BAKTERI LISTERIA SEBAGAI AGEN IMUNOPATOLOGI

DENGAN MEDIATOR VIRUS HERPES

Disusun Oleh:

Lesa Suryani Samsudin (B1A016062)

Vivi Ngatiqoh (B1A016076)
Sekar Tyas Pertiwi (B1A016080)

TUGAS TERSTRUKTUR IMUNOBIOLOGI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2018
 PENDAHULUAN

Infeksi yang disebabkan cedera immunopatologi adalah risiko kesehatan

yang umum bagi manusia. Interaksi antara mikroba dan tuan rumah telah
menjadi topik menarik. L. monocytogens, sebuah bakteri fakultatif intraseluler
Gram-positif, menyebabkan penyakit parah pada inang. Studi dalam model
murine menunjukkan cedera immunopatologi akut dari kompartemen limfoid di
limpa pada infeksi L. monocytogens. Lesi patologis dapat terjadi 24 jam setelah
infeksi dan puncak sekitar 48 jam, tergantung pada dosis infeksi, lesi terutama
ditemukan di daerah sel T dan dapat meluas ke folikel sel. Demikian, L.
monocytogens infeksi pada tikus merupakan model diakses dan berguna untuk
mempelajari mekanisme molekuler dan seluler yang mengatur infeksi diinduksi
immunopatologi.
Induksi tipe I interferon (IFN-I) merupakan respon bawaan host yang
penting pada infeksi Listeria setelah sel-sel fagositik mereka tertelan. Produksi
IFN-I mengaktifkan limfosit. Sejalan dengan hal ini, kekurangan reseptor IFN-I
pada limfosit akan menyelamatkan mereka dari apoptosis dan menghasilkan
beban bakteri yang lebih rendah pada inang. Dengan demikian, Listeria
tampaknya mengeksploitasi tanggapan IFN-I host untuk infeksi produktifnya.
Bagaimana tuan rumah mengatur produksi IFN-I Listeria yang diinduksi
sebagian besar masih belum jelas.
Herpes virus entry mediator (HVEM), anggota dari superfamili reseptor
TNF, pertama kali diidentifikasi sebagai mediator untuk masuknya virus herpes
simplex (HSVs). Pekerjaan selanjutnya menunjukkan bahwa HVEM dapat
bertindak sebagai reseptor [untuk LIGHT (homolog terhadap limfotoxin,
menunjukkan ekspresi yang dapat diinduksi, dan bersaing dengan glikoprotein D
untuk HVEM, reseptor yang diekspresikan oleh limfosit)] dan ligan [untuk
BTLA (B dan sel T) attenuator) dan CD160], oleh karena itu memberikan sinyal
bidirectional dalam berbagai jenis sel. Keterlibatan HVEM oleh LIGHT telah
terbukti mentransduksi jalur stimulasi dalam sel T, sel NK dan monosit14-17.
Ligasi HVEM ke BTLA memberikan sinyal penghambatan dalam T, B dan sel
dendritik (DC). Pengikatan HVEM ke CD160 dapat mentransduksi sinyal
penghambatan atau aktivasi, tergantung pada skenario. Oleh karena itu, HVEM
dan mitra yang mengikatnya telah didemonstrasikan berbagai peran dalam
mengatur respon imun bawaan dan adaptif.
Jalur HVEM telah ditemukan memainkan peran penting dalam berbagai
jenis sel selama infeksi bakteri. HVEM dilaporkan untuk meningkatkan aktivitas
bakterisida monosit manusia dan neutrofil melawan Listeria dan S. aureus.
Dalam epitelium mukosa, HVEM diperlukan untuk transduser sinyal dan
aktivator dari transkripsi 3 (STAT3) aktivasi dan pertahanan host terhadap
bakteri patologis. Dalam kekebalan adaptif, HVEM telah ditemukan menjadi
penting untuk kelangsungan hidup sel CD8 + T yang diaktifkan antigen selama
infeksi Listeria. Menariknya, signaling BTLA baru-baru ini ditemukan
mempromosikan proliferasi Listeria di CD8 + DC, yang juga mendukung
tanggapan sel T jangka panjang. Sementara studi ini berfokus pada peran HVEM
atau BTLA untuk pertahanan tuan rumah, dampaknya terhadap cedera tuan
rumah masih kurang jelas. Memahami mekanisme diperlukan untuk
perlindungan yang lebih baik dari tuan rumah ketika menghadapi infeksi.
Dalam studi ini akan menyelidiki peran HVEM pada Listeria terinduksi
immunopatologi. Pada fase akut infeksi Listeria, perlindungan jelas terhadap lesi
limpa ditemukan di Hvem - / - host. Secara mekanis, produksi IFN-I di limpa
ditemukan pada tingkat yang lebih rendah secara signifikan pada tikus Hvem - / -
daripada pada tikus WT. Dengan demikian terdapat peran baru dari HVEM
dalam respon IFN-I selama infeksi Listeria diinduksi imunopatologi. HVEM
dapat bertindak sebagai faktor host baru tipping keseimbangan pertahanan tuan
rumah dan cedera tuan rumah selama infeksi.
 METODE

