ARTÍCULO DE REVISIÓN/REVIEW ARTICLE

COLORACIÓN DE GRAM

GRAM COLORING
Duvan Andres sierra Marquez

Resumen

Objetivo: que el estudiante adquiera destreza en la técnica de la coloración de Gram al igual aprenda
a diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas Interprete los resultados obtenidos
en la aplicación de esta técnica. Y que Clasifique algunas especies bacterianas en Gram negativas o
Gram positivas de acuerdo a la tinción de Gram
Coloración de Gram
Adquiera destreza en la técnica de la coloración de Gram.
Aprenda a diferenciar las bacterias gran positivas de las Gram negativas.
 Interprete los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.
Clafisique algunas especies bacterianas en Gram negativas o Gram positivas de a
cuerdo a la tinción de Gram.
Tinciones selectivas: tinción de capsula.
Aprender algunas de las técnicas empleadas para la visualización de capsula
bacteriana.
Interpretar correctamente los resultados obtenidos en la aplicación de esta técnica.
Comprender la importancia que tiene esta tinción para la caracterización e
identificación de bacterias.

Abstract

Objetive: Food-borne diseases are a serious public health problem worldwide; with patho-genic bacteria as the most common cause,

leading to gastrointestinal disorders which can eventually lead to death. In this review are described studies about the detection of

food-borne pathogenic bacteria in Colombia publicized between the years 2010-2013, looks at information on the characteristics and

prevalence factor of found pathogens, the foods implicated in the studies and the characterization of isolated microorganisms. The

database search yielded a total of 16 articles focused directly to the detection of five pathogens: Sal-Manella spp., Listeria

monocytogenes, Escherichia coli, Aeromonas spp. and Vibrio spp.; nevertheless, most of the studies focused on Salmonella. There

were no research projects on any other food-borne disease-causing pathogens. The products tested were mainly raw or ready-to-eat

animal-based foods such as sea food and meat. This review reveals that despite the importance of detecting and characterizing

pathogens transmitted by contaminated food, there are very few published studies on this topic for the given review period. Likewise,

the research work was directed primarily to the search for micro-organisms as a final product rather than contamination along the

production line.

bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la

INTRODUCCIÓN
La tinción de Gram es uno de los métodos de
tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico y con el que el estudiante debe
estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
práctica es indiscutible en el trabajo microscópico
de rutina del Laboratorio de Microbiología. La
tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo
de tinción diferencial empleado en microbiología
para la visualización de bacterias, sobre todo en
muestras clínicas. Debe su nombre al
técnica en 1884 . Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana,
considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que
se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a
las que se visualizan de color rosa o rojo.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las
células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I 2 ( yodo) en equilibrio con KI
(yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el
yodo, y actúa de mordiente, haciendo que el cristal violeta
se fije con mayor intensidad a la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en las células y forma un
complejo insoluble en solución acuosa con el
cristal violeta.La mezcla de alcohol-acetona que
se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya
que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal
violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo
hacen.
Al utilizar las técnicas normales de coloración ya
realizadas no es posible visualizar la cápsula, por lo
tanto, es necesario aplicar técnicas especiales.
Para la visualización de la cápsula se conocen
varias técnicas, entre ellas tenemos la de Anthony y
la de tinta china que desarrollaremos en esta
práctica.

Para poner de manifiesto las células Gram

negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la
safranina o la fucsina . Después de la coloración de
contraste las células Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen
azules. La safranina puede o no utilizarse, no es
crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las
bacterias Gram negativas. Al término del
protocolo, las Gram positivas se verán azul-
violáceas y las Gram negativas, se verán rosas
(si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se
usó, por ejemplo, safranina al igual que La
cápsula bacteriana es la capa rígida con borde
definido formada por una serie de polímeros
orgánicos que en las bacterias se deposita en
el exterior de su pared celular. Generalmente
contiene glicoproteínas y un gran número de
polisacáridos diferentes, incluyendo
polialcoholes y aminoazúcares. []

La cápsula es una capa rígida organizada en

matriz impermeable que excluye colorantes
como la tinta china. En cambio, la capa de
material extracelular que se deforma con
facilidad, es incapaz de excluir partículas y no
tiene un límite definido, se denomina capa
mucosa o glucocalix. La cápsula les sirve a las
bacterias de cubierta protectora resistiendo la
fagocitosis. También se utiliza como depósito
de alimentos y como lugar de eliminación de
sustancias de desecho. Protege de la
desecación, ya que contiene una gran cantidad
de agua disponible en condiciones adversas.
Además, evita el ataque de los bacteriófagos y
permite la adhesión de la bacteria a las células
animales del hospedador.

