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Facultad de Ciencias
Microbiología Laboratorio

I. INTRODUCCIÓN:

La tinción de Gram se definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram
en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente
debido a lo económico, sencillo y eficaz, estos resultados basados en las características
de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. (Wiley, J. et al 2008)

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria
Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por yodo en equilibrio con yoduro de potasio y Siulterio, los cuales
están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal
violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El yodo entra en
las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. (Luis
SBM, Altava B. 1997)

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que

en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos Gram positivos
no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. (Luis SBM, Altava B.
1997). Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras
que las Gram positivas permanecen azules. (Gamazo, C. et al 2005)

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del
protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán
rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (safranina).

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II. OBJETIVOS

- Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de

dos grupos grande de bacterias Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a
la tinción.

- Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e

identificación de las bacterias.

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III. MATERIALES Y MÉTODOS

a) Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción

Materiales:

 Muestra conteniendo bacterias.

 Asa de Kolle.

 Lamina porta objeto.

 Mechero de alcohol.

 Piseta con agua

Procedimiento:

1. Se colocó una gota de agua sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con
ayuda del asa de kolle se colocó sobre la gota una pequeña porción de la muestra a fijar.

2. Se distribuyó la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película
delgada.

3. Se aplicó la técnica de fijación por calor, se sitúo la lámina a una razonable distancia
sobre la llama del mechero. (Figura 2)

Figura 1: muestra de microrganismo Figura 2: fijación por calor

Fuente: creación propia Fuente: creación propia

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b) Tinción diferencial de Gram

Materiales:

 Láminas fijadas a microorganismos ( Escherichia coli, Streptococcus y

Bacillus )

 Colorantes básicos: Cristal violeta,

 Mordiente: Lugol

 Agente decolorante : Alcohol cetona

 Contrastante: Safranina

 Papel toalla

 Piseta de agua

 Soporte para tinción.

Procedimiento:

1.- Se colocaron las tres láminas fijadas con los microorganismos de muestra sobre el
soporte para tinción.

2.- Se agregaron 2 o 3 gotas del colorante básico dejando que actúen por un tiempo de:
30 segundos

3.- Una vez cumplido el tiempo para el colorantes, se lavó cada lámina con la piseta de
agua.( Figura 4)

4.- Se agregaron 2 o 3 gotas de lugol dejando que actúen por un tiempo de: 30
segundos. Pasado el tiempo se enjuago con agua destilada también

5.- Se decolora con 2 o 3 gotas de Alcohol cetona dejando que actúen por un tiempo
de: 10 segundos, pasado el tiempo también se enjuaga.

6.- Se procede al contraste con 2 o 3 gotas del Safranina dejando que actúen por un
tiempo de: 30 segundos y también se enjuago

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4.- Se secó las láminas con ayuda del papel toalla.

5.- Se examinaron las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión (100-150x) de

un microscopio compuesto.

Figura 3: tinción de la muestra Figura 4: lavado de la muestra teñida

Fuente: creación propia Fuente: creación propia

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IV. RESULTADOS Y DISCUCIONES :

Después de haber preparado las muestras (teñidas) en los portaobjetos se obtuvieron

los siguientes resultados:

 Streptococcus

 Género: Staphylococcus sp
 Forma: cocos
 Agrupación: racimo
 GA: 1000X

Figura 5: muestra Streptococcus

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 Escherichia coli

 Género: Staphylococcus sp
 Forma: cocos
 Agrupación: racimo
 GA: 1000X

Figura 7: muestra Escherichia coli

 Bacillus

 Género: Staphylococcus sp
 Forma: cocos
 Agrupación: racimo

 GA: 1000X

Figura 9: muestra Bacillus

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V. CONCLUSIONES:
 El mejor colorante para identificar y/o visualizar las diversas formas de los
microrganismos del tipo staphylococcus, es el carbolfuccina.


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VI. BIBLIOGRAFÍA
 Gamazo, C.; López-Goñi, I. y R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología.
Masson.
 Luis SBM, Altava B. Introducción a la química orgánica. Universitat
Jaume;1997.
 Wiley, J. M.; Sherwood, L. M. y Woolverton, C.J. 2008. Microbiología de
Prescott, Harley y Klein. McGrawHill. Interamericana de España, S.A.U.
Madrid

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VII. CUESTIONARIO :

1. ¿bajo qué circunstancia la tinción diferencial de Gram podría

resultar errática?

La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del

cultivo, cuanto más antigua sea la muestra, más riesgo de que la pared bacteriana se
encuentre dañada. El pH del medio también influye en la tinciónpues se requiere
que las células mantengan su carga negativa para la interacción correcta con los
colorantes, esto sucede a pH neutro o cercano al neutro. Edad de la bacteria, errores
del operador y uso de antibióticos.

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe servalorado con
precaución, ya que la reacción puede variar segun la edad de las células ( cultivos
viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas depeptidoglicanos y teñirse
como gram negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy
prolongado se puede correr el riesgo quebacterias gram positivas se tiñan como
gram negativas).

2. Que efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante

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