ Interno foi sempre detectada em todas as placas.
Resultados do PeliSpyMulti-Marker:
Percentis Medido
Diluição n Média
5º 95º Mín. Máx.
1:2048 80 3,08 1,76 4,39 1,70 4,96
Percentis Medido
n Média
5º 95º Mín. Máx.
160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89
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bioelisa
READ HIGHLIGHTED CHANGES
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
2. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamarat S, Gruest J, et al. Isolation of a
T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science.
1984; 220: 868-71.
3. Chandrasekhar K, Profy AT, Dyson HJ. Solution conformational preferences of immunogenic peptides derived
from the principal neutralizing determinant of the HIV-1 envelope glycoprotein gp120. Biochemistry. 1991;
30: 9187-94.
4. Constantine NT. Serologic test for the retroviruses: approaching a decade of evolution. AIDS. 1993; 7: 1-13
5. Gnann JW, McCormick JB, Mitchell S, Nelson JA, Oldstone MB. Synthetic peptide immunoassay distinguished
HIV type 1 and HIV type 2 infections. Science. 1987; 237: 1346-49.
6. Barr PJ, Steimer KS, Sabin EA, Parkes D, Geroge-Nascimento C, Stephans JC, et al. Antigenicity and
immunogenicity of domains of the human immunodeficiency virus (HIV) envelope polypeptide expressed in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. Vaccine. 1987; 5:90-01
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bioelisa
READ HIGHLIGHTED CHANGES
bioelisa HIV-1+2 3.0
3000-1168 1 x 96 TESTS
3000-1169 5 x 96 TESTS (480)
Procedural flow chart / Esquema del procedimiento / Schematischer Ablauf /
Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimento
Pipette Samples: 100 µl/well
Dispensar Muestras: 100 µl/pocillo
Proben verteilen: 100 µl/Vertiefung
Dispenser Échantillons: 100 µl/puits
Dispensare Campioni: 100 µl/pozzetto
Pipetar Amostras: 100 µl/pocinho
Ð
Pipette Controls: 100 µl/well
Dispensar Controles: 100 µl/pocillo
Kontrollen verteilen: 100 µl/Vertiefung
Dispenser Contrôles: 100 µl/puits
Dispensare Controlli: 100 µl/pozzetto
Pipetar Controles: 100 µl/pocinho
Ð
Incubate 30 minutes at 37°C
Incubar 30 minutos a 37°C
30 Minuten bei 37°C inkubieren
Incuber 30 minutes à 37°C
Incubare 30 minuti a 37°C
Incubar 30 minutos a 37°C
Ð
Wash 5x / Lavar 5x
Waschen 5x / Laver 5x
Lavare 5x / Lavar 5x
Ð
Pipette Conjugate: 100 µl/well
Dispensar el Conjugado: 100 µl/pocillo
Konjugat pipettieren: 100 µl/Vertiefung
Dispenser le Conjugué: 100 µl/puits
Dispensare il Coniugato: 100 µl/pozzetto
Pipetar o Conjugado: 100 µl/pocinho
Ð
Incubate 30 minutes at 37°C
Incubar 30 minutos a 37°C
30 Minuten bei 37°C inkubieren
Incuber 30 minutes à 37°C
Incubare 30 minuti a 37°C
Incubar 30 minutos a 37°C
Ð
Wash 5x / Lavar 5x
Waschen 5x / Laver 5x
Lavare 5x / Lavar 5x
Ð
Pipette Chromogen A: 50 µl/well
Dispensar el Cromogeno A: 50 µl/pocillo
Chromogen A pipettieren: 50 µl/Vertiefung
Dispenser le Chromogène A: 50 µl/puits
Dispensare il Cromogeno A: 50 µl/pozzetto
Pipetar o Cromogênio A: 50 µl/pocinho
Ð
Pipette Chromogen B: 50 µl/well
Dispensar el Cromogeno B: 50 µl/pocillo
Chromogen B pipettieren: 50 µl/Vertiefung
Dispenser le Chromogène B: 50 µl/puits
Dispensare il Cromogeno B: 50 µl/pozzetto
Pipetar o Cromogênio B: 50 µl/pocinho
Ð
Incubate 15 minutes at 37°C
Incubar 15 minutos a 37°C
15 Minuten bei 37°C inkubieren
Incuber 15 minutes à 37°C
Incubare 15 minuti a 37°C
Incubar 15 minutos a 37°C
Ð
Pipette Stopping Solution: 50 µl/well
Dispensar la Solución de Parada: 50 µl/pocillo
Stopplösung zufügen: 50 µl/Vertiefung
Dispenser la Solution d’Arrêt: 50 µl/puits
Dispensare la Soluzione Bloccante: 50 µl/pozzetto
Pipetar a Solução de Bloqueio: 50 µl/pocinho
Ð
Cut-off: NCx + 0.120 Read at 450 nm
Valor umbral: CNx + 0,120 Leer a 450 nm
Schwellenwert: CKx + 0,120 Bei 450 nm ablesen
Valeur seuil: CNx + 0,120 Lire à 450 nm
Valore di soglia: CNx + 0,120 Leggere a 450 nm
Cut-off: CNx + 0,120 Ler a 450 nm
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