106 bacterias gran negativas org.com

 Objetivos

OBJETIVOS
“tinción negativa para observación de
Que el estudiante: Aprenda algunas de lastécnicas
empleadas para la visualización de cápsulas bacterianas.
capsulas”
Interprete correctamente los resultados obtenidos en la
aplicación de esta técnica.Comprenda la importancia que
59 Colocar una pequeña gota de
tiene esta tinción para la caracterización e identificación tinta china en el extremo de
de bacterias.Entre las ETA más frecuentes están aquellas un portaobjetos; colocar
causadas por una contaminación de tipo biológico, junto una gota de cultivo
evidenciado por los reportes entre 1993-2010 realizados
al sistema de información regional de la Organización liquido de Klebsiella
Panamericana de la Salud (OPS); en los que se indica pneumoniae. Si se trata de
que de 9180 brotes reportados, el 69 % por bacterias, el un medio de cultivo solido,
9,7 % por virus y el 1,8 % por parásitos; el porcentaje
restante correspondió a otras causas de origen químico
hacer una suspensión del
(11). microoganismo en una gota
de agua destilada y mezclar
cuidadosamente con la tinta
Coloración de Gram china
1 Extienda y fije la muestra. 60 Distribuir la mezcla a
2 Cubra el extendido con cristal violeta. lo ancho del
Déjelo actuar durante 1 minuto. portaobjetos,
3 Lave el exceso de colorante con agua. colocando otro
4 Cubra el extendido con solución yodada portaobjetos
(lugol). Durante 1 minuto. Este actua perpendicular en
como un mordiente. angulo de 45° sobre la
5 Lave con agua muestra.
6 Decolore con el alcohol acetona durante 10 61 Desplazar poco a poco el
a 15 segundos aproximadamente.
segundo portaobjetos a lo
7 Lave con agua
largo del primero para hacer
8 Cubra el extendido son safranina. Dejela una capa fina de la mezcla.
actuar durante 1 minuto.
62 Dejar secar al aire.
9 Lave con agua, seque al ambiente
63 Observar con objetivo de
y observe al microscopio con el inmersión.
objetivo de inmersión.
10 Haga esquemas y describa lo observado.
Tinciones selectivas: tinción de capsula.

Bacterias gran positivas(Col.) 2016; 32 (1): 105-122 107

 RESULTADOS Y DISCUSION
Tinción negativa
La klebsiella es un basilo gran negativo ya que
estas no tienen la capacidad de fijar el cristal
de violeta porque poseen la capa de
lipopolisacarido (peptidoglicano)
Son bacterias gram negativas, la asimilación y
la fermentación de la lactosa se puede
observar en el agar MacConkey donde las
colonias son de color rosado y en el medio
Kliger o TSI donde son Ácido/Ácido, es decir
fermentador de la lactosa más producción de
gas; y en la fermentación acetónica o prueba
de Voges Proskauer son positivos. Por último,
sus condiciones óptimas de cultivo son
en agar nutritivo a 37 °C, pH de 7.0, presión
osmótica de 1 atm.
es la especie de mayor relevancia clínica
dentro del género bacteriano Klebsiella,
compuesto por bacterias Gram negativas de
la familia Enterobacteriaceae, que
desempeñan un importante papel como
causa de las enfermedades
infecciosas oportunistas. El género fue
llamado así en honor a Edwin Klebs, un
microbiólogo alemán de finales del siglo XIX.
El bacilo ahora conocido como Klebsiella
pneumoniae también fue descrito por Karl
Friedländer, y durante muchos años se
conoció como el «bacilo de Friedländer».
108
de ventas ambulantes y restaurantes. Dos de
estos fueron realizados en Bogotá. El primero
en un sector del norte de la ciudad, el cual
incluyó 40 establecimientos de venta
establecida y 20 de venta ambulatoria.
Los resultados obtenidos señalan que el 25 %
de los alimentos ambulantes y el 7,5 % de los
alimentos de venta establecida, como chorizo,
fritos, ensaladas de frutas, yogur con cereal,
arepa rellena y pincho de carne, fueron
positivos para Salmonella spp.
En este estudio también se realizó coprocul-
tivo a los manipuladores de alimentos para la
búsqueda de este microorganismo, y se obtuvo
una prevalencia del 15 % en ambu-lantes y 10
% en restaurantes; y se resalta que este personal
no presentó manifestaciones gastrointestinales
(29).
En el segundo trabajo, realizado en un sector
universitario en 2010, se detectaron 2 mues-tras
positivas para Salmonella entérica de 42
muestras analizadas (11.1 %): una muestra fue
hamburguesa y otra chorizo. Asimismo, en el
proceso se aislaron en 18 muestras otras
enterobacterias, como Citrobacter freundii,
Edwardsiella tarda, Escherichia coli y
Pantotea agglomerans.
En este trabajo también se realizó la prueba de
susceptibilidad antimicrobiana, y se encontró
que un aislamiento de Salmonella entérica fue
sensible a la Ciprofloxacina y Ceftriaxona (30).
bacterias gran negativas (Col.) 2016; 32 (1): 105-122
 CUESTIONARIO.
Tinción de Gram
← ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram? R/
I: Edad de la bacteria.
18. Errores del operador.
III: Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de
bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglucano y teñirse como Gram
negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr
el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas),Es por esta situación
que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias Gram positivas (ej. S. aureus) y
Gram negativas (ej. E. Coli).
2 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de Gram?
R/
COLORANTES
Cristal violeta
El cristal violeta es básico (se une a componentes celulares de carga negativa).
Atraviesa la PARED celular y se acumula en el citoplasma.