1. Semua tikus ditempatkan di bawah kondisi patogen bebas yang spesifik di

fasilitas perawatan hewan. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan
pedoman
2. Infeksi Listeria, pengobatan dan penentuan CFU. Listeria ditumbuhkan dalam
kaldu infus otak-jantung dengan 5 µg / ml eritromisin. Untuk penentuan beban
bakteri dalam jaringan, WT dan Hvem - / - tikus yang terinfeksi dengan 1 × 107
Listeria oleh i.p. injeksi. Pada titik waktu yang diindikasikan setelah infeksi,
organ dihomogenisasi dan dilarutkan dalam air steril dengan 0,5% Triton-100.
Pengenceran serial disepuh pada lempeng agar infus otak-jantung. Koloni
dihitung setelah inkubasi pada 37 ° C selama 2 hari. Untuk perawatan poli (I:C),
tikus disuntik i.v. dengan 100 atau 500 μg poli (I: C) (Sigma) dilarutkan dalam
garam steril.
3. Transfer sumsum tulang. Chimera sumsum tulang yang dihasilkan dengan 5 ×
106 sel sumsum tulang dari tikus donor yang ditransplantasikan i.v. ke dalam
tikus C57BL / 6 congen yang diradiasi secara alami. Untuk menghasilkan
campuran sumsum tulang sumsum tulang, 2,5 × 106 sel sumsum tulang
diperoleh dari WT dan Hvem - / - tikus, dan dicampur pada rasio 1: 1. Chimera
diberi air profilaksis yang mengandung antibiotik dan dianalisis 6-8 minggu
setelah transplantasi.
4. Histologi. Limpa difiksasi dalam 4% paraformaldehyde dan ditanam di
parafin. Bagian diwarnai dengan hemotoxylin eosin (H & E). Slides dipindai
pada Leica SCN400 F slide scanner.
5. Arus cytometry. Suspensi sel tunggal limpa dipersiapkan. Antibodi berikut
digunakan untuk pewarnaan imunofluoresensi: 7-AAD (BD Biosciences), F4 /
80 (BM8), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6,7), CD19 (6D5), CD69 (H1.2F3) semua
dari eBioscience; Annexin V, CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), Ly6C (HK1.4),
MHC II (M5 / 114.15.2) semua dari Biolegend. Sampel diperoleh pada
instrumen BD LSRFortessa dan dianalisis dengan software FlowJo. CD11b + F4
/ 80 + makrofag dan Ly6C + CD11b + CD11c + MHC II + Tip-DC diurutkan
pada BD FACSAria III.
6. ELIsA. Tikus terinfeksi i.p. dengan Listeria atau menyuntikkan i.v. dengan
100 μg poli (I: C). Sera dikumpulkan 24 jam setelah infeksi atau 6 jam setelah
pengobatan poli (I: C). Tingkat IFN-β ditentukan menggunakan Mouse IFN-β
ELISA kit dengan pelat pra-dilapisi (Biolegend). Piring dibacakan pada 450 nm
menggunakan SpectraMax Plus.
7. PCR kuantitatif. Total RNA dari limpa diisolasi dengan Trizol (Invitrogen).
RNA dari sel yang diurutkan diekstraksi oleh RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen).
RNA dicerna dengan DNaseI dan reverse ditransfer ke cDNA untuk PCR real-
time. Tingkat ekspresi gen dinormalkan menjadi β-aktin. Primer berikut
digunakan: β-aktin, primer forward: 5′-ACACCCGCCACCAGTTCGC, primer
terbalik: 5′- ATGGGGTACTTCAGGGTCAGGGTCAGGATA; IFN-β, primer
forward: 5′CCATCCAAGAGA TGCTCCAG, primer terbalik: 5′-
GTGGAGAGCAGTTGAGGACA; IFNGR, primer forward: 5′-CCTGTC
GTATGCTGGGAATA, primer terbalik: 5′-AATGTTGGTGCAGGAATCAG;
IL-10, primer forward: 5′-CGCTGTCATCGATTTCTCC, primer terbalik: 5′-
ACACCTTGGTCTTGGAGCTT.
8. Analisis statistik. Semua data dianalisis menggunakan t-test dua-ekor Student
yang tidak berpasangan, kecuali tingkat mRNA sel yang diurutkan dianalisis
dengan memasangkan uji-t Student dua-ekor. Analisis dilakukan menggunakan
perangkat lunak GraphPad Prism.

Kesimpulannya, peran penting baru dari HVEM dalam regulasi Listeria

yang menginduksi produksi IFN-I dan imunopatologi membuka jalan baru untuk
memahami dan mengontrol respon IFN-I tidak hanya untuk infeksi Listeria,
tetapi juga untuk patogen lainnya.