La pared de Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína más delgada,
a través de la cual el alcohol extrae el cristal violeta de estas células.

Cuando se añade etanol a una mezcla de células Gram positivas y Gram negativas
teñidas con cristal violeta, las células Gram positivas quedan teñidas de violeta.

DECOLORACION
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o
entre partes de una misma célula.

DIFERENCIACION
todas las células sin pared (como las animales) pierden fácilmente el cristal
violeta (se verán de color rosa).
Todas las células con pared gruesa (como las de hongos) se verán de color
violeta. La correlación entre el color y el tipo de pared solo tiene sentido con
células bacterianas.

1 CRISTAL VIOLETA
2 LUGOL
 3 ALCOHOL ACETONA
4 SAFRANINA

Los colorantes se estandarizan en tiempo

1-E-1-E-15-E-30

Para facilitar la diferenciación se mezcla lugol con cristal violeta: el complejo

cristal- violeta-lugol precipita. Así el lugol dificulta la salida del cristal violeta de
ambos tipos de células, pero es más fácil de extraerlo de las Gram negativas que
de las Gram positivas.

3.¿Porque las bacterias Gram negativas se tiñen de rosado a diferencia de las

Gram positivas (morado) siendo el procedimiento de tinción el mismo?

R/ El distinto comportamiento en la tinción de Gram, se piensa que es debido a las

diferentes capas superficiales o paredes de las bacterias (tipo de célula).
Esto se debe a la diferencia en su pared celular y básicamente hay dos causas
diferentes:
1.A la cantidad de fosfolipidos que tienen las Gram negativas es mayor que las gran
positivas.
2.A los peptidoglicanos, que es mayor en las Gram positivas que en las Gram
negativas.

4.Investiga. Además del calor que otros métodos de fijación pueden ser usados para
tinciones diferenciales
R/ Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras
que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares
originales e impidiendo su degradación.
Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en la solución
fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de sangre o cortes por congelación
sin fijación previa
La congelación rápida es un buen método de preservación de las características
moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La
congelación es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de
grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Por ello es
conveniente no usar piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la congelación de
las zonas centrales de la pieza.

5. ¿Cuál es la función del lugol en la técnica anterior?

R/ La función del yodo- lugol, funciona como fijación de la preparación, y también
actúa sobre la pared de las bacterias Gram (+) de tal manera que al agregar el
 decolorante (alcohol-cetona) no se destiñan las bacterias que se tiñeron, al agregar la
Safranina, las restantes bacterias se teñirán, siendo estas últimas Gram (-).
Tinciones selectivas: tinción de capsula.
1. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la practica
R/ La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin
teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad
por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que
es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble
en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la
microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de
las células bacterianas.
2. ¿Qué tipo de información se obtiene?
R/ En el microscopio se observa el fondo café y los microorganismos con capsula sin
color.

3. Que otra técnica de tinción selectiva permite observar estas estructuras bacterianas R/
Tinción de Ziehl-Neelsen
Tinción de ácido alcohol resistencia
Tinción de endosporas
Tinción de flagelos
Tinción de estructuras específicas
4. Realiza una lista de bacterias que sinteticen capsulas.
R/ Klebsiella
Treponema pallidum
Cryptococcus neoformans
S. pneumoniae.
CONCLUSIONES

En esta práctica aprendimos las diferencias En el grupo de bacterias Gram negativas

entre una bacteria gran positiva y una bacteria incluido en la Clase de las γ-Proteobacterias,
gran negativa ya que con ayuda de la tinción se Orden Pseudomonadales y Familia
pueden observar ciertos factores que son Moraxellaceae, se han estudiado 11
distintivos como por ejemplo su color ya que aislamientos pertenecientes al género
Psychrobacter. Dos de ellos son especies
unas se tiñen de color morado o violeta
nuevas, Psychrobacter
(positiva) y otras de color rosado (negativo) en
este caso se observaron estafilococos negativos
por su agrupación en racimos y basilos
positivos por su forma de varilla pero al igual
pueden haber estafilococos positivos o basilos
negativos esto dependiendo de las bacterias que
se trate

Bacterias gran positivas y gran negativas (Col.) 2016; 32 (1): 105-122 115
 Bacterias gran positivas y gran negativas 23-21

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